不同乳酸菌純種發酵蘿卜過程中品質的動態變化

侯曉艷，陳安均，羅　惟，董　維，牛凱莉，彭易濤（四川農業大學食品學院，四川雅安625014）

不同乳酸菌純種發酵蘿卜過程中品質的動態變化

侯曉艷，陳安均*，羅惟，董維，牛凱莉，彭易濤
（四川農業大學食品學院，四川雅安625014）

以白蘿卜為主要原料，利用植物乳桿菌、短乳桿菌、腸膜明串珠菌、戊糖片球菌進行純種發酵，并以自然發酵蘿卜為對照，對發酵過程中泡蘿卜的總酸及氨基態氮、亞硝酸鹽、脆度4個理化指標進行動態測定，同時利用頂空固相微萃取和氣質聯用方法對發酵成熟的泡蘿卜的揮發性風味物質進行測定。結果表明，接種發酵可以明顯的縮短發酵周期，提升產品品質。

乳酸菌，發酵，品質，動態變化

泡菜是指蔬菜在一定濃度的食鹽溶液中，借助于天然附著在其表面的微生物或人工接種的乳酸菌等，利用蔬菜中的可發酵糖類等營養物質發酵產酸，同時利用食鹽的高滲透壓，共同抑制泡菜中其他有害微生物的生長，另外還伴隨著乙醇發酵和醋酸發酵等一系列生化反應而形成的有特殊風味的發酵制品［1］。研究發現經常食用泡菜可達到防病治病、保?。?］和延年益壽［3］的功效。

20世紀60年代歐洲的C S Pederson和M N Aibury［4］率先將純種發酵技術應用于泡菜研究。Choi等［5］從韓國泡菜中分離出梓檬色的明串珠菌，將其用于泡菜純種發酵，可以獲得品質良好的泡菜并能延長產品的貨架期。葉淑紅［6］利用從酸菜汁中分離出的植物乳桿菌發酵黃瓜泡菜，最短發酵周期只需要36h。趙歷等［7］驗證了植物乳桿菌純種發酵甘薯泡菜的可行性，經過發酵條件的優化后，得到了色澤好、質地脆、口感佳、營養豐富的泡菜新產品。陸利霞等［8］以自行分離的植物乳桿菌B2進行單一菌株發酵劑接種制作蘿卜泡菜，通過比較發酵周期、發酵酸度、pH、OD值等，各指標均優于自然發酵泡菜。

本研究通過對幾種乳酸菌純種發酵蘿卜過程中的理化指標進行動態測定，進而揭示其品質變化規律，為泡菜工業化生產提供一定的理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）來自本系微生物實驗室；短乳桿菌（Lactobacillus brevis）SICC1.1161、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）SICC1.521購于四川省微生物資源平臺菌種保藏中心；新鮮白蘿卜購于雅安市農貿市場；泡菜壇（4L） 購于雅安市農貿市場；基礎培養基（MRS） 葡萄糖20.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，檸檬酸氫二銨2.0g，吐溫80 1.0mL，乙酸鈉5.0g，磷酸氫二鉀2.0g，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.25g，瓊脂18.0g，蒸餾水1000mL。

Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀、HP-5MS彈性石英毛細管柱（30m×0.25mm，0.25μm）美國Agilent公司；Supleco固相微萃取裝置、65μm DVB/PDMS萃取頭、1μL微量進樣器美國SUPELCO公司；HHS-2S型電子恒溫不銹鋼水浴鍋上海光地儀器設備有限公司；DZTW調溫電熱套北京市永光明醫療儀器廠；SHB-III型循環水多用真空泵菏澤市鑫源儀器儀表有限公司；同時蒸餾萃取裝置北京玻璃儀器廠；RE-52-99旋轉蒸發器上海亞榮生化儀器廠；TA-XT-Plus質構儀英國Stable Micro System公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌種活化凍干菌種活化：用75%酒精棉擦拭裝有菌種的安瓿管，在酒精燈火焰上燒熱安瓿管封口處，并立即在安瓿管封口處滴一滴無菌水，使其前端炸開，用無菌吸管吸取0.3～0.4mL的無菌MRS液體培養基于安瓿管中，使凍干菌體充分溶解成為懸浮狀液體。取0.2mL的菌懸液，轉接到MRS液體培養基里，37℃培養18～24h，重復兩次。

1.2.2發酵種子液的制備將活化好的凍干菌種轉接于MRS液體培養基37℃培養24h；發酵種子液經離心（8000r/min，15min，4℃）后用生理鹽水制成菌懸液備用。

1.2.3蘿卜汁培養基的制備蘿卜汁培養基：300mL蘿卜汁（100g蘿卜可得到100mL蘿卜汁，10000r/min，10min，4℃），蛋白胨10g，葡萄糖20g，pH6.5～6.8，700mL蒸餾水。

1.2.4泡蘿卜制作工藝流程［9］新鮮白蘿卜→清洗→殺菌（紫外照射0.5h）→晾干→切分→稱質量→加入無菌鹽水（濃度為4%）→接種乳酸菌純培養液（108CFU/mL）→入壇發酵（25℃）→泡菜成品。

1.2.5發酵終點的確定由于泡菜發酵終點的確定沒有相應的國家標準可執行，因此本實驗擬采用口感與酸度相結合的方法進行判定。當泡菜總酸含量在0.4%～0.6%范圍時，蘿卜生辣味消失、酸度適宜，質地脆嫩時，表明泡菜已經基本成熟［9］。

1.2.6單菌種發酵性能的測定在蘿卜汁培養基中接種已經活化的各菌株并在37℃培養每隔8h取樣測定其OD值。

按1.2.4所述工藝泡制蘿卜，以未接種的自然發酵蘿卜為對照，每天定時取樣測定以下指標：

1.2.6.1脆度用質構儀測定；測試條件如下：力量感應元5kg，探頭P/5，測前速率2mm/s，測試中速率2mm/s，測后速率10mm/s，壓縮距離：5mm，數據采集率：500pps，觸發力5g。

1.2.6.2總酸采用GB/T 12456《食品中總酸的測定》［10］的方法進行測定。

1.2.6.3亞硝酸鹽含量采用GB 5009.33-2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》［11］的方法進行測定。1.2.6.4氨基態氮采用甲醛滴定法［12］測定。

1.2.6.5揮發性風味物質采用固相微萃取技術及氣質聯用（SPME/GC-MS）對發酵成熟的泡蘿卜進行揮發性風味成分的檢測。

1.2.7揮發性風味成分的檢測SPME頂空微萃取操作方法：將發酵成熟的蘿卜勻漿并取5.000g樣品置于15mL樣品瓶中，置于43℃的恒溫水浴鍋中平衡30min，然后將SPME手動進樣柄的針頭插入進樣瓶中，伸出纖維于上空的氣體中萃取30min，縮回纖維，并迅速將萃取頭插入氣相色譜儀進樣口，伸出纖維頭解析5min后縮回，取出萃取頭，進行分析［13］。

色譜條件：色譜柱為 HP-5MS（30m×0.25mm，0.25μm）彈性石英毛細管柱；程序升溫：柱箱初始溫度36℃，保持3min，以5℃/min升至65℃，保持1min，以3℃/min升至108℃，保持1min，以2℃/min升至110℃，保持1min，以3℃/min升至155℃，保持1min，以20℃/min升至200℃，保持3min；不分流進樣；載氣He，流量1.2mL/min；進樣口溫度250℃；輔助加熱器溫度280℃。

質譜條件：電子能量70eV，離子源溫度230℃，接口溫度280℃，質量掃描范圍：m/z 50～550amu。

定性定量分析：由GC-MS得到的圖譜，經計算機在NIST.11譜庫檢索，僅報道匹配度大于80的鑒定結果，并采用峰面積歸一化法計算各成分的相對含量。

2　結果與分析

2.1不同乳酸菌在蘿卜汁培養基中的OD值變化情況

圖1顯示了4種乳酸菌在蘿卜汁培養基中OD值的變化情況。顯然，植物乳桿菌的生長速度明顯高于其他3種菌體，短乳桿菌次之，腸膜明串珠菌和戊糖片球菌相當。

圖1　不同乳酸菌在蘿卜汁培養基中OD值變化曲線Fig.1　Dynamic change of OD value by different lactic acid bacteria

2.2不同乳酸菌純種發酵蘿卜過程中總酸含量的動態變化

圖2顯示了分別接種腸膜明串珠菌、短乳桿菌、戊糖片球菌和植物乳桿菌發酵蘿卜以及自然發酵蘿卜過程中總酸含量的動態變化?？偟膩碚f，自然發酵和接種乳酸菌發酵蘿卜總酸含量均是逐漸增多，并且發酵前期的增加速度高于后期。從產酸總量來說，植物乳桿菌產酸量最大，其次是短乳桿菌，然后是戊糖片球菌和腸膜明串珠菌，自然發酵產酸量最低，可見接種發酵能夠加快發酵速度縮短發酵周期，這一點對于工業化生產十分有利。

2.3不同乳酸菌純種發酵蘿卜過程中氨基態氮的動態變化

圖3顯示了不同乳酸菌純種發酵蘿卜過程中氨基態氮含量的動態變化。隨著發酵的進行氨基態氮的含量在不斷的下降。這可能的原因是蘿卜中的肽、氨基酸等在發酵過程中不斷的溶入到泡菜汁中被各種微生物利用。

圖2　不同乳酸菌純種發酵蘿卜過程中總酸含量的動態變化Fig.2　Dynamic change of total acid by different lactic acid bacteria

圖3　不同乳酸菌純種發酵蘿卜過程中氨基態氮含量的動態變化Fig.3　Dynamic change of amino nitrogen content by different lactic acid bacteria

2.4不同乳酸菌純種發酵蘿卜過程中亞硝酸鹽含量的動態變化

泡菜在發酵過程中，蔬菜本身的硝酸鹽被硝酸還原酶還原成亞硝酸鹽。人體攝入亞硝酸鹽后，亞硝酸與胃中的含氮化合物結合成具有致癌性的亞硝胺［14］，對人體健康造成極大危害。

圖4　不同乳酸菌純種發酵蘿卜過程中亞硝酸鹽含量的動態變化Fig.4　Dynamic change of nitrite content by different lactic acid bacteria

從圖4可知，接種4種乳酸菌發酵過程中均沒有出現明顯的亞硝峰，而自然發酵在第3d出現亞硝峰，最高含量達30.459mg/kg，之后逐漸下降，至第7d時，接種發酵的蘿卜泡菜中亞硝酸鹽含量均低于自然發酵。由此可見，接種發酵可以有效降低泡菜中亞硝酸鹽含量，保證了泡菜的食用安全性。

圖5　不同乳酸菌純種發酵蘿卜過程中脆度的動態變化Fig.5　Dynamic change of brittleness by different lactic acid bacteria

2.5不同乳酸菌純種發酵蘿卜過程中脆度的動態變化

脆度值是質構儀模仿人咀嚼蘿卜時，蘿卜斷裂時需要的力的大?。?5］。力越大說明蘿卜越脆。由圖5可知，自然發酵和接種發酵過程中脆度變化是一致的，均是隨著發酵的進行蘿卜脆度逐漸減小。發酵成熟時（總酸含量達到0.5%）脆度大小依次為：短乳桿菌＞腸膜明串珠菌＞植物乳桿菌＞戊糖片球菌＞自然發酵，由此可見接種發酵的蘿卜脆度優于自然發酵，這與汪立平等［16］的研究結果一致。

2.6不同乳酸菌純種發酵蘿卜揮發性風味物質的比較

運用SPME-GC/MS對酸度達到0.5%［17］（以乳酸計）的植物乳桿菌發酵蘿卜、短乳桿菌發酵蘿卜、腸膜明串珠菌發酵蘿卜、戊糖片球菌發酵蘿卜的揮發性風味物質進行檢測，結果如表1所示。檢測出5種泡蘿卜成品中揮發性風味物質達51種，在頂空溫度43℃條件下，烯類、酯類、酮類是泡蘿卜中含量較多的揮發性成分。一般來說，泡菜中的風味物質主要有兩大來源，一是泡菜原料（蔬菜和香辛料）本身的風味物質，二是乳酸菌及其他微生物發酵產生的風味物質。

據陳功等［17］的研究表明，醇類和酯類風味閾值較大，故其對泡菜的風味影響較小，而二甲基硫化物、烯類、醛類由于閾值較小，即使含量很少對泡菜的風味也有很大的影響。

此外，由表1可以看出，自然發酵蘿卜產生的風味物質較多但是含量都比較低，主要是因為自然發酵過程中微生物菌系比較豐富，產生了多種多樣的中間代謝產物，利于多種物質的合成。自然發酵蘿卜中羅勒烯、萜品油烯、沉香醇等蔬菜本身所帶的揮發性物質，相比于接種發酵蘿卜中此類物質，含量大大減少，其原因可能是自然發酵需要較長的時間才能達到所需要的酸度（0.5%），較長的發酵周期使得蔬菜本身的揮發性物質減少甚至消失，由此可見，接種發酵能夠明顯地縮短發酵周期，從而有效的保存蔬菜本身的香氣成分。

3　結論

對4種乳酸菌（植物乳桿菌、短乳桿菌、腸膜明串珠菌、戊糖片球菌）發酵蘿卜以及自然發酵蘿卜過程進行動態監測，由測得數據分析可知，發酵過程中總酸含量呈不斷上升的趨勢，第6、7d趨于平緩，產酸速率最大的為植物乳桿菌，其次是短乳桿菌，腸膜明串珠菌和戊糖片球菌相當，自然發酵產酸速率最??；發酵過程中氨基態氮、脆度均呈下降趨勢，且發酵成熟時脆度大小依次為：短乳桿菌＞腸膜明串珠菌＞植物乳桿菌＞戊糖片球菌＞自然發酵；整個發酵過程中，只有自然發酵蘿卜中亞硝酸鹽含量在第3d出現亞硝峰，接種發酵均未出現亞硝峰；泡蘿卜中揮發性風味物質主要是烯類、酯類和酮類，自然發酵蘿卜產生的風味物質相比接種發酵稍多，但是由于自然發酵周期較長，蔬菜本身的一些對風味影響較大的揮發性物質含量大大減少，由此可見，接種發酵可以大大縮短發酵周期，最大程度的保持蔬菜原有的風味成分。

表1　不同乳酸菌發酵蘿卜主要揮發性成分及相對含量Table 1　Main volatile composition and relative content by different lactic acid bacteria

續表

［1］何淑玲，李博，籍保平.泡菜中亞硝酸鹽問題的研究進展［J］.食品與發酵工業，2009，31（11）：85-87.

［2］李書華，蒲彪，陳封政.泡菜的功能及防腐研究進展［J］.中國釀造，2005（4）：6-8.

［3］Heui D.Antimutagenic activity of lactobacillus plantarum KLAB21 is isolated from kimchi Korean fermented vegetables［J］. Biotechnology Letters，2001，23（19）：1583-1589.

［4］PERDERSON S C.The effect of pure culture inoculation on fermentation of cucumbers［J］.Food Technology，1961，15：351-354.

［5］Choi I K，Jung S H，Kim B J，et al.Novel Leuconostoc citreum starter culture system for the fermentation of kimchi，a fermented cabbage product［J］.Antonie van Leeuwenhoek，2003，84（4）：247-253.

［6］葉淑紅.植物乳桿菌的篩選及其在泡菜中的應用［J］.中國釀造，2004（7）：19-21.

［7］趙歷.植物乳桿菌發酵甘薯泡菜的研究［J］.安徽農業科學，2010（14）：7516-7517，7524.

［8］陸利霞，王曉飛，熊曉輝，等.植物乳桿菌b2純種發酵蘿卜泡菜的研究［J］.食品工業科技，2005，26（7）：59-61.

［9］敖曉琳.四川泡菜中兩株優良乳酸菌的鑒定及不同發酵條件對其發酵泡菜品質的影響［J］．食品科學，2011，32（11）：152-156．

［10］GB/T 12456-2008食品中總酸的測定［S］.

［11］GB 5009.33-2010食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定［S］.

［12］楊瑞，李博，籍保平.泡菜中亞硝酸鹽問題的研究進展［J］.食品與發酵工業，2009，31（11）：85-87.

［13］張金鳳，蒲彪，陳安均.SDE和HS-SPME結合GC-MS分析傳統四川泡蘿卜的揮發性成分［J］.食品工業科技，2014，35（15）：297-303.

［14］張少穎.不同處理方法對泡菜發酵過程中亞硝酸鹽含量的影響［J］.中國食品學報，2011，11（1）：132-134.

［15］樂毅，劉學文.白蘿卜泡菜保脆工藝研究［J］.食品與發酵科技，2011，47（2）：78-80.

［16］汪立平，汪欣，艾連中.純種植物乳桿菌發酵低鹽蘿卜泡菜的研究［J］.食品科學，2013，34（17）：182-186.

［17］陳功，張其圣，余文華，等.四川泡菜揮發性成分及主體風味的研究（二）［J］.中國釀造，2012，12：21-23

Dynamic changes of quality of pickles fermented by different lactic acid bacteria

HOU Xiao-yan，CHEN An-jun*，LUO Wei，DONG Wei，NIU Kai-li，PENG Yi-tao
（College of Resources and Environment，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

Using carrots as the main material to preserve pickles by Lactobacillus plantarum，Lactobacillus brevis，Leuconostoc mesenteroides and Pediococcus pentosaceus，at the same time，the natural fermentation radish for comparison.Total acid and amino nitrogen，nitrite，brittleness four physical and chemical indicators were determined and the volatile flavor substances were determined by solid phase micro-extraction and gas chromatography-mass spectrometry（SPME-CC/MS）.The results showed that the breed fermentation could significantly shorten the fermentation period and improve product quality.

lactic acid bacteria；fermentation；quality；dynamic changes

TS255.54

A

1002-0306（2015）02-0181-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.030

2014－05－22

侯曉艷（1990-），女，在讀碩士研究生，研究方向：農產品加工與貯藏。

陳安均（1970-），男，博士，副教授，研究方向：園藝產品加工與貯藏。

國家自然科學基金項目（31171726）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD31B04）。