超高壓處理對冷卻牛肉色澤穩定性的影響

王　璐，韓衍青，楊伯冰，李興民，徐寶才，戴瑞彤，*（.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京00083；.肉品加工與質量控制國家重點實驗室，江蘇雨潤肉類產業集團有限公司，江蘇南京004）

超高壓處理對冷卻牛肉色澤穩定性的影響

王璐1，韓衍青2，楊伯冰1，李興民1，徐寶才2，戴瑞彤1，*
（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083；2.肉品加工與質量控制國家重點實驗室，江蘇雨潤肉類產業集團有限公司，江蘇南京210041）

選取牛肉半腱肌為原料，研究室溫條件下，常壓以及200、400、600MPa超高壓處理10min對牛肉色澤穩定性的影響，測定色差值、肌紅蛋白含量、高鐵肌紅蛋白還原酶活性（MRA）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）含量、耗氧率（OCR）等指標。結果表明：高壓處理后牛肉的L*值升高，a*、b*值降低，OCR降低。MRA在400MPa左右達到最高，削弱高鐵肌紅蛋白（MetMb）的積累，NADH含量與MRA相關。貯藏期間，各組MRA、NADH含量均降低，但高壓處理組比對照組MetMb積累速度慢，說明高壓處理雖然可使肉色變淺，但貯藏期間肉色穩定性提高。

超高壓，肌紅蛋白含量，高鐵肌紅蛋白還原酶活性，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸含量，耗氧率

超高壓技術（high pressure processing，HPP）是指將食品原料包裝后，密封于超高壓容器中，以流動介質作為傳壓媒介，在高靜壓（通常為100～1000MPa）下加工一定時間，引起生物體高分子成分中的非共價鍵（氫鍵、離子鍵和疏水鍵等）的破壞或形成，并殺死食品中的微生物，從而達到食品滅菌、保藏和加工目的的一種方法。

顏色是肉制品最重要的指標之一，是消費者判斷肉質的標準。放血充分的肌肉中，肌紅蛋白是色素物質的主要成分，肌紅蛋白3種形式脫氧肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白和高鐵肌紅蛋白之間的轉化賦予了肌肉不同的色調。普遍認為肉色的褐變是鮮紅色的氧合肌紅蛋白自動氧化生成暗褐色的高鐵肌紅蛋白所造成的，而肌細胞內部的高鐵肌紅蛋白還原酶可以將高鐵肌紅蛋白還原為肌紅蛋白，從而穩定肉色。在一定條件下，超高壓處理會對肉類顏色產生影響。馬漢軍等［1］研究發現，隨著處理壓力升高，牛肉L*增加，a*下降，b*基本不變；壓力高于400MPa時L*保持穩定，a*下降速度減緩；高壓處理使肌紅蛋白總量降低，高鐵肌紅蛋白的比例在400MPa以上顯著增加。Kathrine等［2］也有研究表明，300MPa以上壓力處理豬背最長肌，a*顯著下降，b*顯著增加。鯉魚和金槍魚的研究中也得到類似結論［3］。超高壓處理對肉色的影響是一個復雜的現象，還有待于進一步研究。目前對肉色的研究大多關注于色差值和肌紅蛋白含量的變化，而高鐵肌紅蛋白還原酶系統對肉色的影響研究并不多。

本文主要研究了超高壓處理后，牛肉色差值、肌紅蛋白含量、高鐵肌紅蛋白還原酶活力、NADH含量、肌肉呼吸耗氧率等指標的變化，以探討超高壓處理對肉色穩定性的影響。尤其從高鐵肌紅蛋白還原酶系統方面進行分析整合，旨為后續相關性研究提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

牛肉半腱肌北京金五星交易市場；馬心肌紅蛋白美國Sigma公司；NADH、噻脞藍、N-甲基-吩嗪甲基硫酸鹽、乙醇脫氫酶、Tris北京索萊寶科技有限公司；其他試劑北京藍弋試劑公司，均為分析純。

HPP/15L/600MPa超高壓設備包頭科發高壓科技有限責任公司；CR400色差儀日本柯尼卡—美能達公司；Evolution 60S紫外可見分光光度計北京益明德科技有限公司；TGL20M臺式高速冷凍離心機鹽城市凱特實驗儀器有限公司；OXYGRAPH液相氧電極英國漢莎（Hansatech）公司。

1.2實驗方法

1.2.1肉樣的處理取新鮮牛肉半腱肌，去除可見脂肪和結締組織，然后切分成厚1cm、約100g的肉塊。將樣品真空包裝后置于壓力處理釜中，設置200、400、600MPa三組壓力處理，壓力上升到設定目標后保壓10min，施壓環境為室溫。高壓處理樣品與常壓對照組均置于4℃冰箱中儲存以備用，并考察其在1～5d貯藏期的變化。

1.2.2色差值的測定用色差儀直接測量樣品亮度值L*、紅度值a*、黃度值b*。

1.2.3肌紅蛋白含量的測定按參考文獻Tang［4］介紹的方法，略有改動。取5g肉樣，加入25mL 0.04mol/L，pH6.8的磷酸鹽緩沖液。室溫下，10800r/min均質25s。置均質液于冰浴中1h，然后在8000r/min，4℃下離心15min，上清液用濾紙過濾。反應體系在分光光度計上掃描，波長分別為：582、557、525、503nm。脫氧肌紅蛋白［DeoMb］、氧合肌紅蛋白［OxyMb］和高鐵肌紅蛋白［MetMb］含量（單位%）的計算公式如下：

其中，R1=A582/A525，R2=A557/A525，R3=A503/A525；A582、A557、A525、A503分別表示在582、557、525、503nm下的吸光值。

1.2.4高鐵肌紅蛋白還原酶活力（MRA）測定

1.2.4.1MetMb及樣品中粗酶液的提取參考Mikkelsen［5］介紹的方法。

1.2.4.2還原性測定按表1配制標準反應混合物，反應溫度25℃，空白對照以水代替NADH，其他組分不變。反應由加入NADH起始，記錄580nm下吸光值。MetMb還原酶活力用每毫升提取液在1min內在580nm下吸光值變化來表示。

表1　高鐵肌紅蛋白還原酶活力測定的標準反應混合物Table 1　Reaction substances of metmyoglobin reductase activity

1.2.5煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）含量測定參考孫京新［6］的方法，測定570nm處的吸光度，結果表示為nmol/g樣品。

1.2.6耗氧率（OCR）測定依據Kaplan［7］的方法，使用OXYGRAPH液相氧電極進行耗氧率的測定。

1.2.7數據處理與分析每個實驗三個平行，采用SPSS 17.0數據分析軟件對各指標進行單因素方差分析。計算標準偏差（±SE）并進行差異顯著性分析。

2　結果與討論

表2　超高壓處理對牛肉L*值的影響Table 2　The influence of high pressure process on L*value of beef

2.1超高壓處理對牛肉色差值的影響

由表2知，隨著壓力增加，牛肉L*值升高，壓力處理組顯著高于對照組（p＜0.05）。這與大部分學者的研究結果一致［8-9］。隨著貯藏天數增加，各組L*值均呈遞增趨勢，且隨著壓力增加，貯藏期間上升趨勢變緩。

L*值增加可能是由于高壓作用下肌紅蛋白中的球蛋白變性或者亞鐵血紅素被取代或失去所造成的。另外，L*值的上升與肉的系水力降低有關，由于處理壓力升高，肉樣表面纖維結構更加疏松、汁液溶出量增加，水分附著在肉表面使肉的L*值增加［9］。

表3　超高壓處理對牛肉a*值的影響Table 3　The influence of high pressure process on a*value of beef

由表3知，隨著壓力升高，牛肉的a*呈遞減趨勢，壓力處理組之間差異顯著（p＜0.05）。貯藏期間，各組a*均隨時間呈下降趨勢，這可能是MetMb隨著時間積累的效果。5d內壓力組a*值的降低顯著低于對照組。

高壓處理后a*的降低可能是由于亞鐵肌紅蛋白氧化而變成MetMb造成的［10］。Choi等［11］認為a*下降的原因是肌漿蛋白中的磷酸化酶b、肌酸激酶、磷酸丙糖異構酶和一種未知蛋白變性對肉的a*起到遮掩作用，因此影響了肉的a*和L*。Pinero等［12］研究發現在牛肉餅中添加適量β-葡聚糖可以抑制顏色變化。

表4為超高壓處理對牛肉b*值的影響，隨著壓力升高，牛肉的b*值有降低的趨勢，這種趨勢在前2d并不明顯，第3d以后，400MPa與600MPa與對照組相比b*顯著降低（p＜0.05）。貯藏期間，b*的變化是波動的，但各組第5d的b*都比第1d要顯著增加。

表4　超高壓處理對牛肉b*值的影響Table 4　The influence of high pressure process on b*value of beef

現有研究中，也有發現b*值隨著壓力的作用而呈降低的趨勢。Beltran等［13］將超高壓作用于剁碎的雞腿肉中觀察到a*和b*值降低。李宗軍等［14］發現，壓力處理可引起豬肉餅L*、a*和b*值的變化，變化幅度與加壓溫度有關。

2.2超高壓處理對牛肉肌紅蛋白含量的影響

表5～表7分別是超高壓處理對牛肉三種肌紅蛋白含量的影響。由表可知，壓力增加，MetMb含量先降低后升高，在400MPa時轉折得到較低值。而OxyMb的變化正好與MetMb相反。DeoxyMb含量隨著壓力變化是波動的，無明顯規律。

表5　超高壓處理對牛肉MetMb含量的影響（%）Table 5　The influence of high pressure process on OxyMb of beef（%）

表6　超高壓處理對牛肉OxyMb含量的影響（%）Table 6　The influence of high pressure process on OxyMb of beef（%）

表7　超高壓處理對牛肉DeoxyMb含量的影響（%）Table 7　The influence of high pressure process on DeoxyMb of beef（%）

MetMb含量隨著時間逐漸增加，MetMb的積累是由OxyMb不斷氧化和高鐵肌紅蛋白還原酶系統對MetMb的還原共同作用的結果。分析5d內MetMb增加量發現，三個高壓處理組相比對照組MetMb積累速度慢，貯藏期間顏色穩定性高于對照組，說明高壓處理可以提高肉色穩定性。

適當的低壓處理可以激活高鐵肌紅蛋白還原酶系統，還原已經形成的MetMb，而當壓力過高時，則會破壞還原酶系統，還原反應也被抑制，從而使MetMb比例增加。Carlez等［15］報道在200～500MPa壓力下，總的可提取的肌紅蛋白下降，而MetMb在400～500MPa顯著增加。

雖然高壓處理生牛肉色澤有明顯變化，但對熟牛肉制品色澤影響卻很小，可能由于煮制過程中，肌紅蛋白變成了亞硝基肌紅蛋白，而這種蛋白不受壓力和其他蛋白質凝膠的影響［16］，若壓力處理前，采用NaNO2和NaCl對生肉進行腌制，所形成的亞硝基肌紅蛋白對壓力很穩定，就可以對色澤起到保護作用。

表8　超高壓處理對牛肉高鐵肌紅蛋白還原酶活力的影響（nmolMMb reduced/min）Table 8　The influence of high pressure process on MRA of beef（nmolMMb reduced/min）

2.3超高壓處理對牛肉高鐵肌紅蛋白還原酶活力（MRA）的影響

由表8知，隨著壓力升高，牛肉MRA值先升高而后迅速降低，各組之間差異顯著（p＜0.05），且在400MPa左右出現轉折點，得到最大值。多數研究表明，壓力對酶活的影響主要分兩個階段：在較低壓力下，酶活性中心凝聚，酶和基質的隔離狀態被打破，酶和基質充分接觸，酶活性上升；在較高壓力下，酶蛋白的疏水鍵和離子鍵因體積縮小而斷裂，酶的三級結構被破壞，活性中心喪失，酶活性下降。因此，推測在400MPa左右存在一個最適壓力使高鐵肌紅蛋白還原酶活性達到最高。

貯藏期間，各組MRA都逐漸降低。一方面由于高鐵肌紅蛋白還原反應中的電子傳遞體和供體的減少，另一方面由于本實驗測定MRA時添加了外源性NADH，MRA的降低很可能是冷藏期間高鐵肌紅蛋白還原酶變性引起的。

高鐵肌紅蛋白還原酶是高鐵肌紅蛋白還原酶系統中的關鍵酶，在NADH存在下，它可以有效地將MetMb（Fe3+）還原成二價（Fe2+）狀態。高鐵肌紅蛋白還原酶活力是阻止MetMb積累的控制因子，高MRA可提高肉色穩定性。研究表明，色澤越穩定的肌肉，積累的MetMb量越少，這很可能是高鐵肌紅蛋白還原酶作用的結果。而在本實驗中，MetMb含量和MRA的變化趨勢剛好相反，體現了很好的負相關性，與前人報道的結果相符合。

表9　超高壓處理對牛肉NADH含量的影響（nmol/g樣品）Table 9　The influence of high pressure process on NADH of beef（nmol/g sample）

2.4超高壓處理對牛肉NADH含量的影響

由表9知，加壓過程中，NADH含量的變化趨勢大體是先升高后回降，在400MPa左右出現拐點。這與MRA的變化是相對應的。在肌肉環境中，NADH是高鐵肌紅蛋白還原反應中的電子傳遞體和供體，NADH濃度與MRA活性呈極顯著正相關性［17］。在貯藏過程中，各組的NADH含量隨時間逐漸降低。

影響肉色的一個關鍵因素就是MetMb的還原，這需要NADH的協助。在一定程度上，它也制約了肉本身色素蛋白的還原能力，因為NADH含量很小而且其再生機制比較復雜，Bekhit等［18］研究表明NADH含量在穩定牛肉顏色以及高鐵肌紅蛋白酶還原活性上起到了很大作用。高鐵肌紅蛋白還原酶還原MetMb是依賴NADH存在的，然而NADH在宰后肉中含量是逐漸降低的，宰后7d很難再檢測到NADH，因此宰后肉中MRA仍然保持一定水平，但肉色穩定性卻難以維持。此外，一些研究還表明，乳酸脫氫酶與宰后NADH再生、MetMb的還原相關。這種機制是通過宰后注射乳酸鹽產生的乳酸脫氫酶轉化為丙酮酸鹽和NADH，從而提高高鐵肌紅蛋白酶還原能力來實現的。

2.5超高壓處理對牛肉耗氧率（OCR）的影響

由表10知，壓力升高，耗氧率降低。這可能是由于在高壓的擠壓作用下，降低了肌肉組織間的氧分壓。隨著貯藏時間延長，各組耗氧率都呈持續下降趨勢。三個高壓處理組之間在第1d有差異顯著，第2d開始200MPa與400MPa之間已無顯著變化，第4d時三組均無顯著差異。比較5d內耗氧率降低量可知，高壓處理后能適當延緩貯藏期間耗氧率的降低。

耗氧率表征呼吸強度，呼吸代謝更強的肌肉耗氧率更高，呼吸強度高的肉顏色穩定性越差。耗氧率與MetMb積累速度呈顯著正相關［19］；線粒體活性高，呼吸耗氧上升，進而降低了氧分壓，促使DeoMb生成和積累，DeoMb穩定性差，更易被氧化成MetMb，使肉色變褐。

表10　超高壓處理對牛肉耗氧率（OCR）的影響（nmol/（g meat·min））Table 10　The influence of high pressure process on OCR of beef（nmol/（g meat·min））

3　結論

牛肉經高壓處理后，顏色淡化并變白，產生不利影響。壓力增加，牛肉L*值升高，a*、b*值、OCR降低。MRA在400MPa左右達到最高，削弱MetMb積累。貯藏期間，高壓處理組相比對照組MetMb積累速度慢，說明高壓處理雖然使肉色變淺，但處理后貯藏期間肉色穩定性提高。因此后續生產應用中可在200～400MPa之間選取一個適宜壓力，獲取較高MRA，以保持牛肉較好的色澤，并抑制貯藏期間MetMb的積累。

［1］馬漢軍，周光宏.高壓處理對牛肉肌紅蛋白及顏色變化的影響［J］.食品科學，2004，25（12）：36-39.

［2］Kathrine H B，Gunilla L，Anders H K，et al.Effect of high pressure，temperature，and storage on the color of porcine longissimus dorsi［J］.Meat Science，2012，92（4）：374-381.

［3］Gomez E J，Lopez M E，Gomez M C，et al.High pressure technology as a tool to obtain high quality carpaccio and carpaccio-like products from fish［J］.Innovative Food Science and Emerging Technologies，2009（10）：148-154.

［4］Tang J，Faustman C，Hoagland T A.Krzywicki revisited：equations for spectrophotometri determination of myoglobin redox forms in aqueous meat extracts［J］.Food Chemistry and Toxicology，2004，69：717-720.

［5］Mikkelsen A，Juncher D，Skibsted L H.Metmyoglobin reductase activity in porcine longissimus dorsi muscle［J］.Meat Science，1999，51（2）：155-161.

［6］孫京新.冷卻豬肉肉色質量分析與評定及肉色穩定性研究［D］.南京：南京農業大學，2004.

［7］Kaplan B A.Metmyoglobin oxidation during electron transport reactions in mitochondria.Journal of General Physiology［J］. 1965，48（4）：685-698.

［8］Omana D A，Plastow G.Effect of different ingredients on color and oxidative characteristics of high pressure processed chicken breast meat with special emphasis on use of β-glucan as a partialsalt replacer［J］.Innovative Food Science and Emerging Technologies，2011，12：244-254.

［9］Canto A.Effect of high hydrostatic pressure on the color and texture parameters of refrigerated Caiman（Caiman crocodiles yacare）tail meat［J］.Meat Science，2012，91：255-260.

［10］Cava R，Ladero L，Gonzalez S，et al.Effect of pressure and holding time on color，protein and lipid oxidation of sliced drycuredIberianhamandloinduringrefrigeratedstorage［J］. Innovative Food Science and Emerging Technologies，2009，10：76-81.

［11］Choi Y M，Ryu Y C，Lee S H，et al.Effects of supercritical carbon dioxide treatment for sterilization purpose on meat quality ofporcinelongissimusdorsimuscle［J］.FoodScienceand Technology，2008，41（2）：317-322.

［12］Pinero M P，Parra K，Huerta L N，et al.Effect of oat’s soluble fibre（β-glucan）as a fat replacer on physical，chemical，microbiological and sensory properties of low-fat beef patties［J］. Meat Science，2008，80（3）：675-680.

［13］Beltran E，Pla R，Capellas M，et al.Lipid oxidation and color in pressure-and heat-treated minced chickenthighs［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture，2004，84：1285-1289.

［14］李宗軍，李羅明.高靜壓結合熱處理對肉品中微生物存活性的影響［J］.食品與發酵工業，2005，31（4）：134-136.

［15］Carlez A，Veciana N T，Cheftel J C.Changes in color and myoglobin of minced beef meat due to high pressure processing［J］.Lebensmittel-Wissenschaftund Technologies，1995，28：528-538.

［16］Mormur M，Yuste J.High pressure processing applied to cooked sausage manufacture：Physical properties and sensory analysis［J］.Meat Science，2003，65（3）：1187-1191.

［17］陳景宜，牛力，黃明，等.影響牛肉肉色穩定性的主要生化因子［J］.中國農業科學，2012，45（16）：3363-3372.

［18］Bekhit A E D，Geesink G H，Ilian M A，et al.The effects of natural antioxidants on oxidative processes and metmyoglobin reducing activity in beef patties［J］.Food Chemistry，2003，81（2）：175-187.

［19］Renerre M，Labas R.Biochemical factors influencing metmyoglobin formation in beef muscles［J］.Meat Science，1987，19（2）：151-165.

［20］張巧娜，楊紅菊，高曉光，等.高密度二氧化碳對牛背最長肌顏色穩定性的影響［J］.食品工業科技，2013（20）：344-348.

［21］王永林，趙建生.高鐵肌紅蛋白還原酶活力與肉色穩定性關系的研究［J］.肉類研究，2010（3）：21-25.

［22］謝麗，高曉光，苗敬，等.牛不同部位肌肉高鐵肌紅蛋白還原酶活力及耗氧率對肉色穩定性的影響［J］.食品工業科技，2012（16）：342-346.

［23］Kathrine H B，Gunilla L，Anders H K，et al.High pressure effect on the color of minced cured restructured ham at different levels of drying，pH，and NaCl［J］.Meat Science，2012，90：690-696.

［24］Alberto G，Jakob S J，Christian K，et al.Synergistic cooperation of high pressure and carrot dietary fibre on texture and color of pork sausages［J］.Meat Science，2011，89：195-201.

［25］Bajo B，Tomas B，Volker H.Quality considerations with high pressure processing of fresh and value added meat products［J］. Meat Science，2012，92：280-289.

［26］向丹.不同理化因素對豬肉肌紅蛋白穩定性的影響研究［D］.重慶：西南大學，2010.

［27］袁先群.肉類色澤變化機理研究進展［J］.肉類研究，2010（9）：6-12.

［28］Hainer V，Uwe K，Filip T，et al.Structural changes of myoglobin in pressure-treated pork meat probed by resonance Raman spectroscopy［J］.Meat Science，2009，115：1194-1198.

Effect of high pressure processing treatment on beef color stability

WANG Lu1，HAN Yan-qing2，YANG Bo-bing1，LI Xing-min1，XU Bao-cai2，DAI Rui-tong1，*
（1.College of Science and Nutrition Engineering，China Agriculture University，Beijing 100083，China；2.State Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control，Jiangsu Yurun Meat Group Co.，Ltd.，Nanjing 210041，China）

Beef emitendinous muscle was used as material in this experiment，different pressures of HPP（0，200，400，600MPa）10min on beef color stability were analyzed.The results of beef color，myoglobin，Metmyoglobin reducing activity（MRA），NADH and oxygen consumption rate（OCR）showed as follows：as the pressure increased，L*value of beef increased，a*and b*value decreased，OCR was reduced.400MPa group had the highest MRA and slowest rate of MetMb accumulation comparing with other groups，NADH level was associated with the MRA.During storage，MRA，NADH content were gradually decreased in both control and HPP-treated groups，but the rate of MetMb accumulation in HPP-treated groups were slower than that of the control group，indicating that the HPP treatment could improve color stability.

HPP；myoglobin；MRA；the content of NADH；OCR

TS251.52

A

1002-0306（2015）02-0138-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.022

2014－05－07

王璐（1991-），女，碩士研究生，研究方向：肉制品貯藏保鮮理論與技術。

戴瑞彤（1966-），女，博士研究生，副教授，研究方向：肉品的貯藏保鮮技術研究。

科技部十二五科研項目（2012BAD28B02）。