具有共生關系的乳酸菌和酵母菌的篩選

郭倩茹，賀銀鳳（內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特010018）

具有共生關系的乳酸菌和酵母菌的篩選

郭倩茹，賀銀鳳*
（內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特010018）

對分離自酸馬奶酒中的9株乳酸菌和8株酵母菌存在共生作用的菌株進行篩選。分別于各自培養基中加入相應的代謝產物，以等量的生理鹽水作為對照，測定其穩定期的濁度值和干重值。結果表明：乳酸菌的代謝產物促進的酵母菌生長有12個組合，而接近一半的酵母菌代謝產物對乳酸菌有促進作用。有7個組合的乳酸菌和酵母菌存在共生作用。結論是7個共生組合分別是：LAB2YST4、LAB4YST2、LAB5YST2、LAB7YST2、LAB7YST4、LAB8YST2、LAB9YST2。7個組合中酵母菌YST2和除LAB2外其余的乳酸菌均存在不同程度的共生，共生原因還待進一步研究。

乳酸菌，酵母菌，代謝產物，篩選，共生

微生物的共生現象最早由德國的真菌學家Heinrich Anton De Bary于1879年首次發現［1］。自然聯系的共生可能出現在幾個零星的菌落中，這些菌落基于特殊的信號分子（群體感應）或是有粘著因子如蛋白質或多糖（生物被膜）的共生體。這些聯系基于不同分子間相互作用，如理化環境的適應（pH的改變）、營養的相互作用（有機體得益于所共生的有機體的代謝因子）、不同有機體代謝物的交換導致其中一方不能獨自代謝（共生代謝）、蛋白的分泌、基因的轉移等［2］。

在已有研究中，SUDUN等從艾日格中篩選出典型的有共生關系的乳酸菌和酵母菌，通過探究復原脫脂乳代謝產物的變化反映出酵母菌促進乳酸菌的生長［3］。Pablo在關于發酵奶中的酵母菌和乳酸菌的相互作用實驗中，將乳酸菌和酵母菌進行純種培養和混合培養，表明大多數的共培養的組合中乳酸菌和酵母菌存在相互作用［4］。王洪志利用混合發酵和純種發酵探究了乳酸菌的加入對酵母菌生長及對風味物質的影響，表明乳酸菌的加入可以提高酵母菌的活菌數并且能夠改善產品風味［5］。

但已有研究中，大都是以純種培養作對照，將乳酸菌和酵母菌混合培養觀察二者是否有共生關系。由于微生物之間的相互作用較難分析，尤其是不同菌群的微生物。基于此判斷微生物之間相互作用可添加一方的代謝產物測定另一方微生物的生長情況。本實驗采用交互添加代謝產物的方法通過測定濁度值和干重值對具有潛在共生作用的乳酸菌和酵母菌進行篩選。實驗篩選出具有典型共生作用的菌株為進一步研究代謝產物的促生機制及菌株間的共生機理奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

實驗所用菌株為8株酵母菌和9株乳酸菌由內蒙古農業大學的內蒙古傳統發酵乳制品中乳酸菌和酵母菌共生機理課題組提供，其中酵母菌編號為：YST1厚壁孢酵母屬、YST2厚壁孢酵母屬、YST3酒香酵母屬、YST4厚壁孢酵母屬、YST5酒香酵母屬、YST6婁德酵母屬、YST7畢赤氏酵母屬、YST8酒香酵母屬，乳酸菌編號為：LAB1乳酸鏈球菌、LAB2糞腸球菌、LAB3耐久腸球菌、LAB4糞腸球菌、LAB5乳酸片球菌、LAB6糞腸球菌、LAB7植物乳桿菌、LAB8舊金山乳桿菌、LAB9干酪乳桿菌；實驗用MRS培養基及YEPD培養基按文獻［6］配制。

SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺蘇州蘇凈有限公司；HZQ-C氣浴恒溫振蕩器常州諾基儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱、電熱恒溫培養箱上海一恒科學儀器有限公司；LRH系列生化培養箱上海一恒科技有限公司；PHS-25數顯酸度計中國雷磁分析儀器廠；HQ-60-Ⅱ漩渦混合器北京北方同正生物技術發展有限公司；OHAUS EX623電子天平奧豪斯儀器（上海）有限公司；TOMY SX-500高壓滅菌鍋日本TOMY公司；T6新悅-可見光分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；TG16-WS臺式高速離心機湖南湘儀離心機有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌種的活化與保藏乳酸菌于MRS液體培養基37℃靜置培養24h為活化一代，活化三代備用。酵母菌于YEPD液體培養基30℃振蕩培養30h為活化一代，活化三代備用。將活化好的乳酸菌和酵母菌置于實驗室自制含有1%谷氨酸鈉的脫脂乳-80℃保藏。

1.2.2制備代謝產物按文獻［7］制備。方法如下：將活化好的乳酸菌于MRS培養基37℃靜置培養50h。將發酵液離心得到上清液，并過濾除菌。調節乳酸菌代謝產物的pH至5.5±0.2。將活化好的酵母菌于YEPD培養基30℃振蕩培養70h。將發酵液離心得到上清液，并過濾除菌。調節酵母菌的代謝產物pH至6.5±0.2。

1.2.3添加代謝產物的乳酸菌/酵母菌的培養將30%的酵母代謝產物添加到MRS液體培養基中作為實驗組，同時添加等量的pH為6.5±0.2的生理鹽水至MRS液體培養基作為對照組。MRS培養基接入2%的乳酸菌，37℃靜置培養20h，測其濁度值及干重值。將30%的乳酸代謝產物添加到YEPD液體培養基中作為實驗組，同時添加等量的pH為5.5±0.2的生理鹽水至YEPD液體培養基作為對照組。YEPD培養基接入2%的酵母菌，30℃振蕩培養30h，測其濁度值及干重值。

1.3濁度值和干重值測定

1.3.1濁度值實驗測定600nm的吸光光度OD值。通過實驗組和對照組的OD的差值可以得到：若OD差值為正，則實驗組高于對照組為促進作用，若OD差值為負，則實驗組低于對照組為抑制作用。

1.3.2干重值干燥的空離心管稱重標記。整個過程發酵液以4000r/min速度離心20min。整個實驗離心2次，生理鹽水沖洗1次。離心管中菌泥于電熱鼓風干燥箱105℃烘干4h［8］。用m表示質量則計算公式：m菌泥=m烘干后-m離心管，通過實驗組和對照組的干重的差值可以得到：若干重差值為正，則實驗組高于對照組為促進作用，若干重差值為負，則實驗組低于對照組為抑制作用。

1.4數據統計與分析

實驗的每個處理做兩個平行樣，兩次重復。數據采用SPSS軟件11.0版本，在顯著水平為0.05和0.01下進行單因素方差分析。

2　結果與分析

2.1乳酸菌代謝物對酵母菌生長的影響

表1是測定濁度值反映的乳酸菌代謝物對酵母菌生長的影響。由表1可知，有6株乳酸菌的代謝產物對YST1的生長有促進作用。LAB2的代謝產物對前4株菌有促進作用。LAB3的代謝物對YST2、YST5的促進作用極為顯著（p＜0.01）。LAB4的代謝產物促進了前6株酵母菌的生長。LAB5的代謝產物對YST1、YST2有促進作用。LAB6代謝產物對所有的酵母菌都有抑制作用。LAB7的代謝產物對YST4的促進作用顯著（p＜0.05），對YST2、YST7的促進作用極顯著（p＜0.01）。LAB8對YST2的促進作用顯著（p＜0.05）。LAB9僅對YST2有促進作用。

表1　乳酸菌代謝產物對酵母菌生長的影響（△OD600nm）Table 1　Effect of lactic acid bacteria metabolites on the growth of yeast（△OD600nm）

表2是培養酵母菌的過程中添加乳酸菌代謝產物以生理鹽水作對照測得的干重值。除LAB1和LAB2外，其余的乳酸菌代謝產物菌對YST2均有促進作用。LAB2的代謝物對YST4有促進作用。LAB3的代謝物均促進前5株酵母菌的生長。LAB4代謝產物對YST2和YST6促進作用極顯著（p＜0.01）。LAB5代謝產物對YST2、YST6、YST7促進作用極顯著（p＜0.01）。LAB6代謝產物對一半的酵母菌有抑制作用。LAB7代謝產物對YST2、YST4、YST5、YST6有促進作用。LAB8代謝產物對YST2、YST3、YST5、YST6有促進作用。LAB9代謝產物對YST2有顯著的促進作用（p＜0.05）。

表2　乳酸菌代謝物對酵母菌生長的影響（干重）Table 2　Effect of lactic acid bacteria metabolites on the growth yeast（△md）

綜合表1、表2的數據分析結果，在72組乳酸菌代謝物和酵母菌共培養的實驗中有12組乳酸菌代謝產物促進酵母菌的生長。分別是：LAB2YST4、LAB3YST1、LAB3YST2、LAB4YST6、LAB3YST4、LAB3YST5、LAB4YST2、LAB5YST2、LAB7YST2、LAB7YST4、LAB8YST2、LAB9YST2，其中LAB4代謝物對YST2、YST6促進作用極顯著（p＜0.01）。

2.2酵母菌代謝物對乳酸菌生長的影響

表3顯示酵母菌的代謝產物對乳酸菌生長影響的濁度值。YST2、YST4的代謝產物對所有的乳酸菌均有促進作用。YST3代謝產物對除LAB5、LAB7、LAB9，YST7的代謝產物對除LAB2和LAB6均有促進作用。YST5對LAB1、LAB2、LAB9有促進作用。YST6對LAB1、LAB2、LAB3、LAB9促進作用極顯著（p＜0.01）。YST8代謝產物對LAB1和LAB8有促進作用。

表4是酵母菌代謝產物對乳酸菌生長的影響實驗測得的干重值。橫向比較，所有的酵母菌的代謝產物均在不同程度上促進了LAB1、LAB2、LAB4、LAB5、LAB7這5株乳酸菌的生長。縱向比較，YST2、YST4、YST6、YST8的代謝產物對除LAB3外的乳酸菌，均有促進作用。YST3的代謝產物對所有的乳酸菌均有促進作用。YST5代謝產物促進了除LAB6外其余乳酸菌的生長。YST7代謝產物促進了LAB1、LAB2、LAB4、LAB5、LAB6、LAB7的生長。

綜合表3、表4，YST2、YST4的代謝產物促進除LAB3的乳酸菌的生長，YST3的代謝產物促進除LAB5、LAB7、LAB9乳酸菌的生長。YST5、YST6代謝產物均對LAB1、LAB2、LAB9有促進作用。YST7代謝產物對LAB1、LAB4、LAB5、LAB7有促進作用。YST8代謝產物對LAB1、LAB8有促進作用。在72對組合中，有34組酵母菌的代謝產物促進了乳酸菌的生長，酵母菌代謝產物促進乳酸菌生長的百分率達47.2%。

綜合表1～表4乳酸菌和酵母菌存在共生關系的組合有7個。其中LAB2、LAB7均和YST4共生。LAB4、LAB5、LAB7、LAB8、LAB9均和YST2共生。

3　討論

在已有的研究中對于乳酸菌和酵母菌共生的原因尚不明確。其中對于乳酸菌促進酵母菌生長的原因Marshall認為一些乳酸菌釋放半乳糖，利于不能利用乳糖的酵母菌的生長［9］。Cheirsilp等發現牛乳中混合培養乳酸菌和酵母菌，乳酸菌將乳糖分解成乳糖和半乳糖，而這些糖類利于酵母菌生長［10］。Katakura等發現在酸性條件下，酵母菌的甘露糖蛋白與乳酸菌有關，這種蛋白能引起乳酸菌對酵母菌的黏附［11］。這為二者共生提供了有利的條件。而對于酵母菌促進乳酸菌生長的解釋原因較為普遍的解釋是酵母菌能夠利用乳酸菌產生的乳酸，降低了環境中的pH，減少了大量積累的乳酸，利于乳酸菌的生長。Cheirsilp等研究發現馬乳酒乳桿菌和釀酒酵母混合培養顯著提高了馬乳酒胞外多糖的產量。排除酵母菌引起乳酸量減少帶來的影響，酵母菌代謝產物不是促進乳酸菌的生長的原因，而是細胞內容物促進了乳酸菌的生長［10，12］。Roostita等認為乳酸菌所需要的營養物質均可由酵母菌刺激產生。如酵母菌刺激乳酸菌合成維生素，或者酵母菌產生的氨基酸能被乳酸菌所利用［13］。這和SUDUN等的研究結果一致［3］。Jasmin等研究發現水開菲爾中的酵母菌和乳酸菌共培養中，酵母菌釋放了精氨酸和維生素B6促進了乳酸菌的生長［14］。Pablo則認為乳酸菌和酵母菌共生的原因是共培養過程中產生了有機酸，這些酸能被乳酸菌/酵母菌利用［4］。本研究利用代謝產物篩選出具有共生作用組合，盡可能把影響微生物之間相互影響因素減少。在篩選出組合中發現YST2和大部分的乳酸菌共生，今后需要進一步分析YST2代謝產物的成分及其對乳酸菌生長的影響，找出二者共生的原因及影響機理。

表3　酵母菌代謝物對乳酸菌生長的影響（△OD600nm）Table 3　Effect of yeast metabolites on the growth of lactic acid bacteria（△OD600nm）

表4　酵母菌代謝物對乳酸菌生長的影響（干重）Table 4　Effect of yeast metabolites on the growth of lactic acid bacteria（△md）

4　結論

篩選具有共生關系的乳酸菌和酵母菌的實驗中，有12組乳酸菌代謝產物促進了酵母菌的生長，而接近一半（47.2%）的酵菌代謝產物均促進乳酸菌的生長。篩選實驗中，有7個共生組合，分別是：LAB2YST4、LAB4YST2、LAB5YST2、LAB7YST2、LAB7YST4、LAB8YST2、LAB9YST2。在這7個組合里，YST2和除LAB2外其余乳酸菌均存在共生作用。

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Screening on the symbiotic lactic acid bacteria and yeasts

GUO Qian-ru，HE Yin-feng*
（College of Food Science and Engineering，Inner Mongolia Agriculture University，Huhhot 010018，China）

Nine strains of lactic acid bacteria and eight strains of the yeasts isolated from koumiss had been screened to select the symbiotic strains.Metabolites were added to the culture mediums with the addition of the same amount of saline as control groups.Turbidity values and dry weight values were measured in the stationary phase.There were twelve combinations that the metabolites of lactic acid bacteria promoted the yeasts growth.Nearly half of the yeasts metabolites promoted the growth of lactic acid bacteria.Seven combinations showed there were a symbiotic relationship between the yeasts and lactic acid bacteria.In a conclusion，the symbiotic combinations were LAB2YST4，LAB4YST2，LAB5YST2，LAB7YST2，LAB7YST4，LAB8YST2，LAB9YST2 respectively.Among them，YST2 and other lactic acid bacteria had showed different levels of the symbiotic relationship between each other except LAB2.The symbiotic reasons needed further study.

lactic acid bacterium；yeast；metabolite；screening；symbiosis

TS201.1

A

1002-0306（2015）02-0203-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.035

2014－05－26

郭倩茹（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術。

賀銀鳳（1960-），女，博士研究生，教授，研究方向：食品生物技術。

國家自然科學基金資助項目（31060222）。