甘草渣黃酮回流提取的工藝優化及預處理方法研究

徐春燕，張　娜，韓愛榮，管翠萍（寧夏大學生命科學學院，西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏銀川750021）

甘草渣黃酮回流提取的工藝優化及預處理方法研究

徐春燕，張娜，韓愛榮，管翠萍
（寧夏大學生命科學學院，西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏銀川750021）

通過單因素實驗考察了乙醇濃度、溫度、時間、固液比對甘草渣中黃酮提取的影響，在此基礎上采用正交實驗設計L9（34）優化黃酮提取工藝，獲得了乙醇回流提取甘草渣中黃酮的最佳條件為：乙醇濃度80%、溫度80℃、時間105min、固液比1∶20（g/mL），最佳條件下黃酮得率為37.387mg/g。進一步采用酶法和微生物法分別對甘草渣進行預處理，結果表明，酶法預處理能顯著提高黃酮得率，纖維素酶與木聚糖酶協同作用效果最佳；黃孢原毛平革菌處理12d的黃酮得率最高，達45.38mg/g。微生物預處理不但顯著提高黃酮得率，而且顯著（p＜0.05）降低了乙醇濃度和提取溫度，縮短了提取時間。此研究對于甘草渣的綜合開發和利用具有重要的參考價值。

甘草渣，總黃酮，正交實驗，酶法預處理，微生物預處理

甘草為多年生豆科草本植物，是一種重要的中草藥，其化學成分十分復雜，其中主要成分為甘草酸和甘草苷［1-2］。有效成分提取是甘草資源開發利用的重要方向，在提取甘草酸等有效成分后剩余大量殘渣，多以垃圾倒掉，造成環境污染的同時也引起了寶貴資源的浪費。有研究表明甘草渣營養豐富，可用于栽培食用菌［3］、提取黃酮類化合物［4］等，來自于甘草廢渣的有效成分價值甚至高于甘草中的有效成分［5］。因此，將甘草渣變廢為寶的綜合利用技術是解決甘草資源有效利用的關鍵點之一。

甘草渣中含有的黃酮類化合物因具有抗腫瘤等多種功效而存在巨大的藥用價值和商業價值［4-6］，因此，從甘草渣中提取黃酮類化合物將顯著提高甘草資源的經濟價值。但是，甘草渣中大部分黃酮類化合物存在于細胞壁內，細胞壁對黃酮類化合物起到天然屏障作用，傳統的溶劑提取效率較低［7］，在提取前增加預處理工藝將促進黃酮類化合物溶出，從而提高黃酮得率。酶法和微生物法預處理特異性強，處理條件溫和、污染小［8-9］，近幾年很受重視。本文以甘草渣為原料，通過正交實驗獲得黃酮類化合物的最佳乙醇回流提取工藝，在此基礎上分別采用三株白腐真菌和三種酶預處理甘草渣，比較微生物與酶法預處理對甘草渣黃酮得率的影響，為甘草渣綜合利用提供實踐基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

甘草渣來自于寧夏平羅縣樂夏甘草制品有限責任公司，為提取生產甘草浸膏后的廢棄物，經粉碎后過篩分級，選取粒度小于0.9mm的部分作為實驗材料，存放于干燥器內備用；黃孢原毛平革菌來自美國模式培養物集存庫，編號PC；BBEL0901和BBEL0970分離自美國奧林匹克國家公園，由本實驗室保存，經分子鑒定分別為膠質射脈革菌和雜色云芝，其ITS序列的Genbank登錄號分別為KM819088和KM819087；纖維素酶和木聚糖酶由寧夏夏盛實業集團有限公司惠贈，經測定纖維素酶活性約為64FPU/g，木聚糖酶活性約為200U/g；漆酶粗酶液為本實驗室所制備，由BBEL0901液體發酵液離心所得，漆酶活性為235U/mL；培養基為PDA培養基、PDB培養基和甘草渣培養基甘草渣10g，營養液［10］15mL。

U-T6型紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；AL204型分析天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；H1850型高速離心機湘儀離心機儀器有限公司；LRH-250型生化培養箱上海一恒儀器有限公司；HH-3A型數顯恒溫水浴鍋金壇市精達儀器制造廠；QHZ-12B型組合式全溫振蕩培養箱太倉市華美生化儀器廠；SW-CJ-1F型潔凈工作臺蘇凈集團安泰公司；回流提取裝置。

1.2實驗方法

1.2.1單因素實驗選用乙醇回流法提取甘草渣中的黃酮，以提取溫度、固液比、提取時間、乙醇濃度為單因素，通過實驗確定每種因素中較優的水平，提取結束后冷卻提取液至室溫，過濾除去濾渣，測定提取液中黃酮含量。每個樣品做3個平行樣，結果取其平均值。

1.2.1.1溫度固定乙醇濃度為80%，固液比為1∶40（g/mL），提取時間為90min，設置提取溫度分別為55、65、75、85、95℃。

1.2.1.2提取時間固定乙醇濃度為80%，固液比為1∶40（g/mL），提取溫度為75℃，設置提取時間分別為30、45、60、90、120、150min。

1.2.1.3乙醇濃度固定提取溫度為75℃，提取時間為90min，固液比為1∶40（g/mL），設置乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%。

1.2.1.4固液比固定乙醇濃度為80%，提取溫度為75℃，提取時間為90min，設置固液比（g/mL）分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50。

1.2.2正交實驗為了同時考察各因素對甘草渣黃酮提取的影響，在單因素實驗的基礎上，選取四因素的合適水平設計正交實驗提取黃酮，并采用極差分析法對草渣黃酮提取工藝進行優化。正交實驗的因素和水平見表1。

表1　L9（34）正交實驗的因素水平表Table 1　Factors and levels in the L9（34）orthogonal design

1.2.3甘草渣的酶法預處理分別采用漆酶、纖維素酶、半纖維素酶等以1∶40（g/mL）的甘草渣-酶液比于45℃處理甘草渣樣品，處理后離心，固體殘渣于80℃條件下烘48h稱重，采用1.2.2正交實驗所獲得的最佳工藝提取黃酮并計算其得率。實驗分組為：對照組，pH4.8的醋酸-醋酸鈉液（50mmol/L）處理24h；L組：漆酶粗酶液處理24h；C組：2.5%纖維素酶液處理24h；CX組：纖維素酶和木聚糖酶混合酶液處理24h，其配制方法為：向pH4.8的醋酸-醋酸鈉液（50mmmol/L）中添加2.5%纖維素酶和2.5%木聚糖酶；LCX同步組：漆酶、纖維素酶、木聚糖酶混合酶液處理24h，其配制方法為：向漆酶粗酶液（漆酶活性為235U/mL）中添加2.5%纖維素酶和2.5%木聚糖酶；LCX分步組：先用漆酶粗酶液處理24h，離心棄上清，再用纖維素酶和木聚糖酶混合酶液處理離心后的固體殘渣24h，纖維素酶和木聚糖酶混合酶液配制方法為：向pH4.8的醋酸-醋酸鈉液（50mmmol/L）中添加2.5%纖維素酶和2.5%木聚糖酶。

SPF級SD大鼠（遠交群），7～8周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（京）2012‐0001，動物質量合格證編號11400700179271、11400700161162、37009200004448、37009200004448、11400700202471。

1.2.4甘草渣的微生物預處理將三株白腐真菌菌種接入PDA培養基中于28℃活化后挑取菌塊，接種于PDB液體培養基中28℃、150r/min培養5～7d制種。分別接9mL液體菌種至甘草渣培養基，于28℃進行固態發酵，待菌絲充滿固體基質后提取第一批發酵樣品，之后定期取樣5批次。其中PC和BBEL0970的發酵周期24d，每4d取樣一次；BBEL0901的發酵周期為32d，每4～7d取樣一次。取樣后于80℃下烘48h后稱重，采用1.2.2正交實驗所獲得的最佳工藝提取黃酮。

1.2.5微生物預處理對黃酮提取條件的影響以PC處理12d的甘草渣樣品為材料，在正交實驗得到的最佳工藝基礎上，按照弱化提取條件的原則分別將溫度、乙醇濃度和提取時間降低一個水平，設計A～D 4種不同條件提取黃酮，通過對比不同提取條件下的黃酮得率來研究微生物預處理對黃酮提取條件的影響。A為正交設計得到的最佳工藝，B將最佳工藝中的提取時間縮短為90min，C將最佳工藝中的乙醇濃度降低至75%，D將最佳工藝中的提取溫度降低至70℃。

1.3測定方法

1.3.1黃酮含量的測定以0.4mg/mL蘆丁為標準溶液，分別移取標準溶液0、0.2、0.5、1、2、2.5、3、4、5mL，分別以蒸餾水補足5mL，加5%亞硝酸鈉溶液0.5mL，搖勻、靜置6min，加入10%硝酸鋁溶液0.5mL，搖勻、靜止6min，再加4%氫氧化鈉溶液4mL，搖勻、靜置15min，510nm處測吸光值，以吸光值為橫坐標，以標準品濃度為橫坐標制作標準曲線。所得回歸方程為y=0.3896x+0.0015（x：OD510nm，y：待測液濃度，單位mg/mL），相關系數R2=0.9992。按上述方法測定待測液在510nm處吸光值，通過蘆丁標準曲線計算黃酮含量。

1.3.2黃酮提取得率的計算根據各提取液中的黃酮含量計算各樣品的黃酮提取得率，公式為：黃酮得率（mg/g）=（V×C）/W，其中C為提取液中黃酮含量（mg/mL），V為提取液總體積（mL），W為甘草渣質量（g）。

1.4數據處理

采用SPSS 19.0統計軟件對實驗數據進行分析，結果以平均值±標準誤差（M±SE）表示，采用Origin 8.6軟件進行作圖，對各組結果進行統計學Duncan檢驗比較差異，以不同小寫字母表示差異顯著（p＜0.05）。

2　結果與分析

圖1　溫度對黃酮提取得率的影響Fig.1　Effect of temperature on the extraction yield of total flavonoids

2.1.1溫度對黃酮提取得率的影響由圖1可知，黃酮得率隨著提取溫度升高呈上升趨勢，這是由于溫度升高有利于樣品中黃酮類化合物擴散到溶劑中。但是，提取溫度為95℃時黃酮的得率不升反降，這可能是因為黃酮類化合物化學穩定性較差，高溫下黃酮成分損失較大［8-9］。方差分析表明75℃與85℃下的黃酮得率無顯著性差異（p=0.584＞α=0.05），從減少能耗方面考慮，選擇75℃為乙醇回流提取甘草渣黃酮的最佳溫度，得率為34.039mg/g。

圖2　提取時間對黃酮提取得率的影響Fig.2　Effect of extraction time on the extraction yield of total flavonoids

2.1.2提取時間對黃酮提取得率的影響由圖2可以看出，隨著提取時間延長，黃酮得率增加，但提取時間超過120min時，黃酮得率反而有所下降。這可能是因為延長提取時間有利于黃酮類化合物徹底擴散至提取溶劑中，但另一方面由于黃酮類化合物較低的穩定性［8-9］，提取時間過長使得黃酮提取得率降低。方差分析表明提取90min與120min的黃酮得率差異不顯著，從縮短提取時間、減少能耗方面考慮，確定90min為乙醇回流提取甘草渣黃酮的最佳時間，此時，黃酮得率為35.177mg/g。

圖3　乙醇濃度對黃酮提取得率的影響Fig.3　Effect of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids

2.1.3乙醇濃度對黃酮提取得率的影響從圖3可知，隨著乙醇濃度增加，黃酮的提取得率顯著升高，但當乙醇濃度達到90%時，黃酮得率反而下降。這是因為有機溶劑的增加有利于樣品中黃酮類化合物的釋放，但乙醇濃度過高使得提取液沸點越低，在提取過程中揮發的也越快，對提取得率不利。因此，選擇80%乙醇為回流提取甘草渣黃酮的最佳溶劑濃度，此溶劑溶度下黃酮得率為34.441mg/g。

圖4　固液比對黃酮提取得率的影響Fig.4　Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of total flavonoids

2.1.4固液比對黃酮提取得率的影響由圖4可知，固液比從1∶10（g/mL）提高到1∶20（g/mL）時，黃酮得率顯著提高，從21.763mg/g提高至34.039mg/g，提高了56.4%。而當固液比從1∶20（g/mL）繼續增加到1∶50（g/mL）時，黃酮得率基本維持不變，說明繼續增加固液比對黃酮的提取無影響，因此提取的最佳固液比為1∶20（g/mL）。

表2　正交實驗的結果與直觀分析表Table 2　Results and analysis of the orthogonal design

2.2正交實驗

根據單因素實驗結果，選擇4個影響因素的3個水平設計正交實驗L9（34）優化甘草渣中黃酮乙醇回流提取的工藝，考察指標為黃酮得率，正交實驗結果與分析見表2，方差分析見表3。

表3　正交實驗的方差分析表Table 3　Variance analysis of the orthogonal design

從表2和表3可知，各單因素對甘草渣中黃酮提取得率的影響程度依次是C＞A＞B＞D，即四因素中乙醇濃度對黃酮得率的影響最顯著，其次為溫度、固液比、提取時間。從方差分析表3可知，乙醇濃度和溫度對黃酮得率具有顯著意義，固液比和提取時間對黃酮得率具有一般意義。根據表2中的最優水平確定甘草渣中黃酮提取的最優工藝組合為A3B2C2D3，即溫度80℃，固液比1∶20（g/mL），乙醇濃度80%，提取時間105min。

以上述最佳工藝條件進行驗證實驗，結果表明，最優工藝下黃酮提取得率為37.387mg/g，RSD=1.8%（n=3），說明該工藝條件為最佳選擇，工藝穩定可行。

2.3酶法預處理對黃酮得率的影響

酶法預處理對甘草渣黃酮得率的影響如圖5所示，與對照組相比，除LCX同步組外，其他幾組酶法預處理均能有效提高甘草渣中黃酮得率，提高幅度介于27.7%～56.6%之間。CX組即纖維素酶與木聚糖酶協同作用的效果最佳，黃酮提取得率達27.1mg/g，比對照組提高了56.6%，說明纖維素酶與半纖維素酶復合處理有利于促進甘草渣中黃酮的提取。但是，酶法預處理中，甘草渣因在酶液中浸泡24h，使水溶性黃酮轉移到上清液中被棄去［11］，因此黃酮提取得率整體比原料降低。纖維素酶單獨處理甘草渣后黃酮得率與漆酶單獨處理的效果相當，將漆酶、纖維素酶和半纖維素酶分步處理甘草渣（LCX分步組）沒有進一步提高黃酮得率，而LCX同步組與對照沒有顯著性差異可能是由于木質素對纖維素酶的不可逆失活使纖維素酶活性降低［12-13］。此外，雖然漆酶常被用于中藥材中有效成分的提取，但是漆酶在介體的作用下會形成活性高且有一定穩定性的中間體，導致黃酮類化合物降解［14］。

圖5　酶法預處理對甘草渣黃酮提取得率的影響Fig.5　Effect of enzymatic pretreatment on the extraction yield of total flavonoids

2.4微生物預處理對黃酮得率的影響

微生物預處理對甘草渣黃酮得率的影響如圖6所示，BBEL0901和BBEL0970處理甘草渣不同時間均使其黃酮提取得率大幅度降低，PC處理使黃酮得率顯著升高，其中PC處理12d使黃酮提取得率提高最多，比原料提高了21.4%，達45.38mg/g（相當于含量為4.54%），遠遠高于李艷賓等所報道1.18%的含量［15］。BBEL0901和BBEL0970分別屬于木質素選擇性降解菌和同步降解菌，兩者都具有較強的漆酶產生能力，PC是模式真菌，不產漆酶，主要通過分泌木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶和乙二醛氧化酶降解木質素［16］，推測通過固體發酵形式進行的微生物預處理過程中，由于漆酶形成的高活性中間體對黃酮類化合物的降解作用較大，掩蓋了白腐真菌破壞細胞壁結構對黃酮溶出形成的促進作用，綜合導致產漆酶白腐真菌預處理后黃酮提取效果下降。

2.5微生物預處理對黃酮提取條件的影響

進一步對PC處理12d樣品的提取條件進行研究，結果如圖7所示。由圖7可見，在4種條件下提取PC處理12d甘草渣樣品的黃酮得率無顯著性差異，且顯著高于未經處理的原料，說明白腐真菌PC處理甘草渣不但能夠顯著提高黃酮得率，而且能夠降低乙醇濃度和提取溫度，縮短提取時間。此外，PC是白腐真菌研究中常用的模式菌，在菌絲生長階段能夠產生粉孢子，有利于實現微生物預處理縮短黃酮提取時間的工業化應用。

圖6　微生物預處理不同時間的甘草渣中黃酮提取得率Fig.6　Effect of microbial pretreatment on the extraction yield of total flavonoids

圖7　不同提取條件下PC處理12d樣品的黃酮得率Fig.7　The extraction yield of total flavonoids of the 12d pretreated sample by PC under different extraction condition

3　結論

在單因素實驗的基礎上采用正交實驗設計L9（34）優化黃酮提取工藝，獲得了乙醇回流提取甘草渣中黃酮的最佳條件：乙醇濃度80%，溫度80℃，固液比1∶20（g/mL），時間105min，此條件下黃酮得率為37.387mg/g。在此基礎上，分別采用酶法和微生物法對甘草渣進行預處理，發現酶法預處理能顯著提高黃酮提取得率，纖維素酶與木聚糖酶協同作用效果最佳；黃孢原毛平革菌處理12d的黃酮提取得率最高，達45.38mg/g。黃孢原毛平革菌不但顯著提高黃酮得率，而且顯著降低了乙醇濃度和提取溫度，縮短了提取時間。

［1］Asl MN，Hosseinzadeh H.Review of pharmacological effects of Glycyrrhiza sp.and its bioactive compounds［J］.Phytotherapy Research，2008，22：709-724.

［2］段志濤，高英，李衛民，等.甘草中黃酮類成分的研究［J］.北方藥學，2013，10（7）：6-11.

［3］陳學強，余夢瑤，鄭林用.新型栽培基質生產食用菌的研究進展［J］.中國食用菌，2009，28（3）：7-9.

［4］楊琳，車慶明，畢誠，等.甘草廢渣中黃酮成分的研究［J］.中草藥，2007，38（5）：671-673.

［5］鄧麗.甘草渣中黃酮類化合物的提取純化、分離鑒定及其抑菌活性研究［D］.蘭州：蘭州理工大學，2011.

［6］劉芬，李寧，倪慧，等.甘草藥渣的研究進展［J］.中國現代中藥，2011，13（2）：6-9.

［7］喬仲和，胡自如.甘草渣中大量黃酮類化合物的分離及甘草的綜合開發研究［J］.中草藥，1997（9）：522-524.

［8］Chandra RP，Bura R，Mabee WE，et al.Substrate pretreatment：The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics［J］. Advances in Biochemical Engineering Biotechnology，2007，108：67-93.

［9］Lee J.Biological conversion of lignocellulosic biomass to ethanol［J］.Journal of Biotechnology，1997，56（1）：1-24.

［10］徐春燕.生物質白腐菌改性與抗性變化的關系研究［D］.武漢：華中科技大學，2009.

［11］田慶來，謝渝春，張波，等.溶劑萃取法分離水溶性甘草黃酮［J］.過程工程學報，2007，7（3）：496-500.

［12］?hgren K，Bura R，Saddler J，et al.Effect of hemicellulose and lignin removal on enzymatic hydrolysis of steam pretreated corn stover［J］.Bioresource Technology，2007，98（13）：2503-2510.

［13］徐春燕，馬富英，王錦錦，等.生物處理竹子對纖維素酶糖化的影響［J］.林業科學，2008，44（10）：168-172.

［14］李泰侖，杜美惠，劉哲君，等.漆酶在藥物生產中的應用進展［J］.黑龍江醫藥，2010，23（2）：173-174.

［15］李艷賓，張琴，賀江舟，等.云芝發酵處理對甘草渣中總黃酮提取的影響［J］.食品科學，2010，31（11）：182-186.

［16］Zhi Z，Wang H.White-rot fungal pretreatment of wheat strawwithPhanerochaetechrysosporiumforbiohydrogen production：simultaneous saccharification and fermentation［J］. Bioprocess and Biosystems Engineering，2014，37（7）：1447-1458.

Study on pretreatments and optimization on reflux extraction of total flavonoids from glycyrrhiza residue

XU Chun-yan，ZHANG Na，HAN Ai-rong，GUAN Cui-ping
（Key Laboratory of Ministry of Education for Protection and Utilization of Special Biological Resources in Western China，School of Life Sciences，Ningxia University，Yinchuan 750021，China）

The effects of extracting temperature，extracting time，ethanol concentration and solid-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids from glycyrrhiza residue were investigated by single factor experiments. Based on single factor experiments，optimum parameters for extraction were selected with a L9（34）form by orthogonal experiment design.Results showed that the optimized extraction conditions were as follows：80%（V/V）ethanol，80℃，1∶20（g/mL）solid-liquid ratio，and 105min extraction time，under which the maximum extraction yield of total flavonoids was 37.387mg/g.Enzymatic pretreatment and microbial pretreatment of glycyrrhiza residue were further performed，respectively.Results indicated the extraction yield of total flavonoids was indeed enhanced by enzymatic pretreatments，among which the pretreatment with the combination of celluluase and xylanase gave the best effect.For biological pretreatments，the extraction yield of total flavonoids was the highest after pretreatment by Phanerochaete chrysosporium for 12 days，reaching 45.38mg/g.Moreover，comparison of all the pretreatments revealed that microbial pretreatment not only enhanced the extraction yield of total flavonoids significantly，but also decreased the ethanol concentration，extracting temperature and time. The research had significant reference value for comprehensive development and utilization of glycyrrhiza residue. Key words：glycyrrhiza residue；total flavonoids；orthogonal experiment design；enzymatic pretreatment；microbial pretreatment

TS201.1

A

1002-0306（2015）02-0222-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.039

2014－08－18

徐春燕（1981-），女，博士研究生，研究方向：微生物生物技術。

寧夏自然科學基金項目（NZ12128）。