黑小麥麩皮戊聚糖的酶法提取工藝條件優(yōu)化與理化性質(zhì)分析

孫元琳，儀　鑫，王　鋒，宋　昱，張隴清（.運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系，山西運(yùn)城044000；.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原00006；.山西省農(nóng)科院棉花研究所，山西運(yùn)城044000）

黑小麥麩皮戊聚糖的酶法提取工藝條件優(yōu)化與理化性質(zhì)分析

孫元琳1，儀鑫2，王鋒1，宋昱3，張隴清1
（1.運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系，山西運(yùn)城044000；2.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；3.山西省農(nóng)科院棉花研究所，山西運(yùn)城044000）

研究了黑小麥麩皮戊聚糖的酶法提取工藝條件，并對(duì)其單糖組成和相對(duì)分子質(zhì)量等理化性質(zhì)進(jìn)行分析。運(yùn)用單因素實(shí)驗(yàn)方法，分析了提取工藝中料液比、加酶量、提取溫度、溶液pH、提取時(shí)間對(duì)戊聚糖提取率的影響，并通過正交實(shí)驗(yàn)對(duì)其工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了酶法提取戊聚糖的最佳工藝參數(shù)為：加酶量12mg/10g底物、提取溫度60℃、提取時(shí)間90min、溶液pH6、料液比1∶10（g/mL）。在此條件下，戊聚糖的提取率為4.17%。通過氣相色譜（GC）和高效液相色譜（HPLC）分析了黑小麥麩皮酶提戊聚糖EEP的理化性質(zhì)。結(jié)果表明，EEP主要由阿拉伯糖（Ara）、木糖（Xyl）和葡萄糖（Glc）組成，并含有微量半乳糖（Gal），其摩爾比為Ara∶Xyl∶Glc=1.0∶1.55∶3.19，Ara/Xyl比值為0.64。EEP的相對(duì)分子質(zhì)量為2.16×104。

黑小麥，戊聚糖，酶法提取，正交實(shí)驗(yàn)

黑小麥?zhǔn)呛瘫究埔荒晟耘喙任铮渥蚜３首仙⑺{(lán)色、紫黑色、深褐色或接近于黑色。黑小麥來源于小麥的遠(yuǎn)緣雜交后代，是通過屬間遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)培育而成的一種黑粒小麥新品種。它不僅具有普通小麥的一般特征，還具有獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)和保健功能，主要用于制作饅頭、面包、麥片、掛面等傳統(tǒng)食品，已成為一類重要的黑色食品資源［1］。

黑小麥麩皮富含膳食纖維，其中，戊聚糖含量豐富［2］。戊聚糖具有高粘度、高持水力、氧化交聯(lián)等性質(zhì)，是影響谷物加工過程及產(chǎn)品品質(zhì)的重要功能性成分［3］。戊聚糖作為一種功能性多糖，還具有潤(rùn)腸通便、降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)人體免疫力、預(yù)防結(jié)腸癌等多種生理功能［4］。因此，以黑小麥麩皮為原料制備戊聚糖，將其開發(fā)為天然的品質(zhì)改良劑或天然保健食品功能因子，對(duì)預(yù)防慢性代謝性疾病、保障人體健康起著重要作用。

表1　酶法提取戊聚糖單因素實(shí)驗(yàn)Table 1　Single-factor experiments for enzymatic extraction of pentosan

黑小麥麩皮結(jié)構(gòu)致密，戊聚糖、β-葡聚糖、纖維素和木質(zhì)素等膳食纖維緊密締合，構(gòu)成致密的細(xì)胞壁網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)［2，5］。因此，黑小麥麩皮的可溶性戊聚糖含量較低，而不溶性戊聚糖含量較高，從而限制了黑小麥戊聚糖在食品體系中的應(yīng)用。特異性戊聚糖酶有助于解除細(xì)胞壁聚合物分子間的締合作用，促進(jìn)細(xì)胞壁降解、結(jié)構(gòu)疏松，有利于戊聚糖的溶出，使一部分不溶性戊聚糖轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄晕炀厶牵岣吡宋炀厶堑奶崛÷剩?］。本實(shí)驗(yàn)以黑小麥麥麩為原料，利用戊聚糖酶提取水不溶性戊聚糖，運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)其工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其單糖組成和相對(duì)分子質(zhì)量等理化性質(zhì)進(jìn)行分析，進(jìn)而為黑小麥特色谷物資源的有效增值和綜合利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

黑小麥產(chǎn)自山西省運(yùn)城市，由山西省農(nóng)科院棉花研究所提供；戊聚糖酶（E.C.3.2.1.8，2.5U/mg，from Thermomyces lanuginosus）Sigma公司；牛血清蛋白、三氟乙酸、苯酚、濃硫酸、95%乙醇、無水乙醇等均為分析純。

GC-14A型氣相色譜儀日本Shimadzu公司；Waters 2690型高效液相色譜儀美國(guó)Waters公司；722分光光度計(jì)上海精科分析儀器廠；RE52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1原料預(yù)處理將黑小麥麩皮粉碎，過40目篩。用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液于80℃熱處理原料2次，抽濾，真空干燥。經(jīng)乙醇預(yù)處理的黑小麥麥麩于100℃熱水提取水溶性戊聚糖2次，離心（3000r/min，15min），所得殘留物經(jīng)95%乙醇反復(fù)洗滌，抽濾，然后在45℃條件下真空烘干，備用。

1.2.2酶法提取工藝預(yù)處理黑小麥麩皮10g在加入一定量戊聚糖酶（E.C.3.2.1.8，2.5U/mg）的50mmol/L醋酸緩沖液中提取2次；離心（3000r/min，15min），合并上清液；上清液真空濃縮，加入3倍95%乙醇，4℃靜置過夜，離心，沉淀復(fù)溶，透析，冷凍干燥，得到黑小麥酶提戊聚糖EEP。

1.2.3含量測(cè)定方法多糖含量測(cè)定：苯酚－硫酸法［7］。戊聚糖含量測(cè)定：間苯三酚－冰醋酸法［8］。蛋白質(zhì)含量測(cè)定：Lowry法［9］。

1.2.4戊聚糖提取率的計(jì)算

1.2.5單因素實(shí)驗(yàn)分別考察料液比、戊聚糖酶的添加量、提取溫度、溶液pH、提取時(shí)間等主要因素對(duì)戊聚糖提取效果的影響，具體單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

1.2.6正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，研究戊聚糖酶添加量、提取時(shí)間、提取溫度、溶液pH的交互作用對(duì)戊聚糖提取率的影響，優(yōu)化黑小麥麩皮戊聚糖酶法提取工藝，實(shí)驗(yàn)因素及水平見表2。

表2　正交實(shí)驗(yàn)因素和水平表Table 2　Factors and levers for orthogonal experiment

1.2.7單糖組成分析將戊聚糖樣品5mg溶于2mol/L的三氟乙酸（TFA）溶液，于100℃水解4h。水解液除盡過量的TFA后，采用糖腈乙酸酯衍生化法衍生。反應(yīng)產(chǎn)物直接進(jìn)樣作氣相色譜分析，根據(jù)出峰時(shí)間判斷單糖種類，根據(jù)峰面積的比值確定各單糖間的比例關(guān)系。采用DB-1701毛細(xì)管色譜柱（0.53mm×30m），載氣為N2，流速1.5mL/min，F(xiàn)ID氫焰檢測(cè)器，汽化室溫度260℃，檢測(cè)器溫度260℃。采用程序升溫：起始溫度120℃（2min）→195℃（10℃/min，1min）→240℃（3℃/min，10min）。進(jìn)樣量：0.8μL。

1.2.8相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定采用色譜柱Waters UltrahydrogelTMLinear（7.8mm×300mm），檢測(cè)器為Waters 2410示差折光檢測(cè)器。以0.1mol/L NaNO3為流動(dòng)相，流速0.9mL/min，柱溫45℃。將相對(duì)分子質(zhì)量分別為16500、26290、40000、84000、158000的標(biāo)準(zhǔn)Dextran相繼進(jìn)樣，記錄保留時(shí)間TR，以TR為橫坐標(biāo)，lgM為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。待測(cè)樣品溶于水，進(jìn)樣20μL，根據(jù)所得TR，通過回歸方程計(jì)算多糖的相對(duì)分子質(zhì)量。

2　結(jié)果與討論

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1料液比對(duì)戊聚糖提取率的影響料液比對(duì)提取率的影響結(jié)果見圖1。由于黑小麥麩皮戊聚糖酶法提取液粘度不高，料液比在1∶10～1∶14范圍內(nèi)，并沒有隨著料液比的提高而有明顯變化，另外還加大了水的消耗，增加后續(xù)工藝處理的時(shí)間和費(fèi)用。因此，確定提取過程料液比1∶10作為最佳料液比。

圖1　料液比對(duì)提取率的影響Fig.1　Effect of ratio of powder and water on extraction rate

2.1.2戊聚糖酶添加量對(duì)戊聚糖提取率的影響酶添加量對(duì)戊聚糖提取率的影響結(jié)果見圖2。圖2顯示，當(dāng)戊聚糖酶添加量小于12mg時(shí)，戊聚糖的提取率隨著戊聚糖酶添加量的增加而逐漸增加。當(dāng)戊聚糖酶添加量超過12mg時(shí)，戊聚糖的提取率逐漸降低。這是由于，一方面戊聚糖酶作為一種細(xì)胞壁物質(zhì)分解酶，可使黑小麥麩皮致密的細(xì)胞壁發(fā)生降解而變得松散，促進(jìn)了戊聚糖的溶出，并使麩皮中的水不溶性戊聚糖（WIP）發(fā)生降解，相對(duì)分子質(zhì)量降低，溶解度發(fā)生改變，一部分WIP變?yōu)樗苄晕炀厶牵╓SP），從而使WSP提取率增加。另一方面，隨著戊聚糖酶添加量的繼續(xù)增加，酶解程度加劇，將WSP進(jìn)一步降解為較低分子量的低聚糖，反而使戊聚糖的提取率下降。因此，確定提取過程戊聚糖酶添加量的正交水平為6、12、18mg。

圖2　酶添加量對(duì)提取率的影響Fig.2　Effect of enzyme quantity on extraction rate

2.1.3提取時(shí)間對(duì)戊聚糖提取率的影響從圖3可以看出，在戊聚糖的酶法提取過程中，當(dāng)提取時(shí)間小于90min時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，戊聚糖的提取率逐漸增加；之后隨著提取時(shí)間的增加，戊聚糖提取率的增加量變化趨于平緩。當(dāng)提取時(shí)間超過于120min時(shí)，戊聚糖提取率有所下降。這是由于隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，溶出的戊聚糖分子發(fā)生部分降解，使得提取率隨之下降。由此，確定戊聚糖酶法提取時(shí)間的正交水平為60、90、120min。

圖3　提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.3　Effect of extraction duration on extraction rate

2.1.4pH對(duì)戊聚糖提取率的影響pH對(duì)戊聚糖提取率的影響結(jié)果見圖4。圖4結(jié)果顯示，酶法提取黑小麥麩皮戊聚糖的最適pH為6左右。當(dāng)pH＜6時(shí)，戊聚糖提取率隨著溶液pH的增大而逐漸增加；當(dāng)pH＞6時(shí)，戊聚糖的提取率隨pH的增加而逐漸降低。這是由于溶液pH過大或過小都會(huì)偏離戊聚糖酶的最適pH，不同程度影響了戊聚糖酶的酶活力，從而降低了戊聚糖提取率。由此，確定戊聚糖酶法提取溶液pH的正交水平為pH5、6、7。

圖4　溶液pH對(duì)提取率的影響Fig.4　Effect of pH on extraction rate

2.1.5提取溫度對(duì)戊聚糖提取率的影響從圖5可以看出，在戊聚糖的酶法提取過程中，最佳的提取溫度范圍在40～50℃之間。當(dāng)提取溫度低于40℃時(shí)，戊聚糖提取率隨提取溫度升高，增加明顯；當(dāng)提取溫度高于40℃時(shí)，戊聚糖提取率逐漸降低。這是由于40～50℃為戊聚糖酶的最適溫度，酶的活性在此溫度下達(dá)到最大，所以戊聚糖提取率也最大，而溫度過高或過低都會(huì)影響酶的活力，使戊聚糖的提取率下降。由此，確定戊聚糖酶法提取溫度的正交水平為40、50、60℃。

圖5　提取溫度對(duì)提取率的影響Fig.5　Effect of temperature on extraction rate

2.2正交實(shí)驗(yàn)

以戊聚糖酶添加量、提取時(shí)間、提取溫度、溶液pH作為正交實(shí)驗(yàn)因素，以戊聚糖提取率為響應(yīng)值，采用L9（34）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)黑小麥麩皮戊聚糖的酶法提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定戊聚糖的最佳酶法提取工藝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3　Design and results of orthogonal experiment

由表3正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，影響戊聚糖提取率因素的主次順序?yàn)椋杭用噶浚咎崛囟龋救芤簆H＞提取時(shí)間。黑小麥麩皮戊聚糖酶法提取的理想工藝條件為實(shí)驗(yàn)號(hào)6，即A2B3C1D2。在此條件下，戊聚糖的提取率最高，為4.12%。另一方面，極差分析結(jié)果表明，戊聚糖酶法提取的適宜工藝條件為A2B3C2D2。在此條件下，測(cè)得的戊聚糖提取率為4.17%，高于在A2B3C1D2條件下戊聚糖的提取率。因此，確定黑小麥麩皮戊聚糖酶法提取的最適工藝參數(shù)為A2B3C2D2，即加酶量12mg/10g底物、提取溫度60℃、提取時(shí)間90min、溶液pH6。在此條件下，戊聚糖的提取率為4.17%。

2.3單糖組成分析

分析了優(yōu)化工藝條件所得酶提戊聚糖EEP組分的化學(xué)組成和單糖組成，結(jié)果如表4所示。從表中可以看出，EEP的多糖含量和戊聚糖含量分別為70.44%和67.25%，且含有9.32%的蛋白。以上結(jié)果表明，戊聚糖樣品還含有少量其他多糖組分以及非糖物質(zhì)。表4顯示，EEP主要由阿拉伯糖（Ara）、木糖（Xyl）和葡萄糖（Glc）組成，并含有微量半乳糖（Gal），其摩爾比為Ara∶Xyl∶Glc=1.0∶1.55∶3.19，且Ara/Xyl比值為0.64。單糖組成表明，酶法提取的戊聚糖樣品除了戊聚糖外，還含有一定量葡聚糖。葡聚糖作為黑小麥麩皮膳食纖維的一部分，在酶法提取過程中，隨著戊聚糖酶對(duì)細(xì)胞壁的降解被一同浸出。

表4　戊聚糖組分EEP的化學(xué)組成和單糖組成分析Table 4　Chemical and monosaccharide compositions of pentosan fraction EEP

2.4相對(duì)分子質(zhì)量分布

圖6　戊聚糖組分EEP的相對(duì)分子質(zhì)量分布Fig.6　Mw distribution of pentosan fraction EEP

采用HPGPC凝膠色譜柱對(duì)EEP組分的相對(duì)分子質(zhì)量分布進(jìn)行測(cè)定。圖6顯示，EEP組分的凝膠柱洗脫曲線為單一峰，相對(duì)分子質(zhì)量為2.16×104。從圖6看出，單一峰還存在一小峰肩，結(jié)合單糖組成分析結(jié)果，推斷所制備的戊聚糖樣品還含有少量葡聚糖。與黑小麥麩皮堿提戊聚糖組分的相對(duì)分子質(zhì)量比較（3.81×105）［2］，酶提戊聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量較低。

3　結(jié)論

酶法提取黑小麥麩皮戊聚糖的最佳工藝條件為：加酶量12mg/10g底物、提取溫度60℃、提取時(shí)間90min、溶液pH6、料液比1∶10（g/mL）。在此條件下，黑小麥麩皮戊聚糖的提取率為4.17%。

酶提戊聚糖EEP主要由阿拉伯糖（Ara）、木糖（Xyl）和葡萄糖（Glc）組成，并含有微量半乳糖（Gal），其摩爾比為Ara∶Xyl∶Glc=1.0∶1.55∶3.19，且Ara/Xyl比值為0.64。EEP的相對(duì)分子質(zhì)量為2.16×104。

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Optimization of enzymatic extraction process and physicochemical properties of pentosans from black-grained wheat bran

SUN Yuan-lin1，YI Xin2，WANG Feng1，SONG Yu3，ZHANG Long-qing1
（1.Department of Life Sciences，Yuncheng University，Yuncheng 044000，China；2.College of Life Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；3.Cotton Research Institute，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Yuncheng 044000，China）

To study the enzymatic extraction technique and the physicochemical properties of pentosans from black-grained wheat bran.The effect of xylanase quantity，extraction temperature，pH，time duration，ratio of material to liquid on the yield of pentosan were studied by single-factor experiments and the technology parameters were optimized by orthogonal experiment.The optimized parameters were：extracting for 90min at 60℃，pH6，with pentosanase quantity of 12mg/10g substrates and 1∶10 ratio of material to liquid.Under the optimum conditions，the yield of EEP was 4.17%.Physicochemical properties of EEP were analyzed using GC，and HPLC instruments.The results showed that EEP was composed mainly of arabinose，xylose，glucose，and trace amount of galactose，mole ratio of Ara∶Xyl∶Glc=1.0∶1.55∶3.19.The Ara/Xyl value was 0.64.It had a relative low Mw of 2.16×104.

black-grained wheat；pentosan；enzymatic extraction；orthogonal experiment

TS210.1

A

1002-0306（2015）02-0186-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.031

2014－03－11

孫元琳（1971－），女，博士，教授，研究方向：谷物資源綜合利用與開發(fā)。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31101244）；山西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012011031-1）；山西省高校優(yōu)秀青年學(xué)術(shù)帶頭人支持計(jì)劃；山西省高校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（2013340）；運(yùn)城學(xué)院院級(jí)產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目（CY-2012013）。