四種酵母甘露聚糖合成與釋放特性的比較

劉金龍，倪靖岳，趙國群，*，李志敏（.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊050000；2.河北省發酵工程技術研究中心，河北石家莊050000）

四種酵母甘露聚糖合成與釋放特性的比較

劉金龍1，2，倪靖岳1，趙國群1，2，*，李志敏1
（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊050000；2.河北省發酵工程技術研究中心，河北石家莊050000）

比較了產朊假絲酵母、畢赤酵母、面包酵母和啤酒酵母培養過程中細胞壁甘露聚糖的合成與釋放特性。結果表明：四種酵母的甘露聚糖合成均為生長偶聯型；不同類型酵母的甘露聚糖合成能力差異顯著（p＜0.05），合成能力最強的啤酒酵母細胞壁甘露聚糖含量最高可達0.62g/L發酵液，而合成能力最弱的畢赤酵母僅為0.47g/L發酵液。四種酵母的甘露聚糖最大釋放量均出現對數生長中期，并且不同類型酵母釋放效率差異較大，最高值畢赤酵母甘露聚糖釋放量達到了0.27g/L發酵液，最低值啤酒酵母僅有0.15g/L發酵液。乙醇顯著刺激四種酵母的甘露聚糖釋放（p＜0.05），其中對產朊假絲酵母的影響最顯著且在5%乙醇濃度下，與對照相比，其甘露聚糖釋放量和釋放率分別大幅提高了152%和120%。

酵母，甘露聚糖，合成，釋放

酵母甘露聚糖是酵母細胞壁外包被的一層具有生物活性的多糖聚合物，其主鏈由甘露糖以α-（1，6）糖苷鍵形成的糖鏈組成，主鏈上連有豐富的由α-1，2或α-1，3連接的支鏈［1-2］。通常酵母細胞壁的結構類似于三明治，外層為甘露聚糖，內層為β-葡聚糖，內外兩層細胞壁多糖均以共價鍵的形式與中間夾層的蛋白質分子相連。目前市售的甘露聚糖產品通常是由5%～20%蛋白質，80%～90%甘露糖組成，因此又稱之為甘露聚糖蛋白［3-6］。

酵母甘露聚糖是迄今發現的免疫功能最強的細胞壁多糖，它能顯著增加機體免疫力，刺激腸道益生菌生長、抑制和減少病原菌滋生，并具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等活性功能，是一種極具潛力的功能性食品與飼用添加劑［7-10］。另外，在葡萄酒釀造過程中，添加酵母甘露聚糖對酒的口感、香氣、色澤以及整體結構有很好的改善作用［11-13］。

鑒于顯著的生物活性和廣泛的應用前景，酵母甘露聚糖制備成為一個研究熱點，而掌握酵母甘露聚糖的合成與釋放的規律，是合理構建制備工藝的前提。酵母在液態培養過程中，細胞壁多糖-甘露聚糖合成與釋放的特性鮮有報道。鑒于此，本文選取廣泛應用于食品與飼料工業的產朊假絲酵母、畢赤酵母、面包酵母和啤酒酵母四種菌株作為研究對象，系統比較其酵母甘露聚糖合成與釋放的異同點，從中發掘共性規律，為后續制備工藝提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

產朊假絲酵母（Candida utilis）、面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）、畢赤酵母（pichia pastoris）和啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）由河北省發酵工程技術研究中心提供；蛋白胨、酵母浸膏、瓊脂粉購自上海國藥集團，BR級；硫酸、氫氧化鈉、碳酸鋇、葡萄糖購自天津江天化工技術有限公司，分析純；甘露糖購自Sigma，色譜純。

1220分析型高效液相色譜儀美國安捷倫科技有限公司；液相色譜柱Sugar-Pak I沃特世公司；752型紫外分光光度計上海光譜儀有限公司；ZWY-1102型雙層恒溫搖床上海智城分析儀器制造有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺蘇州安泰空氣技術有限公司；YXQ-LS-18SI型自動手提式滅菌器上海博訊實業有限公司醫療設備廠；XS-18型光學顯微鏡北京發恩科貿有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1培養基斜面培養基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸膏20，自然pH，瓊脂20；種子培養基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸膏20，自然pH；發酵培養基（g/L）：葡萄糖12，蛋白胨2，無水硫酸鎂0.5，K2HPO40.3，KH2PO40.3，尿素2，自然pH。

1.2.2培養方法

1.2.2.1種子培養將1～2環斜面酵母培養物接種至裝有50mL種子培養基的250mL三角瓶中培養，搖床轉速180r/min，溫度30℃，培養8～10h。

1.2.2.2發酵培養500mL三角瓶添加發酵培養基體積為100mL，接種量為10%，置于溫度為30℃轉速為180r/min的恒溫振蕩培養器中，培養3d。

1.2.3發酵液預處理取1mL發酵培養液，8000r/min離心10min，吸取0.1mL上清液，加入3mL的4mol/L硫酸100℃水解10h，甘露聚糖被降解為甘露糖，然后加入過量的碳酸鋇中和，離心取上清液，定容至10mL，0.2μm膜過濾，得到濾液1備用；發酵液離心得到的菌體沉淀物采用與上清液相同方式的處理后，得到濾液2備用。

1.2.4甘露聚糖濃度測定以甘露糖為標準品，HPLC法測定濾液1和濾液2的甘露聚糖濃度，采用沃特世公司Sugar-Pak I色譜柱，示差折光檢測器（RID）檢測，流動相為純水，流速0.5mL/min，進樣量20μL，柱溫80℃。標準曲線方程為y=362583x-467.26（R2= 0.9998）。

1.2.5菌體干重測定取1mL發酵培養液，8000r/min離心10min，離心的發酵液沉淀物在80℃烘箱中烘干至恒重為菌體干重。

1.2.6酵母細胞壁甘露聚糖含量的測算酵母細胞壁甘露聚糖含量定義為每毫升發酵液離心菌體沉淀中甘露聚糖的濃度，用M1表征。酵母細胞壁甘露聚糖含量M1=濾液2甘露聚糖濃度×體積稀釋倍數，其中濾液2按1.2.3所述方法獲得，甘露聚糖濃度按1.2.4方法測定。

1.2.7酵母甘露聚糖釋放的測算甘露聚糖釋放量定義為每毫升發酵液離心上清中甘露聚糖的濃度，用M2表征。甘露聚糖釋放量M2=濾液1甘露聚糖濃度×體積稀釋倍數，其中濾液1由1.2.3所述方法獲得，甘露聚糖濃度由1.2.4方法測定。

2　結果與討論

2.1四種酵母細胞壁甘露聚糖含量與生長的關聯性

酵母菌產朊假絲酵母、畢赤酵母、面包酵母和啤酒酵母的生長過程曲線如圖1所示。從圖1可以看出，四種酵母生長過程曲線的整體趨勢基本一致：0～6h處于適應期，而6～20h是典型的對數生長期，菌體生長迅速，20h之后菌體生長速度開始明顯減緩，第45h后，菌體生長開始停止，菌體濃度呈穩定或下降趨勢。四種酵母在生長速率以及最大菌體濃度上存在差異，啤酒酵母最終菌體濃度達到5.6g/L，而畢赤酵母最大菌體濃度只有3.9g/L。

圖1　不同類型酵母的生長過程曲線Fig.1　Growth curve of different yeasts

圖2為酵母液態培養過程中細胞壁甘露聚糖含量的變化趨勢，從圖中可以看出，不同類型酵母細胞甘露聚糖含量在生長過程中的變化趨勢基本與菌體濃度的變化一致。畢赤酵母細胞甘露聚糖含量最低，菌體細胞中最終含有的甘露聚糖的僅為0.47g/L發酵液；啤酒酵母甘露聚糖含量最高，甘露聚糖含量最終達到了0.62g/L發酵液，比前者高出32%。綜合圖1和圖2的結果，可以看出四種酵母合成甘露聚糖的過程均與菌體生長緊密偶聯。

劉媛媛等利用人工神經網絡建立了酵母甘露聚糖合成的發酵過程數學模型，通過模型預測得出：酵母的細胞壁甘露聚糖含量在對數期快速積累，之后基本處于停滯狀態，這一趨勢與本實驗結果基本相符，進一步印證了甘露聚糖合成與菌體生長的關聯性［14］。

圖2　不同類型酵母細胞壁甘露聚糖含量的變化Fig.2　Changes of mannan content in different types of yeasts

2.2四種酵母培養液中甘露聚糖的釋放特性

圖3所示的四種酵母培養液中甘露聚糖釋放量的變化。整體趨勢顯示出較大的波動性，四種酵母在第12h一致出現一個波峰，但不同類型的酵母峰值差異顯著（p＜0.05），最高值畢赤酵母甘露聚糖釋放量達到了0.27g/L發酵液，最低值啤酒酵母甘露聚糖釋放量僅有0.15g/L發酵液。緊接著大約在20～45h范圍不同類型酵母甘露聚糖釋放量先后出現波谷，數值范圍從0.07～0.17g/L不等。在此波谷之后，不同類型酵母甘露聚糖釋放量出現不同幅度的回升。將圖3與圖2數據綜合計算，可得到酵母甘露聚糖釋放率，最高值畢赤酵母甘露聚糖釋放率達到了47.5%，意味著接近一半的甘露聚糖同細胞壁脫離，釋放到發酵液中。

圖3　不同類型酵母甘露聚糖釋放量的變化Fig.3　Changes of releasing amount of mannan in different types of yeasts

甘露聚糖在酵母培養過程中的釋放呈現一定規律的波動性，不同類型酵母甘露聚糖釋放的最大峰值均出現在對數中期12h左右，此時間點正處于菌體生長速率增加最為顯著的階段，四種酵母的比生長速率此刻基本都處于最高水平，意味著該時間點是酵母細胞出芽繁殖速率最快的時刻。酵母在出芽生殖過程中，子代細胞從母體細胞內部的出芽需要貫穿突破細胞壁，為減少出芽的阻力，細胞壁在此階段釋放大量細胞壁多糖，使厚實致密的細胞壁結構變輕薄疏松，從而使酵母的芽殖得以順利進行［15］。酵母的這一生理特征可以說明甘露聚糖釋放的峰值出現在出芽生殖最為劇烈的對數中期的原因，在該時間節點，甘露聚糖的最高釋放率接近50%。

圖4　乙醇對不同類型酵母甘露聚糖釋放的影響Fig.4　Effect of alcohol on the mannan release in different types of yeast

2.3乙醇對四種酵母甘露聚糖釋放的影響

目前關于酵母甘露聚糖的釋放的報道大部分集中于葡萄酒釀造的研究中，甘露聚糖的釋放伴隨釀酒過程的進行，為了研究乙醇是否會對甘露聚糖的釋放產生影響，本文進一步考察了乙醇對不同類型酵母甘露聚糖釋放的影響。

用初始培養基乙醇分別為0、5%、10%、15%四個濃度梯度進行培養，以對數中期甘露聚糖釋放量和釋放率為指標進行評測，結果如圖4所示。乙醇對四種酵母甘露聚糖的釋放率和釋放量均有不同程度的促進作用。產朊假絲酵母在5%乙醇濃度下，釋放量和釋放率最高，分別從空白對照的0.17g/L發酵液和24.7%提高到0.43g/L發酵液和53.7%，大幅提高了152%和120%，這說明乙醇對產朊假絲酵母甘露聚糖的促釋放效果十分顯著（p＜0.05）（圖4A）；而畢赤酵母在10%的乙醇濃度下，釋放量和釋放率最高，分別達到了0.513g/L和64.3%，比對照提高了95%和35%（圖4B）。乙醇對于面包酵母的釋放效果影響明顯不如前兩種酵母，釋放量和釋放率最大提高幅度分別僅為18.3%和22.4%（圖4C）。當乙醇濃度5%時，啤酒酵母甘露聚糖的釋放量最大，達到了0.29g/L，比對照提高了92.1%，當乙醇濃度10%時，啤酒酵母甘露聚糖的釋放率最大，達到了41.7%，比對照提高了68.1%（圖4D）。

3　結論

不同類型酵母合成甘露聚糖的過程與菌體生長緊密偶聯，總體變化趨勢平穩。不同類型酵母釋放甘露聚糖的釋放的最大峰值均出現在對數中期即酵母細胞出芽繁殖最為旺盛的時間節點上，最高釋放率接近50%。培養體系中5%～10%濃度的乙醇對四種酵母細胞壁甘露聚糖的釋放均有顯著促進作用（p＜0.05）。

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Comparation on synthesis and release of mannan in four yeasts

LIU Jin-long1，2，NI Jing-yue1，ZHAO Guo-qun1，2，*，LI Zhi-min1
（1.Research Center for Fermentation Engineering of Hebei，Shijiazhuang 050000，China；2.College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050000，China）

The synthesis and release rules of mannan on cell walls was compared during the cultivation process of candida utilis，pichia pastoris，bread yeast and beer yeast in this research.It was found that the syntheses of mannan in these four yeasts were all growth coupling type.Synthetic ability of mannan in different types of yeast were significantly different（p＜0.05）.The synthetic ability of mannan in beer yeast，which had the strongest synthetic ability among these four yeasts，was 0.62g/L fermentation broth，while that in pichia pastoris was only 0.47g/L fermentation broth.It was indicated that all the maximal releasing rates of mannan in four kinds of yeasts appeared in the middle period of logarithmic growth and the maximal releasing rates of mannan in different types of yeasts differed significantly，i.e.，the maximal releasing amount of mannan in pichia pastoris，which was highest among these four kinds of yeasts，reached to 0.27g/L fermentation broth，while the maximal releasing amount of manna in beer yeast，which was the lowest among these four kinds of yeasts，was only 0.15g/L fermentation broth.It was showed that alcohol significantly stimulated the releasing of mannan in four kinds of yeasts（p＜0.05）.Candida utilis in the alcohol with a concentration of 5%was affected most significantly.The releasing amount and releasing rate of mannan in it were respectively increased by 152%and 120%as compared with the control（p＜0.05）.

yeast；mannan；synthesis；release

TS201.3

A

1002-0306（2015）02-0199-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.034

2014－05－21

劉金龍（1980-），男，博士研究生，講師，主要從事微生物多糖與農用微生物菌劑的研究與開發。

趙國群（1963-），男，博士研究生，教授，主要從事生化工程方面的研究。