響應面設計優化川明參蛋白提取工藝

董紅敏，牛小勇，沈麗雯，李　路，秦　文，*（.四川農業大學食品學院，四川雅安6504；.四川南充閬中縣供銷合作社，四川南充637400）

響應面設計優化川明參蛋白提取工藝

董紅敏1，牛小勇2，沈麗雯1，李路1，秦文1，*
（1.四川農業大學食品學院，四川雅安625014；2.四川南充閬中縣供銷合作社，四川南充637400）

以川明參乙醇提取后的殘渣為原料，通過單因素和響應面實驗對超聲波輔助提取川明參蛋白工藝條件進行優化。結果表明，各因子對川明參蛋白提取率影響的先后次序為：超聲功率＞液料比＞超聲溫度＞超聲時間，最佳提取工藝條件為：pH12.5的堿溶液、液料比24∶1mL/g、超聲功率185W、超聲溫度34℃、超聲時間31min。該工藝條件下，川明參蛋白的平均提取率為54.62%。所得川明參蛋白提取回歸模型高度顯著（R2＝0.9484），擬合性好，可用于預測川明參蛋白提取率。

川明參，超聲提取，蛋白質，響應面優化

川明參又名明參、明沙參、土明參，是傘形科（Umbelliferae）植物川明參屬 “Chuanminshen violaceum Sheh et Shan”的干燥根，是我國特有的單種屬植物，是四川產道地藥材。具有滋陰補肺，健脾等功效，主治熱病傷陰，肺熱咳嗽，脾虛食少，病后體弱［1-2］。川明參主要含有多糖、蛋白質、香豆素、黃酮、甾醇、有機酸、酚類等化學成分［3］。目前國內外對川明參有效成分的提取主要集中在對原料中多糖、乙醇提取物及不同萃取物的研究［4-8］，其中幾乎全部的蛋白質隨廢渣一起被排放掉，造成了對蛋白資源的浪費。而研究表明川明參中粗蛋白含量高達5%以上，其水解氨基酸總含量超過3%，各類氨基酸達13種以上，尤其是人體必需的7種氨基酸，占總氨基酸含量的40%以上，它們可能是川明參的主要功能成分之一，可廣泛應用于醫藥和保健食品領域，市場前景廣闊。因此高效提取川明參蛋白對其功能研究及進一步開發利用具有重要意義［9-10］。

目前，對川明參蛋白的提取工藝及其優化尚未見報道，本實驗以95%乙醇提取川明參有效成分后殘渣為原料，采用超聲波輔助堿溶酸沉法，通過單因素實驗和響應面設計，探討殘渣中蛋白質最佳超聲提取工藝，為川明參蛋白的提取及綜合開發利用提供指導。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮川明參2013年春由四川閬中供銷社提供；川明參渣95%乙醇超聲提取川明參干燥粉后的殘渣；十二烷基硫酸鈉（SDS） 生化試劑，Amresco進口分裝；二流蘇糖醇（DTT） 生化試劑，Amresco進口分裝；牛血清蛋白北京拜爾迪生物有限公司；考馬斯亮藍G250上海寶曼生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

FW177中藥粉碎機天津市泰斯特儀器有限公司；KQ5200DB型數控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；UV-3200紫外可見分光光度計上海美普達儀器有限公司；Sorval ST 16高速冷凍離心機美國Thermo Scientific公司；Heto Power Dry PL3000凍干機美國Thermo Scientific公司；101-4型恒溫鼓風干燥箱上海一恒科學儀器有限公司；電子天平北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1川明參蛋白提取工藝流程參考文獻［11-12］的方法。

1.2.2川明參總蛋白含量的測定采用微量凱氏定氮法（食品安全國家標準食品中蛋白質的測定，GB5009.5-2010）［13］測定川明參總蛋白的含量。

1.2.3川明參可溶性蛋白含量的測定以牛血清蛋白為標準品，采用考馬斯亮藍法［14-15］測定可溶性蛋白質含量。以牛血清蛋白濃度（μg/mL）為橫坐標（x），吸光度A為縱坐標（y）繪制濃度-吸光度標準曲線。按1.2.1工藝流程制得的提取液稀釋至一定體積，取稀釋液1.0mL，加5.0mL考馬斯亮藍G-250溶液，振蕩搖勻，在595nm處，以提取劑為對照，測定吸光值，通過標準曲線獲得樣品蛋白質濃度，并計算出在該條件下的蛋白提取率。利用式（1）計算可溶性蛋白提取率：

1.2.4提取劑的選擇在超聲功率80W，超聲溫度30℃、超聲時間20min、液料比（mL/g）10∶1提取條件下，以A鹽溶液（0.5mol/L NaCl），B酸溶液（蒸餾水以HCl調pH至2.0），C堿溶液（蒸餾水以NaOH調pH至12.0），D 2%SDS溶液，E裂解液（2%SDS溶液+0.2% DTT），F 0.2mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）6種提取劑提取川明參蛋白質，測定其提取率［16］。

1.2.5單因素實驗

1.2.5.1pH對提取率的影響準確稱取5g川明參粉，分別加入pH9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13堿溶液進行提取，每個水平重復3次。固定超聲功率80W、超聲溫度30℃、超聲時間20min、液料比10∶1，按1.2.1項操作進行提取，測定不同pH提取液中蛋白提取率。以選出的堿液pH進行超聲輔助提取條件的篩選和響應面實驗。

1.2.5.2超聲功率對提取率的影響固定超聲溫度30℃、超聲時間20min、液料比（mL/g）10∶1，其他條件采用以上選出的結果，超聲功率設置為80、100、120、140、160、180、200W 7個水平，每個水平重復3次，測提取液中蛋白含量，考察不同超聲功率對川明參蛋白提取率的影響。

1.2.5.3超聲溫度對提取率的影響固定超聲時間20min，液料比10∶1（mL/g），超聲輔助提取溫度設置為30、35、40、45、50、55℃6個水平，每個水平重復3次，測提取液中蛋白含量，考察不同超聲溫度對川明參蛋白提取率的影響。

1.2.5.4超聲時間對提取率的影響固定液料比10∶1（mL/g），其他條件采用以上選出的結果，超聲輔助提取時間設置為10、20、30、40、50、60min 6個水平，每個水平重復3次，測提取液中蛋白含量，考察不同超聲時間對川明參蛋白提取率的影響。

1.2.5.5液料比對提取率的影響以上述選出的結果為固定條件，設置液料比（mL/g）10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 5個水平，每個水平重復3次，測提取液中蛋白含量，考察不同液料比對川明參蛋白提取率的影響。

1.2.6響應面實驗設計在單因素實驗基礎上，按照Box-Behnken設計原理，選擇液料比、超聲功率、超聲溫度和超聲時間為自變量，以蛋白質提取率為響應值，利用Design-Expert 8.0.5b軟件進行響應曲面分析優化提取條件［17-18］，響應面因素與水平表見表1。

表1　響應面分析因素與水平表Table 1　Factors and levels of response surface analysis

1.2.7川明參等電點的測定稱取10g川明參粉在最佳提取條件下制備川明參蛋白溶液，離心（8000r/min、20min）得上清液，分別取上清液6份各10mL，加鹽酸調pH1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，靜置30min，離心（8000r/min、20min），測定上清液中蛋白質的含量，利用式（2）計算川明參蛋白的沉淀率：

繪制沉淀率與pH的曲線圖，沉淀率最大時的pH即為川明參蛋白的等電點［17］。

2　結果與分析

2.1川明參總蛋白含量

采用微量凱氏定氮法（食品安全國家標準食品中蛋白質的測定，GB5009.5-2010）測定川明參總蛋白的含量為4.24%。

2.2標準曲線的繪制

以牛血清蛋白濃度（μg/mL）為橫坐標（x），吸光度A為縱坐標（y）繪制濃度-吸光度標準曲線（圖1）。得到標準曲線方程：y=0.0054x+0.0075，R2=0.9990。結果表明，牛血清白蛋白標準溶液的質量濃度在0～100μg/mL范圍內與吸光度具有良好的線性關系。

2.3提取劑對提取率的影響

以6種提取劑提取川明參蛋白，提取率的結果如圖2所示。由圖2可見，以C，即堿溶液（蒸餾水以NaOH調pH至12.0）為提取劑時，川明參蛋白質提取率最高，為18.62%。其次為E裂解液，提取率最低的為B酸溶液，僅為1.93%。因此，后續實驗以堿溶液為提取劑進一步優化提取條件。

圖1　川明參蛋白質含量測定的標準曲線Fig.1　Standard curve on protein content determination

圖2　不同提取劑對川明參蛋白提取率的影響Fig.2　Effect of different extracts on the extraction yield of protein from chuanminshen violaceum

2.4單因素實驗

2.4.1pH對川明參蛋白提取率的影響不同pH對川明參蛋白提取率的影響結果如圖3所示，川明參蛋白的提取率隨pH的增大而增加，pH大于11后提取率增長迅速，pH12.5時提取率最大，之后提取率變化不大。因此，后續實驗選擇pH為12.5進一步優化提取條件。

圖3　pH對川明參蛋白提取率的影響Fig.3　Effect of pH on the extraction yield of protein from chuanminshen violaceum

2.4.2超聲功率對川明參蛋白提取率的影響不同超聲功率對川明參蛋白提取率的影響結果如圖4所示，隨著超聲功率的增加，川明參蛋白的提取率逐漸增加，功率達到180W時，提取率最大，隨后提取率開始下降。可能是因為超聲功率增大，空化作用加強，超聲波對細胞壁的破碎作用增強，蛋白溶出速率加快，提取率升高；但功率過大，空化作用及其伴隨的機械效應也會破壞蛋白質的結構，影響蛋白質的提取率［19］。因此超聲功率以180W為宜。

圖4　超聲功率對川明參蛋白提取率的影響Fig.4　Effect of ultrasonic power on the extraction yield of protein from chuanminshen violaceum

2.4.3超聲溫度對川明參蛋白提取率的影響不同超聲溫度對川明參蛋白提取率的影響結果如圖5所示，溫度在30～35℃之間時，川明參蛋白提取率隨溫度升高而升高，隨后提取率逐漸下降。可能是因為低溫時，超聲波未能使細胞徹底破碎，隨著溫度的升高，超聲波與溫度的協同作用進一步破壞了細胞結構，從而使蛋白充分釋放；但溫度過高，這種協調作用也會引起蛋白質的變性［20］。綜合各因素，選擇35℃為川明參蛋白最佳超聲提取溫度。

圖5　超聲溫度對川明參蛋白提取率的影響Fig.5　Effect of extraction temperature on the extraction yield of protein from chuanminshen violaceum

2.4.4超聲時間對川明參蛋白提取率的影響不同超聲時間對川明參蛋白提取率的影響結果如圖6所示，在10～30min時，蛋白的提取率隨著超聲時間的增加而明顯提高，隨后提取率呈下降趨勢。其原因可能是隨著時間的增加，在超聲波作用下川明參細胞破碎度逐漸增大，蛋白溶出量逐漸增加，提取率提高；但超聲波作用時間過長會影響蛋白質的活性，提取時間超過30min后，超聲波對蛋白質的破壞程度加大，影響提取率［21］。因此超聲波作用時間以30min為宜。

2.4.5液料比對川明參蛋白提取率的影響不同液料比對川明參蛋白提取率的影響結果如圖7所示，液料比在10∶1～25∶1之間時，川明參蛋白提取率隨提取劑用量的增加明顯升高，當液料比25∶1時，提取率達到最大值，隨后蛋白的提取率有所下降，原因可能是隨著液料比的增加，增加了固相與液相間蛋白的濃度差，有利于蛋白質的充分溶出［22］；液料比達到一定程度后，在超聲波功率恒定的情況下，液料比增加會使超聲波空化作用相對降低，而使提取率下降。故選較優液料比為25∶1。

圖6　超聲時間對川明參蛋白提取率的影響Fig.6　Effect of ultrasonic action time on the extraction yield of protein from chuanminshen violaceum

圖7　液料比對川明參蛋白提取率的影響Fig.7　Effect of liquid to solid ratio ratio on the extraction yield of protein from chuanminshen violaceum

2.5響應面法優化超聲輔助提取條件

2.5.1實驗設計與結果在單因素實驗的基礎上，以提取率為實驗指標，用Design-Expert 8.0.5b軟件設計響應面實驗方案，對超聲波輔助提取條件進行優化，選擇液料比（X1），超聲功率（X2），超聲溫度（X3）與超聲時間（X4）作為響應面實驗的因素，以4因素3水平正交二次旋轉組合設計進行實驗，響應面實驗設計及結果見表2。

表2　響應面實驗設計及結果Table 2　Experimental design and results of response surface analysis

2.5.2回歸方程的建立與檢驗運用Design Expert 8.0.5b數據統計分析軟件對表2實驗結果進行多元回歸擬合，回歸模型方差分析見表3，回歸系數顯著性檢驗見表4。得超聲輔助提取川明參蛋白提取率對液料比（X1），超聲功率（X2），超聲溫度（X3）與超聲時間（X4）的二次多項式回歸模型為：

表3　回歸模型方差分析Table 3　Analysis of variance for the fitted regression model

從表3可以看出，該模型p＜0.0001，表明該二次回歸方程模型極顯著，模型的相關系數R2=0.9484，校正決定系數R2Adj=0.8967，表明模型實際值與預測值擬合較好，失擬項p=0.8820＞0.05，失擬項不顯著，實驗誤差較小，因此可用該模型對川明參蛋白超聲提取實驗進行分析和預測。

由表4可知，模型一次項X1、X2，模型交互項X2X3，模型二次項差異極顯著；模型一次項X3，模型交互項X1X2、X1X3、X2X4差異顯著，說明實驗因素對響應值提取率的影響不是簡單的線性關系。各因素對川明參蛋白提取率大小的影響依次是超聲功率（X2）＞液料比（X1）＞超聲溫度（X3）＞超聲時間（X4）。

表4　回歸系數的顯著性檢驗Table 4　Significance test of each regression coefficient

2.5.3響應面和等高線分析由表4可知，液料比和超聲功率，液料比和超聲溫度，超聲功率和超聲溫度，超聲功率和超聲時間的交互作用對川明參蛋白提取率影響顯著。

圖8　各兩因素交互作用的響應面及等高線圖Fig.8　Response surface and contour of the effects of any two factors on the yield of chuanminshen violaceum protein

由圖8（a）可以看出，當超聲時間和超聲溫度固定零水平時，液料比和超聲功率的交互作用對蛋白提取率有顯著的影響。當液料比固定不變時，隨著超聲功率的增加蛋白提取率呈現出先增后減的趨勢；當超聲功率固定不變時，隨著液料比的增加蛋白提取率呈現出先增后減的趨勢。

從圖8（b）可以看出，當超聲功率和超聲時間固定零水平時，液料比和超聲溫度的交互作用對蛋白提取率有顯著的影響。當液料比固定不變時，隨著超聲溫度的增加蛋白提取率呈現出先增后減的趨勢；當超聲溫度固定不變時，隨著液料比的增加蛋白提取率呈現出先增后減的趨勢。

圖8（c）中顯示，當料液比和超聲時間固定零水平時，川明參蛋白提取率受超聲功率和超聲溫度交互作用影響極顯著。當超聲功率固定不變時，隨著超聲溫度的增加蛋白提取率呈現出先增后減的趨勢；當超聲溫度固定不變時，隨著超聲功率的增加蛋白提取率呈現出先增后減的趨勢。

由圖8（d）可以看出，當液料比和超聲溫度固定零水平時，超聲功率和超聲時間對川明參蛋白提取率的交互作用顯著。當超聲功率固定不變時，隨著超聲時間的增加蛋白提取率呈現出先增后減的趨勢；當超聲時間固定不變時，隨著超聲功率的增加蛋白提取率呈現出先增后減的趨勢。

2.6驗證實驗

通過所得回歸模型對提取工藝進行優化獲得的最佳超聲提取工藝條件組合為：液料比23.63∶1、超聲功率185W、超聲溫度34.19℃、超聲時間30.92min，在此超聲條件下，預測川明參蛋白提取率可達到52.95%。考慮到實際操作的可行性，將川明參蛋白超聲提取工藝條件修正為：液料比24∶1、超聲功率185W、超聲溫度34℃、超聲時間31min。采用上述優化條件進行3次驗證實驗，川明參蛋白提取率實測值平均為54.62%，與預測值的相對誤差為1.67%，由此可見，采用響應面分析法對川明參蛋白超聲提取工藝的優化是行之有效的。

2.7酸沉淀川明參蛋白

由圖9可知，川明參蛋白的沉淀率隨著pH的升高呈先上升后下降的趨勢，在pH2.0時沉淀率最大，即川明參蛋白質的等電點為2.0。在等電點沉淀蛋白，離心去上清液，沉淀即為川明參蛋白。

圖9　川明參蛋白等電點Fig.9　Isoelectric point of protein from chuanminshen violaceum

3　結論

通過單因素實驗及響應面法優化實驗，選出川明參蛋白最佳提取劑為堿溶液，固定pH為12.5，得出超聲波輔助提取川明參蛋白的最佳優化工藝條件為：液料比24∶1、超聲功率185W、超聲溫度34℃、超聲時間31min，在此工藝條件下川明參蛋白質提取率為54.62%。通過酸沉法測定沉淀率得出川明參蛋白等電點為2.0，將川明參蛋白超聲提取液調pH至等電點，對川明參蛋白進行酸沉淀，可將川明參蛋白從提取液中分離出來。本研究采用超聲波和堿溶酸沉共同作用的方法大大提高了川明參蛋白提取率，且提取時間短，溫度低，操作簡單，降低了生產成本。

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Optimization of protein extraction from Chuanminshen violaceum based on response surface methodology

DONG Hong-min1，NIU Xiao-yong2，SHEN Li-wen1，LI Lu1，QIN Wen1，*
（1.College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China；2.Langzhong Supply and Marketing Cooperative of Sichuan Nanchong，Nanchong 637400，China）

The extraction condition of protein from Chuanminshen violaceum by ultrasonic extraction was optimized by single factor experiments and response surface methodology.The results showed that all investigated parameters had a notable effect on the extraction yield of protein and could be ranked in decreasing order of importance in their effects as follows：extraction temperature，solid-liquid ratio，ultrasonic action time and ultrasonic power.The optimum conditions for extracting protein from Chuanminshen violaceum were determined as follows：pH12.5，liquid-solid ratio（mL/g）24∶1，ultrasonic power 185W，extraction temperature 34℃，ultrasonic action time 31min.Under this condition，the average rate of extraction of polysaccharides was 54.62%.The established regression model describing the extraction yield of protein as a function of four extraction parameters was highly significant（R2=0.9484）.The predictive and experimental results were found to be in good agreement.Thus，the model was applicable for the prediction of protein yield.

Chuanminshen violaceum；ultrasonic extraction；protein；response surface optimization

TS201.1

B

1002-0306（2015）02-0276-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.051

2014－05－09

董紅敏（1989-），女，碩士研究生，研究方向：農產品產后處理與品質控制。

秦文（1967-），女，博士研究生，教授，研究方向：農產品產后處理與品質控制。