響應面優化纖維素酶法提取桂花多糖工藝及其抗氧活性研究

蔣德旗，黃利敏，王　艷，李明星，鄧恒泉，蘇　龍，*（.玉林師范學院，廣西玉林537000；.南方醫科大學珠江醫院，廣東廣州508）

響應面優化纖維素酶法提取桂花多糖工藝及其抗氧活性研究

蔣德旗1，2，黃利敏1，王艷2，李明星2，鄧恒泉1，蘇龍1，*
（1.玉林師范學院，廣西玉林537000；2.南方醫科大學珠江醫院，廣東廣州510282）

目的：優化桂花多糖的提取工藝，并評價桂花多糖的抗氧化活性。方法：以桂花多糖得率為響應值，在單因素實驗基礎上，以液料比、酶解溫度、酶解時間、酶添加量為實驗因素，采用響應面法建立數學模型，篩選最佳提取工藝條件；采用自由基清除能力體系評價桂花多糖的抗氧化活性。結果：通過二次回歸模型響應面分析，影響桂花多糖得率的因素按主次順序排列為：纖維素酶添加量＞酶解時間＞液料比＞酶解溫度；確定纖維素酶解桂花多糖最佳工藝條件為纖維素酶添加量6.0mg/mL、液料比8∶1mL/g、酶解溫度55℃、酶解時間80min，在此條件下桂花多糖得率為18.43%，模型方程理論預測值為19.05%，兩者相對誤差小于5%。桂花多糖具有較強的抗氧化活性，對DPPH和O2-·自由基的半數抑制濃度分別為0.846mg/mL、1.256mg/mL，但與維生素C比較，抗氧化活性較弱。結論：采用響應面法優化得到了桂花多糖的最佳提取工藝，該工藝方便可行，得到的多糖具有較強的抗氧化活性。

桂花，多糖，響應面，酶法提取，抗氧化活性

天然產物中多糖具有抗腫瘤、抗炎、免疫、降血糖等多種生物活性、毒副作用小等優點，越來越受到研究者的重視［1-2］，如從土茯苓［3］、金針菇［4］、金蓮花［5］、松蘿［6］等植物中提取多糖。桂花（Osmanthus fragrans）既是珍貴的觀賞植物，又具有一定的藥用價值，富含碳水化合物、脂肪、多種氨基酸維生素等［7］。中醫認為，桂花可化痰散瘀，對痰飲咳喘、腸風血痢等有一定療效［8］。林志鑾等以水為溶劑90℃提取桂花葉多糖，得到多糖的提取率為11.35%［9］。本實驗采用響應面法探討纖維素酶提取桂花多糖的最佳工藝條件，同時采用自由基清除能力體系評價其體外抗氧化活性，為桂花多糖的進一步開發提供參考依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

桂花購自中草藥市場，烘干至恒重備用；纖維素酶（15U/mg）上海博奧生物科技；中性蛋白酶（50U/mg）、果膠酶（30U/mg）四川山野生物科技；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、D-無水葡萄糖、維生素C（VC） 美國Sigma；濃硫酸、苯酚、三氯乙酸（TCA）等均為分析純。

UV755B紫外分光光度計深圳瑞鑫達；PHS-3E酸度計上海精科；高速萬能粉碎機北京長峰金鼎；電熱鼓風干燥箱上海煜南儀器；離心機德國eppendorf；HL-2恒流泵上海滬西；HSY-B雙功能水浴恒溫搖床金壇市精達儀器。

1.2實驗方法

1.2.1桂花多糖的提取精確稱取5.0g粉碎并過100目篩后的桂花粉，按設定酶解條件（液料比、酶解溫度、酶解時間、酶添加量），在180r/min搖床上進行酶解提取實驗，得到多糖浸提液。多糖浸提液經90℃高溫滅活、離心分離、抽濾濃縮、三氯乙酸法除蛋白、透析除雜、乙醇沉淀、冷凍干燥一系列步驟，最終得到桂花多糖。

1.2.2多糖含量的測定多糖測定采用苯酚-硫酸法［10］。以葡萄糖（mg/mL）作為標準品測定提取液中多糖液中桂花多糖的含量，葡萄糖標準曲線為y= 0.0164x-0.0475，R2=0.9923，式中y為吸光度、x為葡萄糖質量濃度（mg/mL）。桂花多糖得率計算如下：

式中：Y為多糖得率（%）；A為由回歸方程求得的多糖濃度（mg/mL）；B為多糖液體積（mL）；C為桂花質量（g）。

1.2.3多糖提取單因素實驗分別選取纖維素酶、中性蛋白酶和果膠酶在酶添加量8mg/mL、酶解溫度50℃、酶解時間60min、液料比10∶1條件下，考察酶種類對多糖得率的影響，以多糖得率為指標并與90℃熱水浸提法（時間60min、液料比10∶1）進行比較。

酶解pH5.0和搖床轉速180r/min條件不變，分別考察酶添加量（2、5、8、11、14mg/mL）、液料比（5、10、15、20、25、30mL/g）、酶解溫度（30、40、50、60℃）和酶解時間（30、60、90、120、150min）對桂花多糖得率的影響。

1.2.4響應面優化設計依據單因素實驗結果，選擇液料比、酶解時間、酶解溫度、酶添加量為自變量，根據Box-Behnken設計，進行四因素三水平的響應面分析實驗，以多糖得率為響應值，利用Design Expert 8.06軟件對數據進行分析，因素水平設計見表1。

表1　響應面因素設計及水平Table 1　Factors and levels in response surface design

1.2.5桂花多糖體外抗氧化活性測定

1.2.5.1DPPH自由基清除能力測定取不同質量濃度的樣品溶液2mL和2mL DPPH溶液（0.2mmol/L）混勻，反應30min后在517nm處測定其吸光度A1，同法測定2.0mL乙醇加樣液的吸光度A2，以及2.0mL DPPH溶液與2.0mL蒸餾水的吸光度A0，以VC作為對照［11］。樣品對DPPH自由基的清除率計算公式為：

1.2.5.2O2-·的清除能力測定取不同質量濃度的樣品溶液1.0mL，加入pH8.2、濃度為50mmol/L的Tris-HCl緩沖液4.0mL，25℃水浴10min，再加入0.1mL濃度為25mmol/L的鄰苯三酚，混勻保溫5min后，即刻加入2滴10mol/L的HCl終止反應，讀取溶液在波長325nm處的吸光度B1，同法測定用蒸餾水代替鄰苯三酚后的吸光度B2，及以1.0mL蒸餾水替代樣品溶液后的吸光度B0，以VC作為對照［12］。樣品對O2-·的清除率計算公式為：

2　結果與分析

2.1酶法提取桂花多糖的單因素實驗

2.1.1酶種類對多糖提取的影響結果如圖1所示，纖維素酶解提取桂花多糖得率為15.12%，是熱水浸提法的3.02倍，且大于中性蛋白酶和果膠酶的多糖得率。纖維素酶能夠破壞胞壁結構，使胞內和胞壁中的多糖物質溶出，故后續實驗選擇纖維素酶。

圖1　酶種類對多糖得率的影響Fig.1　Effect of enzymes on the extraction rate of polysaccharide

2.1.2纖維素酶添加量對多糖得率的影響結果如圖2所示，在液料比10∶1、pH5.0、酶解時間60min、酶解溫度50℃的條件下，當酶添加量增加到8mg/mL時，多糖得率達到14.78%，隨著酶添加量的進一步增加，多糖得率沒有增加，說明在該底物濃度下，酶濃度已經趨于飽和，細胞內多糖已溶出，繼續添加纖維素酶，對多糖得率沒有影響，故酶添加量優化為8mg/mL。

2.1.3液料比對桂花多糖得率的影響結果如圖3所示，在pH5.0、酶解時間60min、酶添加量8mg/mL、酶解溫度50℃的條件下，多糖得率隨著液料比的增加而增大，當液料比增加到10∶1時，多糖得率達到13.26%，之后，多糖得率趨于穩定，增加趨勢變緩，考慮后續工藝處理及生產成本，控制液料比10∶1為宜。

圖2　酶添加量對多糖得率的影響Fig.2　Effect of cellulase concentration on the extraction rate of polysaccharide

圖3　液料比對多糖得率的影響Fig.3　Effect of the ratio of water to material on the extraction rate of polysaccharide

2.1.4酶解溫度對多糖得率的影響結果如圖4所示，在液料比10∶1、pH 5.0、酶解時間60min、酶添加量8mg/mL的條件下，當酶解溫度為50℃時，多糖得率達到15.07%，當酶解溫度為60℃時，多糖得率反而減小，這是因為溫度過高導致酶活力下降，故最佳酶解溫度選擇50℃。

圖4　酶解溫度對多糖得率的影響Fig.4　Effect of enzymlysis temperature on the extraction rate of polysaccharide

2.1.5酶解時間對多糖得率的影響結果如圖5所示，在液料比10∶1、pH5.0、酶解溫度50℃、酶添加量8mg/mL的條件下，當提取時間大于60min后，多糖得率增加趨于平緩，因為酶解時間過長，酶的催化活性下降，進而對多糖得率影響不大，故最佳酶解時間選擇60min。

圖5　酶解時間對多糖得率的影響Fig.5　Effect of enzymlysis time on the extraction rate of polysaccharide

表2　多糖得率的響應面實驗方案及結果Table 2　Response surface design arrangement and experimental results

2.2響應面優化實驗

2.2.1響應面實驗結果實驗方案及實驗結果見表2，回歸模型方差分析見表3。

2.2.2結果分析及模型方程的建立對表3中數據進行回歸擬合，得到自變量與多糖得率（Y）的二次多項回歸方程為：

對該模型進行方差分析，結果如表3所示，該回歸模型p＜0.0001，方程模型達到極顯著，失擬項p= 0.1216＞0.05，不顯著；該回歸模型的總決定系數R2= 0.9670，調整決定系數，變異系數CV=2.93，以上參數均說明該模型擬合程度好，實驗誤差小，故該回歸方程模型成立，可以用此模型對酶解提取桂花多糖進行分析及預測。

表3　擬合二次多項式模型的方差分析Table 3　The fitted quadratic polynomial model of ANOVA

由表3可知，纖維素酶提取桂花多糖的工藝參數中，影響多糖得率的因素按主次順序排列：酶添加量（D）＞酶解時間（C）＞液料比（A）＞酶解溫度（B），其中C、D達到極顯著水平，考察因素間交互作用，AD、BC、BD、CD存在交互作用且達到極顯著水平。

2.2.3響應面分析利用 Design-Expert 8.06軟件對表2中的數據進行二次多元回歸擬合，酶添加量、液料比、酶解溫度和酶解時間4個因素之間交互作用對多糖得率的影響如圖6所示。由圖6（c、d、e、f）和方差分析結果可知，AD、BC、BD、CD的交互作用對桂花多糖得率的影響極顯著，AB、AC間交互作用對多糖得率的影響不顯著。通過對回歸模型求解方程并考慮實際操作的可行性，修正得出桂花多糖提取的最佳工藝為液料比8∶1（mL/g），酶解溫度55℃，酶解時間80min，酶添加量6mg/mL，在此條件下多糖的最大得率為19.05%。

2.2.4優化工藝的驗證實驗為檢驗響應面法優化后的工藝可靠性，在上述最佳提取條件下，進行3組平行實驗，所得多糖得率的平均值為18.43%，而回歸方程所得的多糖得率理論預測值為19.05%，兩者相對誤差為3.25%，說明運用響應面法優化得到的模型參數準確可靠，能真實地反應各因素對桂花多糖得率的影響。

2.3桂花多糖體外抗氧化活性

2.3.1多糖對DPPH自由基清除作用由圖7可知，隨著質量濃度的增加，樣品溶液多糖和VC對DPPH自由基清除率不斷增大，多糖質量濃度10mg/mL時，樣品溶液多糖對DPPH自由基清除率達到88.76%，具有較強清除DPPH自由基的能力，但比VC清除DPPH自由基的能力差。桂花多糖清除50%DPPH自由基的半數抑制濃度（IC50）為0.846mg/mL，VC的IC50為0.604mg/mL。

圖6　各兩因素交互影響多糖得率的響應面圖Fig.6　Response surface plot for the mutual effects of four variables on extraction rate of polysaccharide

圖7　樣品多糖和VC對DPPH自由基的清除作用Fig.7　Scavenging capacity of sample polysaccharide and vitamin C on DPPH free radicals

圖8　樣品多糖和VC對的清除作用Fig.8　Scavenging capacity of sample polysaccharide and vitamin C on superoxide anion free radicals

3　結論

通過單因素實驗和響應面實驗確定了纖維素酶提取桂花多糖的最佳工藝條件為：液料比8∶1mL/g、酶解溫度55℃、酶解時間80min、酶添加量6.0mg/mL，此條件下多糖得率為18.43%，回歸方程所得的理論預測值為19.05%，二者相對誤差小于5%。此外，影響桂花多糖得率的因素按主次順序依次為：酶添加量＞酶解時間＞液料比＞酶解溫度。

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Optimization of enzymatic extraction technology of polysaccharide from Osmanthus fragrans using response surface methodology and investigation on its antioxidant activity

JIANG De-qi1，2，HUANG Li-min1，WANG Yan2，LI Ming-xing2，DENG Heng-quan1，SU Long1，*
（1.Yulin Normal University，Yulin 537000，China；2.Department of Pharmacy，Zhujiang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510282，China）

Objective：This study aimed to optimize the enzymatic extraction technology of polysaccharide from Osmanthus fragrans and investigate its antioxidant activity.Method：The response surface method（RSM）was adopted to establish the mathematical model，which used polysaccharides extraction rate as response value，and used the ratio of water to material，cellulase concentration，extraction temperature and extraction time as experimental factors to optimize the polysaccharide extraction conditions from Osmanthus fragrans.Antioxidant activity of polysaccharides was measured by DPPH and O2-·free radical elimination method.Result：The optimum conditions obtained by RSM were as follows，polysaccharide yield was most significantly affected by cellulase concentration，followed by extraction time，water to material ratio and extraction temperature.The concentration of cellulase was 6.0mg/mL，extraction time was 80min，the ratio of water to feedstock was 8∶1mL/g，extraction temperature was 55℃.Under the optimal conditions，the predicted extraction rate by mathematical model was 19.05%，while the experimental extraction rate was 18.43%，with a difference of less than 5%.IC50of DPPH andwere 0.846mg/mL and 1.256mg/mL，respectively.Antioxidant activity of sample polysaccharides was weaker than those of vitamin C.Conclusion：The optimum enzymatic extraction technology of the polysaccharides from Osmanthus fragrans by RSM was convenient and feasible，and the extracted polysaccharides had good antioxidant activity.

Osmanthusfragrans；polysaccharide；responsesurfacemethodology；enzymatic extraction；antioxidant activities

TS201.1

B

1002-0306（2015）02-0271-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.050

2014－05－07

蔣德旗（1986-），男，博士研究生，講師，研究方向：藥物生物技術。

蘇龍（1978-），男，碩士研究生，副教授，研究方向：中草藥生物轉化。

玉林師范學院教改項目（12YJJG16）；廣西自然科學基金（2013GXNSFBA019178）。