添加劑和光照對合浦珠母貝肉酶解液抗氧化活性的影響

吳燕燕，王　晶，2，李來好，楊賢慶，胡　曉，周婉君（.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東廣州50300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海20306）

添加劑和光照對合浦珠母貝肉酶解液抗氧化活性的影響

吳燕燕1，王晶1，2，李來好1，楊賢慶1，胡曉1，周婉君1
（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東廣州510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

為了探明合浦珠母貝（Pinctada fucata）肉抗氧化肽在應(yīng)用中是否受到食品添加劑和光照的影響，文章以清除DPPH·、·OH和等自由基的能力以及可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)（SPC）為指標(biāo)，測定合浦珠母貝肉酶解液的抗氧化穩(wěn)定性受食品輔料（NaCl、蔗糖和葡萄糖）、不同濃度防腐劑（苯甲酸鈉和山梨酸鉀）、金屬離子（K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+和Cu2+）等添加劑以及光照的影響。結(jié)果表明：NaCl（0.5%～4.0%）和蔗糖（2.0%～10.0%）對合浦珠母貝肉酶解液抗氧化性影響并不顯著，長時間保存，葡萄糖的影響較大；防腐劑對其抗氧化活性和SPC也有一定的影響，0.6%的山梨酸鉀和0.4%的苯甲酸鈉有益于其保存，且苯甲酸鈉的作用效果大于山梨酸鉀；K+、Ca2+、Mg2+對其清除自由基的能力影響較小，而Cu2+的影響最大，0.05mg·mL-1以上濃度的Cu2+和光照都會降低其抗氧化能力。

合浦珠母貝肉，抗氧化肽，食品添加劑，光照，抗氧化穩(wěn)定性

活性肽在蛋白鏈中并不表現(xiàn)出相應(yīng)的活性，只有經(jīng)過專一的蛋白酶酶切釋放后，形成的肽片段才能發(fā)揮其功能活性。天然抗氧化肽一方面能夠清除·OH、和DPPH·等氧化自由基，另一方面具有抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)并螯合金屬離子抑制自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的效應(yīng)［1］，從而能夠積極作用于身體機能。而且，抗氧化肽不僅具有良好的溶解性和熱穩(wěn)定性等理化性質(zhì)，而且具有人工合成抗氧化劑無可比擬的強抗氧化能力和安全性［2-3］。然而，酶法制備的抗氧化肽是一種混合的粗提物，其中包括的肽片段抗氧化活性強弱不一［4］，在應(yīng)用過程中會受到外界因素的影響，需要研究其穩(wěn)定性的變化，以更好地對天然抗氧化肽開發(fā)利用［5-6］。目前，國內(nèi)外對抗氧化肽的提取純化研究較多，例如Je等［7］酶解多區(qū)域的深海鱈魚骨架制備抗氧化肽酶解物；Wu等［8］研究了鯖魚酶解制備抗氧化肽在1400u的抗氧化性高；王晶等［9］和石麗梅等［10］利用堿性蛋白酶對玉米蛋白酶解制備抗氧化肽，并分別討論了其在熟肉糜中和中式香腸的應(yīng)用。但是關(guān)于其穩(wěn)定性的研究反而不全面。

本文利用微波輔助蛋白酶水解合浦珠母貝（Pinctada fucata）肉，經(jīng)過脫鹽，研究其酶解液受食品輔料、防腐劑、金屬離子等添加劑以及光照的影響，追蹤其抗氧化活性的變化，從而闡述其穩(wěn)定性，以期對其在醫(yī)藥、食品以及化妝品行業(yè)［11-12］中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備

合浦珠母貝海南養(yǎng)殖基地；DPPH（CAS：1898-66-4，AR） 美國Sigma公司；鄰苯三酚、鄰二氮菲、十二烷基磺酸鈉（SDS）、三羥甲基氨基甲烷、鐵氰化鉀、蔗糖、葡萄糖、山梨酸鉀、苯甲酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鋅、氯化鈉和硫酸銅等均為分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠。

DS-1高速組織搗碎機上海標(biāo)本模型廠；DKS24恒溫水浴鍋上海森信實驗儀器廠有限公司；3K30高速冷凍離心機德國Sigma公司；MAS-Ⅱ微波儀上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；Delta320精密pH計梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；CHAIST真空冷凍干燥機博勱行儀器有限公司；AKTA purifier100GE公司；MILLIPORE超濾裝置廣州東銳科技有限公司；UV-3000PC紫外分光光度計上海美譜達公司；METER SUNRISE酶標(biāo)儀奧地利TECAN公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品的制備酶解液中抗氧化肽的活性與蛋白質(zhì)的含量，其中的氨基酸種類以及肽段的分子量大小有著緊密的聯(lián)系，合浦珠母貝肉抗氧化肽（Antioxidant peptides），記為AOP，是由本實驗室自制［13］得到的產(chǎn)品，經(jīng)過前期的實驗基礎(chǔ)選取過0.2μm濾膜的酶解液，冷凍干燥得到的產(chǎn)品作為本實驗的樣品。

1.2.2合浦珠母貝肉酶解液產(chǎn)物對DPPH自由基清除能力的測定參考Rajapakse N等對DPPH清除率的測定方法，稍作修改［14］：

表1DPPH自由基清除能力的測定Table 1　The determination of DPPH radicalscavenging activity

按照表1操作的各組實驗品，在混勻后在室溫下避光反應(yīng)20min，10000r/min離心10min，517nm比色，并以等體積去離子水和無水乙醇混合液空白調(diào)零。DPPH自由基清除率的公式計算如下：

式中：A0—對照組吸光值；Ai—樣品組吸光值；Aj—空白組吸光值。

1.2.3AOP對·OH清除能力的測定參考Fenton反應(yīng)體系模型，利用H2O2與Fe2＋混合可以生產(chǎn)·OH的原理，加入水楊酸捕捉·OH產(chǎn)生的有色物質(zhì)在510nm處有強吸收［15］。具體操作如下：

表2　·OH清除能力測定Table 2　The edetermination of OH radicalscavenging activity

按照表2中要求操作后，在37℃下反應(yīng)30min，510nm比色以等體積去離子水和無水乙醇混合液空白調(diào)零。清除率（%）計算如下：

式中：A0—對照組吸光值；Ai—樣品組吸光值；Aj—空白組吸光值。

1.2.4AOP對O2-·清除能力的測定參考吳燕燕等［16-17］的方法測定：取樣品0.2mL加入Tris-HCl緩沖溶液5mL，操作如表3所示。

表3　超氧陰離子清除能力測定Table 3　The determination of O2-radical scavenging activity

按照表3中的步驟處理樣品后，在325nm每30s讀數(shù)一次，5min后結(jié)束以等體積去離子水和Tris-HCl緩沖液混合液空白調(diào)零。

按下式計算樣品對超氧陰離子的抑制率：

式中：V對照—對照組鄰苯三酚自氧化速率（ΔA/ min）；V樣品—樣品組鄰苯三酚自氧化速率（ΔA/min）。1.2.5可溶性蛋白的質(zhì)量分數(shù)（SPC）測定考馬斯亮藍G-250在稀酸環(huán)境中與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合，最大吸收由465nm變?yōu)?95nm，由紅色變?yōu)榍嗌Ｔ谝欢ǖ鞍踪|(zhì)濃度范圍內(nèi)（1～100μg），取上清液加入考馬斯亮藍G-250色素，其結(jié)合物在595nm波長下的光吸收，并以牛血清作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線［18］，按照此法確定上清液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量。樣品的總氮可參照凱氏定氮法，按照以下公式計算可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)：

式中：A為上層清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg；B為樣品總蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg。

1.2.6合浦珠母貝肉酶解液產(chǎn)物穩(wěn)定性影響因素實驗在日常的加工過程中，加工的樣品會在各道工序中被添加不同的添加劑，根據(jù)需要會添加限制劑量的食品輔料、防腐劑和金屬離子等，本實驗根據(jù)已報道的多篇抗氧化性穩(wěn)定性文獻確定了較寬泛的添加劑量，以確定對樣品影響一切可能性和趨勢。

1.2.6.1食品輔料的影響配制脫鹽后肽液的濃度為10mg·mL-1，分別添加等體積不同質(zhì)量分數(shù)NaCl、蔗糖和葡萄糖的溶液，保存在4℃下測定其活性和可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)。

1.2.6.2防腐劑的影響配制脫鹽后肽液濃度10mg·mL-1，分別添加不同質(zhì)量分數(shù)等體積的山梨酸鉀和苯甲酸鈉溶液，質(zhì)量濃度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1%，保存在4℃下測定其活性和可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)。

1.2.6.3金屬離子的影響不同添加量的金屬離子會對其有不同的影響，本實驗分別配制脫鹽酶解物濃度為10mg·mL-1，分別添加不同質(zhì)量分數(shù)等體積的K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+金屬離子的溶液，質(zhì)量濃度為0.005、0.01、0.050、0.50、50mg·mL-1，保存在4℃下測定其DPPH·清除率、·OH清除率和可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)。

1.2.6.4光照的影響配制脫鹽酶解物濃度為10mg·mL-1，在室溫條件下設(shè)立有日光燈照射的光照組和避光組，并在其保存時間的第1、3、5、10、30d取樣測定指標(biāo)。

1.3統(tǒng)計分析

每個處理重復(fù)3次平行，部分數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 17.0方差分析。結(jié)果表示為x±s，當(dāng)p＜0.05時為有差異顯著性。

2　結(jié)果與分析

2.1不同濃度NaCl對AOP的影響

表4是不同質(zhì)量濃度的NaCl對AOP的抗氧化活性以及SPC的跟蹤測試結(jié)果。由表4可知，NaCl的濃度隨著時間延長，每次抽樣測得的活性指標(biāo)和SPC變化沒有規(guī)律可循，即對其活性和SPC并沒有太大的影響，多重比較分析結(jié)果在前5d各指標(biāo)的對比并不顯著，后期隨著時間SPC的變化較顯著，不同濃度間并無明顯變化，由此可知其影響較小，在加工中可以根據(jù)需要加入該食品輔料。此現(xiàn)象表明，NaCl基本不影響AOP的活性，隨著5d之后時間的推移，不同濃度間變化小，而與前期相比變化增大，可能是貯藏期限對其活性影響的結(jié)果。

表4　不同濃度NaCl對AOP自由基清除率和可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)的影響Table 4　Effect of NaCl concentration on free radicals scavenging capacity and soluble protein content of the rude product

表5　不同蔗糖濃度對AOP自由基清除率和可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)的影響Table 5　Effect of sucrose concentration on free radicals scavenging capacity and soluble protein content of the rude product

2.2糖的影響

2.2.1蔗糖的影響從表5中可以看出，隨著時間推移，樣品對O2-·、DPPH·和·OH的清除能力逐漸降低，可溶性蛋白的量也在減少，后期出現(xiàn)大量的不溶固形物，離心取上清液測定以上指標(biāo)時呈現(xiàn)懸濁狀態(tài)，因而后期測算的標(biāo)準(zhǔn)偏差也較大。在前5d的時候，雖然大體也是呈現(xiàn)下降趨勢，但是可以發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度大則不利于其短期內(nèi)活性的保持。5d以后，不同質(zhì)量濃度的蔗糖則幾乎沒有影響，與趙謀明等［19］對藍園鲹抗氧化肽穩(wěn)定性的研究結(jié)果一致。

2.2.2不同葡萄糖濃度的影響從表6中可以看出，葡萄糖的濃度增大，DPPH自由基和·OH的清除率有顯著差異，說明其抗氧化能力隨濃度變化而降低，且前5d的SPC基本不變。隨著時間延長，SPC降低，清除自由基的能力均下降。造成該現(xiàn)象的原因，一方面是因為貯藏時間的緣故，另一方面前期的活性變化要進一步的深入研究。由此可見，葡萄糖不利于此抗氧化產(chǎn)物的活性保持，因此在應(yīng)用時不宜和葡萄糖同時使用。

2.3防腐劑的影響

不同質(zhì)量濃度的防腐劑山梨酸鉀和苯甲酸鈉，在保存期間跟蹤測試其抗氧化活性和SPC，結(jié)果分別見表7和表8。在表7中，在實驗濃度范圍內(nèi)，隨著山梨酸鉀濃度的增加，結(jié)合抗氧化能力和SPC可以看出，5d之前沒有明顯的變化，5d之后0.6%的山梨酸鉀有利于脫鹽產(chǎn)物的活性和蛋白鏈結(jié)構(gòu)的保持，在其他濃度的山梨酸鉀作用下，自由基清除率和SPC下降較快。從表8中可以看出，苯甲酸鈉的作用效果比山梨酸鉀的大，5d之后，在0.4%的苯甲酸鈉濃度下，自由基清除率下降的速度比對0.6%山梨酸鉀作用下慢。從兩表中可看出，表8在前5d的同防腐劑濃度下，各指標(biāo)的變化均呈現(xiàn)一般顯著性，而表7相對變化更加顯著；且在后5d，不同濃度的防腐劑保存AOP，隨時間變化各指標(biāo)顯示結(jié)果也是表7的變化更加顯著。此現(xiàn)象說明兩種防腐劑可能需要合適的濃度才能對AOP抗氧化活性以及可溶性結(jié)構(gòu)其到穩(wěn)定作用，這也與朱淑云等［20］研究結(jié)果相符，即一定濃度的防腐劑會降低其活性。預(yù)實驗并結(jié)合其他學(xué)者的相關(guān)研究結(jié)果，已證實小濃度的防腐劑對其活性變化影響較小，實驗選取了超出國家安全標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的濃度來做基礎(chǔ)實驗，進一步研究其影響。

表6　不同葡萄糖濃度對AOP自由基清除率和可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)的影響Table 6　Effect of glucose concentration on free radicals scavenging capacity and soluble protein content of the rude product

2.4金屬離子的影響

在食品中，經(jīng)常會存在一些對人體有益的金屬離子，或者作為強化劑添加在食品中，所以必須考慮這些常見金屬離子對合浦珠母貝肉抗氧化肽的穩(wěn)定性影響。在實驗濃度范圍內(nèi)，不同的金屬離子對脫鹽產(chǎn)物的DPPH·、·OH清除率和可溶性蛋白的質(zhì)量分數(shù)的影響程度也不同，具體結(jié)果見圖1～圖3。

圖1　不同離子對產(chǎn)物DPPH·清除能力的影響Fig.1　Effect of different metal ions on scavenging rates of the rude product against DPPH free radicals

圖2　不同離子對產(chǎn)物·OH清除能力的影響Fig.2　Effect of different metal ions on scavenging rates of the rude product against OH free radicals

由圖1可知，不同濃度K+、Ca2+和Mg2+對樣品的DPPH自由基清除率影響較小，與孟良玉等［21］就金屬離子對蜂膠提取物抗氧化活性的研究結(jié)論一致。而Zn2+和Cu2+的影響較大，Zn2+在0.01mg·mL-1后其對DPPH·清除率下降迅速，同樣Cu2+在0.05mg·mL-1后有同樣的影響效果，但是不同的是Cu2+0.05mg·mL-1之前呈現(xiàn)些許的上升的趨勢，可能是肽的螯合作用增強了對DPPH自由基的清除能力。此結(jié)果與游麗君等［22］就金屬離子對泥鰍多肽的抗氧化性的影響研究結(jié)果一致。

表7　不同山梨酸鉀濃度對AOP自由基清除率和可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)的影響Table 7　Effect of potassium sorbate concentration on free radicals scavenging capacity and soluble protein content of the rude product

由圖2可知，在5～500μg·mL-1范圍內(nèi)，K+、Ca2+、Mg2+和Zn2+對樣品的·OH清除率影響較小，曲線沒有明顯的變化，但之后會有所下降。而Cu2+的影響較大，0.01～0.05mg·mL-1范圍內(nèi)樣品對·OH清除率急速下降，之后則較平緩。由圖3可見，不同離子在不同的濃度同樣對蛋白的溶解性也有一定的影響。從以上三個圖中的結(jié)果來看，這可能是因為樣品對Zn2+和Cu2+的螯合能力較好，但也有一定的限度，螯合物對其結(jié)構(gòu)存在一定的影響，從而影響其活性變化。

圖3　不同離子對產(chǎn)物可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.3　Effect of different metal ions on soluble protein content of the rude product

2.5光照的影響

圖4是光照對產(chǎn)物清除超氧陰離子能力的影響結(jié)果，對于超氧陰離子的清除能力，光照與避光相比沒有大的影響。此點與于志鵬等［23］對光照引起蛋清蛋白質(zhì)降壓肽的活性變化并不顯著的結(jié)果相吻合。

圖4　光照對產(chǎn)物清除能力的影響Fig.4　Effect of light on scavenging rates of the rude product againstfree radicals

圖5中，隨著時間增加，避光的樣品對DPPH自由基的清除能力有幾近相同逐漸顯現(xiàn)出優(yōu)勢，說明避光保存樣品，有利于其對DPPH自由基的清除能力保持，長時間光照會影響其活性的變化。同樣，圖6是光照對樣品清除羥自由基能力的影響結(jié)果，其效果與圖5相似。

表8　不同苯甲酸鈉濃度對AOP自由基清除率和可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)的影響Table 8　Effect of sodium benzoate concentration on free radicals scavenging capacity and soluble protein content of the rude product

圖5　光照對產(chǎn)物DPPH·清除能力的影響Fig.5　Effect of light on scavenging rates of the rude product against DPPH free radicals

圖6　光照對產(chǎn)物·OH清除能力的影響Fig.6　Effect of light on scavenging rates of the rude product against OH free radicals

圖7中是光照與避光對樣品中可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)的影響結(jié)果，從圖7中可以看出，前3d，兩組下降程度相同，但避光稍好。之后光照組的樣品隨著時間延長，其下降的趨勢也逐漸增大，避光組則相對較平緩，說明光照不利于合浦珠母貝蛋白結(jié)構(gòu)的保存，此處與游麗君等［22］就光照對泥鰍多肽的抗氧化性的影響研究結(jié)果一致。

本實驗中發(fā)現(xiàn)AOP在光照條件下，對超氧陰離子的清除能力在跟蹤期限內(nèi)變化不顯著，而對DPPH·和·OH隨著時間延長其清除能力下降，相應(yīng)的在圖7中也顯示5d后光照對可溶性蛋白含量有顯著影響。綜合比較分析，光照可能影響AOP中存在的抗氧化片段中供質(zhì)子體或者與自由基結(jié)合形成的電子云結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，圖7中也側(cè)面證明了光照對其蛋白結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)構(gòu)變化影響其被氧化。然而其精確的機理還需要進一步的研究加以證明。

圖7　光照對產(chǎn)物可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.7　Effect of light on soluble protein content of the rude product

3　結(jié)論

食品添加劑中NaCl和蔗糖對合浦珠母貝肉抗氧化肽的活性以及可溶性蛋白的影響較小，而葡萄糖在樣品保藏過程中，隨著時間延長，會使抗氧化能力和SPC降低速度增加。防腐劑山梨酸鉀的濃度為0.6%時有利于AOP抗氧化活性的保持，而苯甲酸鈉的效果較山梨酸鉀相對較大，對樣品兩項指標(biāo)保持較好的濃度為0.4%。不同的金屬離子在不同濃度下，對其抗氧化能力和SPC的影響不同。Cu2+的影響最大，所以添加該離子時，要注意濃度范圍，小于0.05mg·mL-1下較好。光照不利于其抗氧化能力的保持，也會對合浦珠母貝蛋白造成一定的影響，故而避光保存較好。

綜上可以說明此酶解產(chǎn)物會在應(yīng)用過程中受到食品類添加劑、防腐劑、金屬離子以及光照等的影響，對不同因素，其穩(wěn)定性表現(xiàn)出不同程度的變化，以期此實驗可以為其在后續(xù)應(yīng)用中，針對性地保護其抗氧化穩(wěn)定性，提高對抗氧化肽的利用率，將成為抗氧化劑研究的重點［24］。

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Effect of additives and illumination on antioxidant activity of antioxidant peptides derived from Pinctada fucata protein

WU Yan-yan1，WANG Jing1，2，LI Lai-hao1，YANG Xian-qing1，HU Xiao1，ZHOU Wan-jun1
（1.South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Key Lab of Aquatic Product Processing，Ministry of Agriculture，Guangzhou 510300，China；2.College of Food，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

To find out whether antioxidant peptides derived from Pinctada fucata protein in the application under the influence of food additives and light.The scavenging capacities against DPPH，hydroxy free radicals，superoxide anions and soluble protein content（SPC）served as the indexes，we measured its oxidation stability by food materials（NaCl，sucrose and glucose），concentration of different preservatives（sodium benzoate and potassium sorbate），metal ions（K+，Ca2+，Mg2+，Zn2+和Cu2+）and the influence of illumination.The results showed that antioxidation peptide activity was less affected by NaCl and sucrose in 0.5%～4.0%and 2.0%～10.0%，but strongly influenced by glucose for long time preservation.Preservative affected their antioxidant activity and SPC，and the effect of sodium benzoate（0.4%）effect stronger than potassium sorbate（0.6%）.K+，Ca2+，Mg2+less effect on its ability of scavenging free radicals，but the influence of Cu2+maximum，especially in the bigger concentration than 50μg·mL-1.Light could reduce its antioxidant capacity and didn’t do good to its storage.

Pinctada fucata protein；antioxidant peptides；food additives；illumination；antioxidant stability

TS254.9

A

1002-0306（2015）02-0149-08

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.024

2014－06－04

吳燕燕（1969-），女，博士，研究員，研究方向：水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全控制。

廣東省科技計劃項目（2011B031200009）；海南省重點科技項目（ZDXM20100005）；國家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專項（201305018）。