LEA-motif對胰島素在低溫干燥過程中活性保護的研究

張　燕，李代禧，*，郭柏松，翟　振，劉　立，楊春生，余華星（.上海理工大學食品科學與工程研究所，上海00093；.上海東富龍科技股份有限公司，凍干工藝研究室，上海008）

LEA-motif對胰島素在低溫干燥過程中活性保護的研究

張燕1，李代禧1，*，郭柏松2，翟振1，劉立1，楊春生2，余華星1
（1.上海理工大學食品科學與工程研究所，上海200093；2.上海東富龍科技股份有限公司，凍干工藝研究室，上海201108）

選用LEA蛋白特征重復片段（LEA-motif）作為干燥活性保護劑，以胰島素為研究對象，研究該天熱保護劑對熱敏性胰島素的干燥保護效果和作用機理。模擬采用Gromacs軟件及Gromos96（53a6）簡化原子力場，并采用REMD廣泛采樣分子模擬方法。研究結果表明，LEA蛋白特征重復片段對胰島素的三維活性結構、二級結構都有良好的保護作用。另外，從實驗驗證結果可知，有LEA-motif保護的胰島素六聚體活性明顯提高。綜上可知，LEA蛋白特征重復片段對熱敏性蛋白藥物有良好的干燥活性保護作用。

胰島素，LEA-motif，分子模擬，干燥活性保護，結構穩定性，效價

胰島素（insulin）是機體內能唯一降低血糖的激素，由51個氨基酸組成。有A、B兩條肽鏈，通過兩個二硫鍵連接起來［1］。胰島素是糖尿病患者治療的首選藥物。然而，胰島蛋白藥物在常溫下就很容易變性失活，簡單的低溫冷凍干燥只能減緩其變性過程，并不能阻止熱敏性藥物的變性［2］，要想更好地保護熱敏性藥物的生物活性結構，必須尋求一種安全有效的干燥保護劑來限制胰島素的有害熱運動，防止其發生變性和失活。

胚胎發育晚期豐富蛋白（Late embryogenesis abundant，LEA）是伴隨著脫水干燥過程產生的一類低分子量、高親水性的無定型蛋白［3］，由于LEA蛋白的存在，這類生物能迅速適應高、低溫導致的極度缺水環境［4］。脫水過程中，LEA蛋白的無序部分能形成適應其他蛋白的形狀，吸附在其他蛋白表面，形成保護層，從而防止了蛋白的脫水變性、聚集變性和受熱變性。LEA蛋白一般分為6類，其中第3組蛋白分布更廣，同源序列為11個氨基酸的串聯重復排列，可形成親水性的α-螺旋結構。所以對于第3組LEA蛋白及其特征重復片段研究具有重要意義。另外，實驗室課題組以LEA蛋白［5］以及構成LEA蛋白的氨基酸［6］為保護劑分別對胰島素的保護效果做過一定研究，研究結果表明這兩種物質作為保護劑對胰島素在干燥過程中的活性保護效果顯著。然而，Shimizu T［7］報道，LEA蛋白的11個氨基酸特征重復片段才是LEA蛋白對植物在脅迫環境下保護作用的體現者。因此，本課題決定采用第3組LEA蛋白（AaVLEA1）［8］的特征重復片段（LEA-motif，LEAM）作為保護劑來研究其對熱敏性藥物胰島素在干燥過程中的活性保護效果。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

豬胰島素（1306A04） 江蘇徐州萬邦生化醫藥股份有限公司；LEA蛋白特征重復片段（LT130325-LT342888，純度95.47%） 北京澤溪源生物科技有限公司；無水硫酸鈉（分析純）和乙醇胺上海潤捷化學試劑有限公司；磷酸（分析純） 江蘇強盛功能化學股份有限公司。

高效液相色譜儀、Waters e2695分離模塊和Waters 2998光電二極管檢測器均購自沃特世科技（上海）有限公司（Waters）；LYO-0.2型凍干機上海東富龍科技股份有限公司；XS205型稱重天平梅特勒托利多儀器（上海）有限公司。

1.2模擬方法

胰島素采用蛋白質數據庫中的晶體結構（3inc）作為初始結構（圖1A）。選用第三組LEA蛋白（AaVLEA1）的特征重復片段11個氨基酸序（KTAEFRDSAGE）作為胰島素的干燥活性保護劑（圖1B）。

圖1　胰島素（A）和LEAM（B）結構Fig.1　The structures of insulin（A）and LEAM（B）

在4種不同水分含量下，研究不同數目保護劑對胰島素的干燥活性保護效果。各體系的詳細組成如表1所示。

表1　不同水分含量下胰島素體系的組成（wt%）Table 1　The composition of the insulin system at different water content（wt%）for REMD simulation

采用GROMACS軟件包［9］、Gromos96（53a6）［10］簡化原子力場和REMD（Replica Exchange Molecular Dynamics）［11］方法在周期性邊界為10nm×10nm×10nm的NVT系綜中以2fs的步長進行分子模擬。首先將胰島素分子置于周期性盒子中心，然后在胰島素分子周圍均勻添加保護劑和水分子。其中，水分子采用TIP4P模型。范德華分子間相互作用和靜電相互作用的截距分別為1.4nm和1.0nm。并且每10步重建一次鄰近列表。靜電相互作用的遠程修正采用PME（Particle Mesh Ewald）［12］方法。

各體系首先進行5500步的能量最小化，以優化體系結構。然后設定體系溫度為300K，進行4ns的預平衡過程；預平衡結束后，再分別在280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308和310K這16種溫度下進行10ns的平衡過程，從而獲得各對應溫度下穩定的胰島素體系。最后，將各溫度下平衡后的結構作為初始構象，再進行50ns的REMD模擬。以上模擬過程每2ps交換1次，取最終平衡后5ns的模擬軌跡用來進行數據統計和分析。

1.3凍干實驗

運用冷凍干燥實驗研究LEA-motif保護劑對豬胰島素六聚體在凍干過程中的保護效果。制備實驗用胰島素濃度為5mg/mL，再加入LEA-motif保護劑，其與胰島素六聚體的摩爾比分別為1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4（即LEA-motif與胰島素單體的摩爾比為1∶0、1∶6、1∶12、1∶18、1∶24，與分子模擬的量相匹配）。

采用凍干機進行冷凍干燥實驗。首先將藥物在-45℃預凍1h，從而完成冷凍過程；然后抽真空，一次干燥溫度-35℃，干燥室內真空度為0mBar，干燥18h。解析干燥溫度為25℃，直至干燥過程結束，這個過程共持續6h。凍干結束后，用橡皮塞封玻璃瓶，將凍干后的胰島素保存于冰箱中。

1.4效價測定

用十八烷基硅烷鍵合硅膠做為填充劑（4.6mm× 250mm，5μm，Waters e2695）；以0.2mol/L硫酸鹽緩沖液（取無水硫酸鈉28.4g，加水溶解后，加磷酸2.7mL，乙醇胺調節pH至2.3，加水至1000mL）-乙腈（74∶26）為流動相；柱溫為40℃；檢測波長為214nm；流速1mL/min。凍干胰島素固體用0.01mol/L鹽酸溶液復溶，制成40U/mL的溶液，注入液相色譜儀20μL，記錄色譜圖；另取未凍干胰島素原液適量為對照，同法測定，按外標法以峰面積計算效價［13］。

2　結果與分析

2.1干燥前后胰島素三維結構的變化

在藥物凍干實驗中，干燥蛋白藥物的水分含量一般要求在2%［14］左右。因此，我們重點分析水分含量在2%附近的胰島素樣品的干燥情況。沒有添加任何保護劑和添加了一定量LEA-motif的干燥胰島素的三維結構如圖2所示。

從圖2中的結果可以看出，沒有LEA蛋白特征重復片段保護的胰島素樣品，干燥后，整體結構發生很大變化，許多疏水殘基外翻暴露于胰島素單體的分子表面，α-螺旋明顯減少，并大部分轉化為無規則卷曲和β-扭轉，三維結構徹底變形，而且這種變性趨勢隨著干燥程度的增加而增加，這樣嚴重變性的胰島素即使在水溶液中也不可能恢復到初始三維活性結構。然而，添加保護劑的胰島素的三維活性結構得到了較好的保持，從4種保護情況來看，添加6條LEA-motif保護劑，胰島素三維活性結構也略微發生了變性，α-螺旋有所減少，這由于添加的保護劑數量不足，在干燥過程中無法使胰島素得到很好的保護，但相對未加任何保護劑的胰島素而言，添加6條LEA-motif對胰島素活性結構有一定的保護效果。然而，添加12、18和24條LEA-motif保護劑，干燥后的胰島素樣品在整體結構和二級結構上都被保護的較好，尤其添加24條LEA-motif，其胰島素活性結構與初始結構相比沒有明顯區別。從以上結果可以看出，LEA蛋白特征重復片段對胰島素的生物活性保護是顯而易見的。

圖2　干燥后的胰島素的三維結構比較Fig.2　3D structures of dried insulin

2.2胰島素干燥前后的二級結構變化

圖3中橫坐標為添加了不同數目的LEA-motif保護劑的胰島素和初始胰島素模型，縱坐標為α-螺旋、β-轉角、無規卷曲的數目。從圖3中可以看出，未加任何保護劑的胰島素α-螺旋數目（如圖3A）顯著減少，而β-轉角卻急劇增加（圖3B），說明胰島素二級結構在干燥過程中發生了嚴重變性，大部分α-螺旋轉變成β-轉角，胰島素明顯發生變形。然而，添加LEA-motif的胰島素在干燥過程中α-螺旋的數目幾乎保持不變，β-轉角雖有增加，但明顯低于未加任何保護劑的胰島素體系（圖3B），該結果與圖2中的三維活性結構圖一致。說明LEA-motif對胰島素在干燥過程中的二級結構也有較好的保護效果。從圖3可以看出，添加24條LEA-motif的胰島素α-螺旋在不同水分含量下保持的最穩定，二級結構維持最佳。綜合α-螺旋和β-轉角數目的變化趨勢圖，隨著干燥程度的增加，α-螺旋數目減少，而β-轉角有所遞增，說明胰島素并不是越干越好，而是有一個最佳的水分含量范圍。胰島素的結構特點決定，如果偏離了這個水分含量，都會引起一定程度的變性。

圖3　有/無LEAM保護下干燥的胰島素中的二級結構變化柱狀圖Fig.3　Secondary structure of insulin with/without LEAM protectants

2.3胰島素體系內的氫鍵分析

保護劑對蛋白藥物的保護作用主要是通過分子間相互作用實現的。其中，氫鍵相互作用是主要的分子間相互作用。在干燥過程中，隨著水分含量的減少，保護劑與胰島素之間形成的氫鍵增多（圖4A），說明LEA-motif能迅速適應缺水環境，形成適應胰島蛋白的形狀，較好地吸附在其表面，形成保護層，保護胰島素不因缺水而受到傷害，很好地維持胰島素的活性結構，這與水替代學說基本一致［15］。再者，蛋白質多肽主鏈中形成的氫鍵決定蛋白質的二級結構，有LEA-motif保護的胰島素主鏈間的氫鍵數目相對比較穩定，且比未加任何保護劑的胰島素主鏈間形成的氫鍵數目多（圖4B），主鏈間穩定的氫鍵可以保護胰島素的二級結構不被破壞，更說明LEA蛋白特征重復片段能維持三維結構的穩定性。

圖4　胰島素體系內氫鍵數目柱形圖Fig.4　H-bonding number of insulin system

2.4效價分析

有文獻［16］表明，胰島素的效價測定可采用HPLC，通過峰面積計算得到。所以本文通過HPLC測定效價，從而分析胰島素凍干前后的活性變化。

在分子模擬研究中，采用胰島素單體，而在本驗證實驗中，采用豬胰島素六聚體作為實驗對象，研究LEA-motif在干燥過程中對胰島素的保護效果。這主要是因為豬胰島素在制備過程中，利用鋅離子沉淀法使胰島素形成六聚體，可避免胰島素一定程度的失活，保證高產，然而，若模擬采用六聚體的話，體系分子量太大，且計算耗費時間太長。另外更重要的是，LEA-motif對胰島素六聚體在凍干過程中的活性保護效果良好的話，那我們完全可以推論，LEA-motif對胰島素單體有更好的保護效果，與模擬結果一致。

表2　不同濃度保護劑的熱敏性藥物胰島素凍干前后生物活性變化情況Table 2　Results of potency of initial/dried insulin with/without LEA-motif

表2是未加保護劑的胰島素六聚體和添加1、2、3、4條LEA-motif的胰島素六聚體各體系（即胰島素單體與LEA-motif的摩爾比分別為1∶6、1∶12、1∶18、1∶24，與模擬一致）的3次平行實驗所得的峰面積和效價平均值，峰面積大小反應了胰島素六聚體干燥后的活性結構保護效果。然后根據表3中的峰面積大小計算胰島素在干燥前后的生物活性變化，如圖5所示。

圖5　添加LEAM的胰島素與未加保護劑的胰島素凍干后的活性變化Fig.5　Bioactivity of dried insulin with/without LEAM

從圖5可知，凍干后胰島素的效價均有所降低，說明胰島素在凍干過程中，受溫度和水分的影響，結構有輕微的變化。因為我們實驗用的胰島素是六聚體，與模擬采用的胰島素單體不同，所以實驗所用胰島素在凍干前后的結構變化程度與模擬得到的結果有一定的區別，但是，從實驗結果來看，胰島素在凍干前后還是有一定的結構變化的。對于未加保護劑的胰島素而言，模擬用的胰島素單體在干燥前后結構有顯著變化，活性完全喪失；在凍干實驗中，未加保護劑的胰島素凍干后效價降低了12%左右。然而，當添加了保護劑后，豬胰島素的效價比明顯提高了。這說明在凍干過程中，LEA-motif對胰島素的保護效果是顯而易見的。不論是對胰島素六聚體還是單體，LEA-motif都體現出良好的保護效果。

另外，圖中顯示，隨著LEA-motif濃度的增加，胰島素的效價有增加趨勢，當濃度達到1∶3條件下，胰島素的效價達到最高，此后隨著濃度的增加，胰島素效價值趨于平穩。說明胰島素進行冷凍干燥，并不是加越多的保護劑效果越好，應該適量的添加保護劑濃度，節約成本，并且又能很好地使胰島素活性結構得到保護。

3　結論

從分子模擬分析結果可知，LEA-motif在干燥過程中能有效限制胰島素的有害熱運動，很好的保護其生物活性結構。并且添加保護劑的胰島素的二級結構也得到了很好的保持，防止α-螺旋轉化為β-轉角及無規卷曲，說明添加保護劑的胰島素具有較高的結構穩定性。這主要是由于隨著水分含量的減少，LEA-motif逐漸取代水分子與胰島素形成氫鍵，形成適應胰島蛋白的形狀，吸附在胰島素表面，形成保護層，防止疏水基團外翻，保護了胰島素的活性結構。氫鍵及靜電相互作用對胰島素結構的穩定性起到了非常重要的作用。另外，從效價測定實驗也可以看出，與未加保護劑的胰島素相比，有LEA-motif保護的胰島素六聚體凍干后活性更好，更說明LEA-motif確實對胰島素具有良好的保護效果。總之，LEA-motif是一種有效的凍干保護劑。

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Investigation on bioactive protection of LEA-motif to insulin during desiccation

ZHANG Yan1，LI Dai-xi1，*，GUO Bai-song2，ZHAI Zhen1，LIU Li1，YANG Chun-sheng2，YU Hua-xing1
（1.Institute of Food Science and Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China；2.Lyophilization Lab，Shanghai Tofflon Science and Technology Co.，Ltd.，Shanghai 201108，China）

In the paper，insulin was taken as the model of heat-sensitive drugs，and LEA-motif as the bioactive protectant.Gromacs software with Gromos96（53a6）forcefield was adopted to investigate the LEA-motif protective effects on insulin by REMD molecular simulation method.Results showed a significant protective effect on 3D structure and secondary structure of insulin with the presence of LEA-motif.In addition，the potency experiment by HPLC showed the bioactivity of the rehydrated insulin with LEA-motif was higher than that of the rehydrated insulin without any protectant.In a word，LEA-motif had shown its great application value as a drying protectant for heat-sensitive protein drugs.

insulin；LEA-motif；molecular simulation；bioactive protection of desiccation；structure stability；potency

TS201.2

A

1002-0306（2015）02-0177-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.029

2014－04－14

張燕（1988-），女，碩士研究生，研究方向：熱敏性藥物的凍干保護。

李代禧（1975-），男，博士，副教授，研究方向：計算生物學。

國家自然科學基金（51076108）；上海市國際合作項目（12430702000）；上海市自然科學基金（12ZR1420400）；上海市聯盟計劃項目及上海市重點學科項目（T0503和P0502）。