新疆野生羊肚菌物種多樣性研究

武冬梅，許文濤，謝宗銘，李全勝，祝建波，沈海濤，羅云波，*（.新疆農墾科學院生物技術研究所/作物種質創新與基因資源利用兵團重點實驗室，新疆石河子832000；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京00083；3.農業部轉基因生物食用安全監督檢驗測試中心（北京），北京00083；.石河子大學生命科學學院，新疆石河子832000）

新疆野生羊肚菌物種多樣性研究

武冬梅1，2，許文濤2，3，謝宗銘1，李全勝1，祝建波4，沈海濤4，羅云波2，3，*
（1.新疆農墾科學院生物技術研究所/作物種質創新與基因資源利用兵團重點實驗室，新疆石河子832000；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083；3.農業部轉基因生物食用安全監督檢驗測試中心（北京），北京100083；4.石河子大學生命科學學院，新疆石河子832000）

根據子實體形態特征并結合rDNA ITS（Internal Transcribed Spacer）序列分析技術分析了根據形態特征挑選的、采自新疆伊犁、塔城、石河子、烏魯木齊、阿勒泰五地區的31株野生羊肚菌子實體。rDNA ITS序列分析表明，采自新疆兵團185團且形態學分類為半開羊肚菌（Morchella semilibera）的2株菌株實為羊肚菌科常見屬鐘菌屬的皺蓋鐘菌（Verpa bohemica）。以2株皺蓋鐘菌作為外類群，29株樣品與來自GenBank的羊肚菌屬各物種進行ITS序列聚類，可以分為四大聚類群，其中25株菌株與Morchella sp.Mel-17/19/20/34、Morchella sp.Mel-23/24/31/32、Morchella sp.Mel-13/26聚為第I類群；半開羊肚菌單獨聚為第II類群；1株菌株與Morchella frustrata聚為第III類群；3株菌株與Morchella sp.Mes-6、Morchella sp.Mes-7、Morchella sp.Mes-17共同聚為第四類群。結合形態學特征，初步認為，上述五地區羊肚菌屬至少由7個物種構成。根據國內最新研究資料，其中2種為中國新紀錄種，分別為Morchella sp.Mes-17和Morchella frustrata（中立羊肚菌）。

新疆，野生羊肚菌，物種多樣性，內轉錄間隔區（ITS）

羊肚菌屬，隸屬子囊菌門，盤菌綱，盤菌目，羊肚菌科［1］，該屬模式種是羊肚菌［2］。因其典型特征為具有蜂窩狀或羊肚狀的菌蓋，故名羊肚菌。羊肚菌子實體肉質脆嫩，味道鮮美，是一種世界公認的珍稀、野生食藥用真菌［3-4］。

新疆特殊的地理環境孕育了豐富的野生羊肚菌資源，趙震宇［5］記載新疆常見的羊肚菌有5種，分別是黑脈羊肚菌、圓錐羊肚菌、羊肚菌、小羊肚菌、皺柄羊肚菌；卯曉嵐［6］記載新疆的5種羊肚菌分別是黑脈羊肚菌、尖頂羊肚菌、羊肚菌、粗腿羊肚菌、高羊肚菌；已有相關研究文獻報道，新疆野生羊肚菌有小頂羊肚菌、高羊肚菌、小羊肚菌、尖頂羊肚菌、粗柄羊肚菌、黑脈羊肚菌、羊肚菌、離柄羊肚菌等［7-10］。

傳統的羊肚菌屬物種分類主要依據子實體的外觀形狀、菌絲、子囊、子囊孢子及側絲的形態特征［11-12］，如，根據菌蓋的形狀和顏色，菌蓋與菌柄是否分離，菌蓋表面棱紋的排列和顏色深淺，菌物學家將羊肚菌屬分為3大類，即黑色羊肚菌類、黃色羊肚菌類和半開羊肚菌類［13-14］。在上述三個廣義物種類群的基礎上，根據成熟子囊果的子實體和菌柄是否變紅提出了第4個類群，即變紅羊肚菌類群，包括產于美洲熱帶和亞熱帶的3個種［2］。

有關新疆野生羊肚菌屬的物種構成，無論5種，還是7種的分類記述，都是基于這種形態學分類界定的形態學物種。但因野生羊肚菌發育過程中具有形態特征隨環境條件和個體發育年齡發生一定變化的復雜性和不穩定性，導致形態學分類具有不確定性，很容易導致出現同菌異名及同名異菌現象。

近年來，分子生物學技術的飛速發展帶領了真菌分類和系統發育研究的革命性變革［15-16］，DNA序列分析，特別是ITS序列分析技術，因其能實質性地反映出屬間、種間及菌株直接的堿基對差異，已被廣泛應用于真菌屬內不同種間或近似屬間的分類研究［17-25］。新疆的科研工作者也開展了基于ITS序列的野生羊肚菌分類研究，如蘇俊等［26］對新疆伊犁霍城縣大西溝采集的兩種形態不同的野生羊肚菌進行分子水平的分類學鑒定，結果與傳統形態學鑒定結果不一致；劉偉等［27］的研究結果也表明，兩地區羊肚菌形態學上的差異是由于環境或發育不同階段的差異造成的；馮麗等［28］利用ITS序列分析技術確定采自新疆哈密松樹塘的野生羊肚菌為肋脈羊肚菌。

上述這種分子水平的研究對確定新疆不同地區羊肚菌種類并正確認識和利用野生羊肚菌具有重要的理論意義。本研究以2011～2013年間自新疆野生羊肚菌主產區伊犁、塔城、石河子、烏魯木齊、阿勒泰等地區采集到的部分野生羊肚菌為材料，提取子實體基因組DNA進行ITS序列比對分析，構建進化樹，進一步探討新疆野生羊肚菌的物種多樣性，旨在較為準確地確定各地區分布的物種，進而為野生羊肚菌人工栽培及進一步的開發利用提供科學依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

野生羊肚菌子實體分別于2011～2013年采自新疆伊犁、塔城、石河子、烏魯木齊、阿勒泰等地區，共197份樣品，分別命名為M1～M197，根據Bunyard［29］的分類方法，按照子實體形態差異、色澤等特征將樣品分為3個大類群，黑色羊肚菌（黑脈羊肚菌、尖頂羊肚菌、高羊肚菌）、半開羊肚菌、黃色羊肚菌（羊肚菌、粗柄羊肚菌）。按照不同地區及形態特征的典型性分別從中選取2～3份樣品作為ITS序列分析樣品，共計31份，樣品編號、來源、形態學分類鑒定結果見表1； 2×Easy Taq Mix、液氮、2×CTAB DNA提取液、裂解液北京康為世紀生物公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、蛋白酶K溶液（20mg/mL）、β-巰基乙醇（100mg/mL）、RNA酶（10mg/mL） 上海生工生物工程有限公司。

MM400組織破碎儀德國萊弛，用于樣品的破碎；DK-S24水浴鍋上海精宏；德國IKA渦旋振蕩器MS1 minishaker，用于樣品的混勻；Z-16KC冷凍離心機德國Sigma，用于DNA提取時冷凍離心；PCR儀Bio-Rad，Thermal cycle，用于DNA擴增；T2A電泳儀凝膠成像系統美國Bio-Rad，用于電泳凝膠圖像的分析。

1.2實驗方法

1.2.1野生羊肚菌子實體基因組DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測CTAB法提取野生羊肚菌子實體基因組DNA：分別稱取0.12～0.15g野生羊肚菌子實體樣品于2.0mL離心管中，于液氮中冷凍2min，置于組織破碎儀中研磨45s至粉末狀；迅速加入1000μL 2×CTAB DNA提取緩沖液、β-巰基乙醇20μL，蛋白酶K10μL，渦旋混勻，冰浴保存10min后4℃，12000r/min離心10min；棄上清，沉淀中加2×CTAB DNA裂解液（65℃預熱）500μL，β-巰基乙醇20μL，蛋白酶K10μL，混勻后置65℃水浴抽提30min，每10min翻轉一次，以保證充分裂解；冷卻，加入500μL氯仿∶異戊醇（24∶1）混合液，12000r/min離心10min；取上清，冷卻，加入500μL氯仿∶異戊醇（24∶1）混合液，12000r/min離心10min；取上清，加入0.6倍體積預冷的異丙醇，混勻，靜置10min，12000r/min離心10min；棄上清，沉淀用75%的乙醇洗滌兩次，10000r/min離心10min；棄上清，通風干燥，40μL ddH2O溶解DNA，加入3μL RNA酶，37℃水浴消化30min后用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。以ddH2O將獲得的DNA稀釋10倍備用。

1.2.2ITS區擴增及克隆測序采用White［21］設計的真菌核糖體基因間隔區（ITS）通用引物ITS1/ITS4分別對31株供試材料rDNA ITS序列進行PCR擴增。引物序列如下：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

ITS-PCR擴增反應體系（20μL）為：2×Easy Taq Mix 10μL，ITS1（10μmol/L）0.8μL，ITS4（10μmol/L）0.8μL，模板DNA 0.6μL，ddH2O 7.8μL。反應程序為：95℃預變性4min，95℃變性30s，57℃復性30s，72℃延伸60s，31個循環后72℃延伸7min結束反應。

PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別用DNA凝膠回收試劑盒分別回收純化目的片段，將擴增產物連接到pUCm-T載體上，轉化大腸桿菌，轉化子經PCR鑒定后委托上海生工生物工程技術服務有限公司完成測序。

漢中職業技術學院肖寧的《學前教育專業校企合作共建機制的探索與實踐》一文中提出“共建人才培養方案、共建實踐教學基地、共建課程、共建課堂”四建的全新觀點。在這當中校企、校園要共同參與人才培養的測評及教學管理的工作，共同制定考核標準與行業準入標準，設定相似的教學環境與工作環境，統一教學內容和工作任務，了解教師與崗位工作者的要求，切實落實完善“校企共育，全程實踐”的人才培養模式。

1.2.3序列分析與系統進化樹的構建31株供試材料測序后分別利用DNAStar Lasergene.v 7.1軟件包中的Editseq進行處理，得到ITS片段全序列（18s+ITS1+ 5.8S+ITS2+28s）信息。將獲得的ITS全序列剔除兩端的載體序列、引物序列及18S、28S序列，使序列信息盡可能一致。利用上述軟件計算各序列間的相似性、序列趨異度，MEGA 5.0軟件計算樣品遺傳距離。利用NCBI數據庫中BLAST程序進行序列同源性比較。

表1　材料及來源Table 1　Materials and source

鑒于相關的研究報道［30］，Genbank內至少有66%的羊肚菌ITS序列的物種名稱是錯誤的，同物異名和異物同名的現象非常嚴重，不能以GenBank中的ITS序列作為判定標準，本研究所用比對分析序列全部為杜習慧等［30］提交的正確序列。用MEGA 5.0中的Alignment程序對所測得的ITS序列進行多重對位排列，并手動刪除對位排列結果中的非對位排列序列。對位排列結果中的空位或缺失數據作pair-wise處理，分析時所用參數均為系統默認值。以采自新疆生產建設兵團十師185團的皺蓋鐘菌XJT2、XJT4分別作為構建系統進化樹時外類群菌株，采用鄰位相連法［31］構建系統發育樹，利用自展法（Bootstrap，1000次重復）檢驗各分支的置信度［32］。

2　結果與分析

2.1野生羊肚菌子實體基因組DNA提取及ITS序列PCR擴增測序

由于野生羊肚菌中多糖、膠質等次生代謝物含量較高，容易與DNA吸附，給基因組DNA的提取和純化帶來一定困難。研究中采用改進的CTAB法，電泳結果顯示該法可以順利提取出羊肚菌子實體基因組DNA（圖1、圖2）。

分別以31株供試樣品基因組DNA為模板，采用通用引物ITS1/ITS4進行ITS序列擴增，均得到清晰的、與預期大小一致的特異性條帶。其中，有25個樣品的ITS序列在750bp左右，1個樣品的ITS序列在1000bp左右，3個樣品的ITS序列在1200bp左右，2個樣品的ITS序列在800bp左右（圖3～圖4）。該結果與Wipf等［13］的研究結果一致，即黑色羊肚菌的ITS序列長度在740～750bp之間；黃色羊肚菌的ITS序列在1150～1220bp之間。

圖1　野生羊肚菌基因組DNAFig.1　Wild Morchella genome DNA

圖2　野生羊肚菌基因組DNAFig.2　Wild Morchella genome DNA

圖3　基因組DNA ITS序列擴增Fig.3　Amplification of ITS from genome

圖4　基因組DNA ITS序列擴增Fig.4　Amplification of ITS from genome

PCR擴增產物分別經SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收純化后連接至pUCm-T載體，轉化子經PCR鑒定，均得到與預期大小一致的特異性目的片段。結果表明，已分別克隆了31份樣品ITS序列。所得轉化子經測序后均全部獲得ITS區全序列信息。

2.2ITS序列分析

31份樣品中，種內趨異度較小，為0.1～0.3；種間趨異度較大，如M1和M194序列趨異度達66.8。M1、M24、M62、M194、XJT2、XJT4 6份樣品的序列相似率為56.1%～70.5%，其余樣品序列相似率在97.1%～100.0%之間。31份樣品的遺傳距離為0.0000～0.5067，其中26份遺傳距離為0.0000～0.0255；XJT2、XJT4為鐘菌屬，與其他材料遺傳距離較大，為0.5067；M1、M24和M62、M194與其他材料的最大遺傳距離分別為0.3507、0.3353、0.3166。遺傳距離參數能夠反映種間的親緣關系。

利用NCBI數據庫中BLAST程序進行序列同源性比較，結果顯示，31份供試材料中，M10、M12、M25、M30等16份材料ITS序列與數據庫中收錄的Morchella sp.Mel-17/19/20/34序列相似率達99%～100%；M15、M72、M111、M151等7份材料ITS序列與Morchella sp. Mel-23/24/31/32序列相似率達99%；M188、M106與Morchella sp.Mel-13/26序列相似率達99%～100%；M24、M62與Morchella sp.Mes-6、Morchella sp.Mes-7序列相似率99%；M194與Morchella frustrata（中立羊肚菌）序列相似率達99%；M1與Morchella sp.Mes-17序列相似率達99%；XJT2、XJT4則與Verpa bohemica（皺蓋鐘菌）序列相似率達99%。

2.3基于ITS序列的系統發育樹構建與分析

31份供試材料ITS序列、自NCBI數據庫下載的同源性較高的序列及實驗材料中沒有涉及的羊肚菌屬其他物種ITS序列，以皺蓋鐘菌Verpa bohemica作為外類群，采用鄰位相連法分別構建系統發育樹，所顯示的進化樹如圖5所示。

從圖5系統發育樹可以看出，以采集的皺蓋鐘菌為外類群，其余29份樣品與下載自NCBI數據庫中的尖頂羊肚菌、粗柄羊肚菌、半開羊肚菌、羊肚菌進行聚類，可以分為四大聚類群。M25、M30等25份樣品序列差異較小，親緣關系較近，與來自數據庫的Morchella sp.Mel-17/19/20/34、Morchella sp.Mel-23/ 24/31/32、Morchella sp.Mel-13/26所代表的不同物種，以99%的Bootstrap值共同聚在第I類群；半開羊肚菌單獨聚為第II類群；樣品M194以99%的Bootstrap值與Morchella frustrata聚為第III類群；來自NCBI的羊肚菌，粗柄羊肚菌，海綿羊肚菌、Morchella sp.Mes-17與供試樣品M1、M24、M62共同聚類在第IV類群，但樣品M1與Mes-17親緣關系近，M24、M62則與Morchella sp.Mes-6親緣關系更近。

3　結論

綜合利用形態學分類方法、rDNA ITS序列分析技術分析確定采集自新疆伊犁、塔城、石河子、烏魯木齊、阿勒泰等地區的野生羊肚菌的歸屬，探討新疆野生羊肚菌物種多樣性，為新疆野生羊肚菌保護及開發利用提供幫助。

圖5　基于ITS序列構建的羊肚菌系統發育樹Fig.5　Phylogenetic trees based on rDNA ITS sequence

根據分析結果初步判定上述五地區的野生羊肚菌由黑色羊肚菌和黃色羊肚菌兩大類群構成，黑色羊肚菌物種構成為Morchella sp.Mel-17/19/20/34、Morchella sp.Mel-23/24/31/32、Morchella sp.Mel-13/ 26、Morchella frustrata（中立羊肚菌）；黃色羊肚菌物種構成為Morchella sp.Mes-17、Morchella sp.Mes-6、Morchella sp.Mes-7。研究顯示，迄今為止，羊肚菌屬系統發育種中只有20個系統發育種有各自的獨特形態特征，可以用形態特征區分，并有相應的中文名及拉丁名［2］，其他物種都有待進一步研究和命名，因此，本研究根據rDNA ITS序列對新疆野生羊肚菌歸屬僅進行了初步的分析，還不能界定到具體的物種并正確命名。但結合形態學特征，可以認為，上述五地區至少分布有7種野生羊肚菌。且根據最新研究資料［33］，7個物種中，有5種在前人的研究中有過報道，Morchella frustrata（中立羊肚菌）及Morchella sp.Mes-17在中國尚未有報道，初步判定為新種，正在做進一步的鑒定。

另外，31份樣品中，采集自新疆兵團185團的樣品，根據形態學鑒定為半開羊肚菌，分子鑒定結果顯示，該菌株實為羊肚菌科常見的鐘菌屬物種皺蓋鐘菌。

4　討論

野生羊肚菌發育過程中形態特征隨環境條件和個體發育年齡發生一定程度的變化，根據傳統的分類方法很難對其進行準確的分類鑒定。目前主要采用ITS序列分析技術進行鑒定。

盡管目前ITS序列分析技術已經成為真菌界廣泛應用的一個分子標記，已經成功應用于對松茸、松乳菇等珍稀食用菌純培養菌種的鑒定［34-36］，為菌種的鑒定及系統發育分析提供了重要依據。但是，近年來，對于Genbank中序列的可靠性，部分學者持懷疑態度，認為至少有66%的羊肚菌ITS序列的物種名稱是錯誤的，同物異名和異物同名的現象非常嚴重［33，37-41］。本研究中進行同源序列聚類時也發現存在聚類混亂現象，因此，僅僅依靠ITS序列的序列分析就略顯不夠嚴謹。

鑒于以上原因，在運用ITS序列分析技術的同時，如果再輔以RPB1、RPB2、EF1a等基因片段，可能會更準確、全面。因此，本研究將在物種多樣性研究的基礎上，進一步結合RPB1、RPB2、EF1a等基因片段做進一步的分析，以使結果更加完善，這不僅可以豐富新疆野生羊肚菌多樣性的菌種資源庫信息，還可以為野生羊肚菌的人工栽培及進一步開發利用提供科學依據。新疆地大物博，物種多樣性豐富，羊肚菌屬的分類研究任重而道遠。

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Study on species diversity of wild Morchella in Xinjiang

WU Dong-mei1，2，XU Wen-tao2，3，XIE Zong-ming1，LI Quan-sheng1，ZHU Jian-bo4，SHEN Hai-tao4，LUO Yun-bo2，3，*
（1.Biotechnology Research Institue，Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences/Xinjiang Production& Construction Group Key Laboratory of Crop Germplasm Enhancement and Gene Resources Utilization，Shihezi 832000，China；2.College of Food Science and Nutrition Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China；3.TheSupervision，Inspection&TestingCenterofGeneticallyModifiedFoodSafety，MinistryofAgriculture，Beijing100083，China；4.College of Life Sciences of Shihezi University，Shihezi 832000，China）

Thirty-one wild Morchella specimens，which were collected from five different areas in Xinjiang and selected on the basis differences in fruit body morphology，then they were identified by morphological characteristics and internal transcribed spacer sequence analysis respectively.The results showed that two strains belonged to Verpa bohemica，not Morchella semilibera，which collected from 185 regiment in Xinjiang. When the two Verpa bohemica strains were taken as outgroup，phylogenetic trees were produced by the ITS sequences of the twenty-nine strains and other species of Morchella from GenBank.Phylogenetic analysis indicated that the twenty-five strains and Morchella sp.Mel-17/19/20/34、Morchella sp.Mel-23/24/31/32、Morchella sp.Mel-13/26 formed the first cluster.Morchella semilibera belonged to the second cluster.One strains and Morchella frustrata formed the third cluster.The fourth cluster included three strains and Morchella sp.Mes-6、Morchella sp.Mes-7 and Morchella sp.Mes-17.Morphological characteristics and phylogenetic analysis indicated that there were at least seven species of Morchella in these five area of Xinjiang.According to recent research，Morchella sp.Mes-17 and Morchella frustrate were two new species of Morchella in China. Key words：Xinjiang；wild Morchella；species diversity；internal transcribed spacer sequence

TS201.1

A

1002-0306（2015）02-0167-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.027

2014－05－06

武冬梅（1976-），女，碩士研究生，副研究員，主要從事應用微生物學及生物技術應用方面的研究。

羅云波（1960-），男，博士，教授，主要從事食品安全、食品生物技術、果蔬貯藏保鮮方面的研究。

國家自然科學基金資助項目（31160011）；國家星火計劃項目（2013GA.891001）；石河子大學科學技術研究發展計劃（2012ZRKXYQ-YD15）。