山楂黃酮超高壓提取工藝研究

孫協軍，李秀霞，馮彥博，張麗華（渤海大學化學化工與食品安全學院遼寧省高校重大科技平臺“食品貯藏加工及質量安全控制工程技術研究中心”，遼寧錦州121013）

山楂黃酮超高壓提取工藝研究

孫協軍，李秀霞*，馮彥博，張麗華
（渤海大學化學化工與食品安全學院遼寧省高校重大科技平臺“食品貯藏加工及質量安全控制工程技術研究中心”，遼寧錦州121013）

對山楂黃酮超高壓提取工藝進行了優化研究，以山楂中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素總得率為響應值，考查了乙醇體積分數、液固比、壓力和保壓時間對山楂黃酮得率的影響。結果表明，幾個考查因素對山楂黃酮得率影響的順序為：乙醇體積分數＞保壓時間＞液固比＞壓力；建立了超高壓提取山楂黃酮的數學模型，確定超高壓提取山楂黃酮的最佳工藝參數為：乙醇體積分數90%，液固比24∶1mL/g，壓力500Mpa，保壓時間為12min，在此優化條件下超高壓提取山楂中黃酮得率為0.0553%；相比于索氏抽提和超聲波提取法，超高壓提取在提取時間和黃酮得率上都有著明顯的優勢，對提取殘渣的掃描電鏡檢測結果顯示，經過超聲波和超高壓短時間處理的物料組織結構破壞程度較長時間索氏抽提更大，胞內物質更易于溶出，因此短時間內達到了較高的提取效率。

山楂，蘆丁，金絲桃苷，槲皮素，超高壓提取

山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）通常是指薔薇科（Rosaceace）山楂屬（Crataegus L.）植物的干燥果實，分為山里紅（Crataegus pinnatifida Bge var.Major N.E.Br.）和野山楂（Crataegus cuneata Sieb.&Zucc.）［1］，其中，山里紅也叫北山楂，在我國北方地區廣泛栽培，是重要的藥食同源植物。黃酮類化合物是山楂果實及葉片中主要的生物活性成分，主要包括以芹菜素和木犀草素為苷元的苷類以及以蘆丁和金絲桃苷為主的黃酮醇及氧苷類物質［2-4］。黃酮傳統的提取方法主要為索氏抽提、回流提取和溶劑浸提等［5-6］，消耗的溶劑多，提取時間長，這些提取方法的優化都在于選擇適當的溶劑和溫度以提高物料的溶解度和傳質速率［7］。萃取效率的提高程度有限，為大幅提高溶劑萃取的效率，需要外加新技術的輔助，超高壓提取（UHPE）的壓力范圍為100～1000MPa，高壓可提高溶劑向物料細胞內的擴散效率和待提取物的傳質效率，可在室溫下進行操作并能縮短提取時間，提高提取效率［8］。此外，UHPE只消耗電能且沒有任何廢氣和排放物，被認為是一種環境友好的提取方法。與煎煮法、熱回流法和超聲波提取方法相比，超高壓提取避免了熱敏性成分因受熱而失活，從時間、提取率及提取物抗氧化活性方面，超高壓提取均表現出很大的優勢［9］。

超高壓萃取技術在臍橙皮果膠［10］、荔枝黃酮［11-12］、茶多酚［13］、茶葉咖啡因［14］、和香菇多糖［15］等活性成分的提取中得到很好的應用。Guo等報道在壓力為500MPa、溫度為55℃和保壓時間10min條件下，臍橙皮果膠的提取率達到最高，果膠提取率為20.44%，顯著高于傳統加熱提取（15.47%）和微波提取（18.13%）［10］；Zhao等研究結果也表明，在用超高壓技術提取時，荔枝黃酮的提取率顯著提高，提取物的抗氧化活性比傳統提取方法也有了很大的提高［11］；Joo等研究表明，與超聲波提取和浸提法相比，C.sinensis茶樹多酚提取率和提取物抗氧化能力明顯升高［13］；Jun等采用不同方法提取綠茶中咖啡因，研究結果表明，與常溫浸提、加熱回流提取和超聲波提取相比，超高壓提取具有提取效率高、時間短和能耗低的優點［14］。超高壓技術在山楂黃酮提取工藝應用的研究報道很少，尤其缺乏HPLC精確定量方法的山楂黃酮超高壓輔助提取工藝研究的報道，蘆丁、金絲桃苷和槲皮素是山楂果實中主要的黃酮類物質［16-17］，因此，本實驗以自制山楂粉為原料，采用超高壓輔助提取技術，對山楂3種主要黃酮類化合物的超高壓輔助提取工藝進行研究，以期為超高壓技術在山楂果實有效成分提取方面的應用提供技術依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

山楂市售，產自遼西地區；蘆丁和槲皮素標準品（純度＞97%） 購于中國藥品生物制品檢定所；金絲桃苷標準品（純度＞98.5%） 購于寶雞市辰光生物科技有限公司；高效液相色譜檢測所用試劑均為色譜純；水為超純水；其他試劑為分析純。

P680型高效液相色譜儀（配DAD檢測器） 美國戴安公司；FA2004型電子天平上海恒平科學儀器有限公司；RE-2000型旋轉蒸發儀上海亞榮生化儀器廠；HPB.A2-600/0.4型超高壓實驗機天津市森淼生物技術有限公司；SCIENTZ-ⅡD型超聲波細胞破碎儀寧波新芝超聲設備有限公司；S-4800型場發射掃描電鏡日本日立公司；PS02-AD-DI型超純水機上海訊輝環保科技有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環水真空泵上海申光儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1山楂樣品預處理方法選擇整齊度良好的新鮮山楂自來水清洗后去除果核，帶皮果肉部分在50℃熱風烘干后粉碎成細粉，全部過40目分樣篩后真空封裝，冷藏備用。

1.2.2山楂黃酮提取方法

1.2.2.1超高壓提取方法準確稱取5g山楂粉于聚乙稀袋密封袋中，按照實驗設計加入相應體積的提取溶劑混合后，封好袋口后放入超高壓腔體內進行提取。超高壓設備腔體采用去離子水作為流體媒介，升壓速度為100MPa/min，降壓為瞬間降壓（約2～3s）。超高壓處理后的混合液減壓抽濾，等體積的提取溶劑洗滌抽濾瓶中濾渣，所得濾液在60℃旋轉蒸發掉大部分溶劑后，無水乙醇溶解并定容至50mL，0.45μm膜過濾后，HPLC檢測3種黃酮濃度，計算黃酮得率。

1.2.2.2超聲波提取方法［18］準確稱取5g山楂粉于100mL小燒杯中，加入體積分數90%乙醇溶液130mL，在600W超聲波功率下提取25min后減壓抽濾，收集濾液于60℃減壓濃縮至膏狀后，甲醇溶解并定容至50mL，HPLC測定總黃酮含量，并計算黃酮得率。

1.2.2.3索氏抽提方法準確稱取山楂粉5g，用濾紙包好，放入索氏提取器的抽提室中，100mL 95%乙醇回流提取一定時間，直至回流液無色為止。收集提取液于磨口燒瓶中，60℃減壓濃縮，殘留物用甲醇定容于25mL容量瓶中，HPLC測定總黃酮含量，并計算黃酮得率。

1.2.3儀器分析條件

1.2.3.1液相色譜檢測條件Develosil C30（250mm× 4.6mm，5μm）色譜柱；流動相：A相為乙腈，B相為0.4%磷酸水溶液，梯度洗脫，80%B～60.5%B（0～26min），80%B平衡4min后進下一個樣品；流速1mL/min；柱溫40℃；進樣20μL；檢測波長：360nm。

1.2.3.2掃描電鏡（SEM）條件在SEM樣品臺上貼上一層雙面膠，將提取后的山楂粉末撒于此雙面膠上，輕輕吹去多余的粉末，采用S-4800型電子顯微鏡觀察其表面結構，加速電壓為1.0～5.0kV。

1.2.4標準曲線的繪制各取蘆丁、金絲桃苷和槲皮素標準品48、15、4.5mg，甲醇溶解并分別定容至10mL，得到濃度分別為4.8（蘆丁）、1.5（金絲桃苷）和0.45mg/mL（槲皮素）的3種標準品貯備液，分別吸取同體積各標準貯備液，稀釋為6個濃度梯度的標準使用溶液，濃度分別為：蘆丁，0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16mg/mL；金絲桃苷，0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、0.001563mg/mL；槲皮素，0.015、0.0075、0.00375、0.001875、0.000938、0.000469mg/mL。

1.2.5山楂黃酮得率的計算方法山楂黃酮得率（%）=［（HPLC測定3種黃酮濃度和×定容體積）/（稱樣質量）］×100；其中，黃酮濃度單位為mg/mL，體積單位為mL，質量單位為mg。

1.2.6提取單因素實驗改變提取劑濃度、壓力、乙醇溶劑與山楂粉的液固比、保壓時間四項參數的條件，研究上述因素對山楂黃酮得率的影響，為響應面實驗確定影響因素和適合水平。

1.2.6.1乙醇體積分數對山楂黃酮得率的影響準確稱取5g山楂粉于聚乙稀袋密封袋中，分別加入體積分數分別為50%、60%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液，液固比20∶1mL/g，壓力為400MPa，保壓時間為6min，測定黃酮得率。

1.2.6.2壓力對山楂黃酮得率的影響稱取5g山楂粉于聚乙稀袋密封袋中，保壓時間為6min，液固比20∶1mL/g，選擇1.2.6.1中優化得到的乙醇體積分數，分別在200、250、300、350、400、450、500MPa壓力下提取，測定黃酮得率。

1.2.6.3液固比對山楂黃酮得率的影響稱取5g的山楂粉于聚乙稀袋密封袋中，選擇上2步實驗中優化得到的壓力和乙醇體積分數，保壓時間為6min，在山楂粉和乙醇溶劑的固液比分別為10、15、20、25、30、35、40、45mL/g條件下提取，測定黃酮得率。

1.2.6.4保壓時間對山楂黃酮得率的影響稱取5g的山楂粉于聚乙稀袋密封袋中，在已優化的乙醇體積分數、壓力和液固比條件下，分別采用保壓時間為2、4、6、8、10、12、15、20min提取，測定黃酮得率。

1.2.7響應面實驗為進一步確定最佳超高壓萃取條件和各因素的影響順序，依據Design-Expert 7.0進行響應面實驗設計，以3種黃酮總得率為考察指標，以乙醇體積分數（X1）、液固比（X2）、壓力（X3）和保壓時間（X4）為考查因素，共設立30個處理組，具體實驗設計見表1。

表1　山楂黃酮超聲波輔助提取響應面實驗設計Table 1　Response surface experiment design of ultrasound assisted extraction of hawthorn flavonoid

1.2.8數據處理實驗數據采用excel 2003和designexpert 8.0.6數學軟件進行分析。

2　結果與分析

2.1HPLC分離結果和標準曲線的建立

所配制的標準溶液經0.45μm膜過濾后分別進樣，黃酮混合標準溶液及山楂提取液的液相色譜圖見圖1（A）和圖1（B）所示，采用保留時間和光譜掃描圖對圖1（B）中各種黃酮進行定性［16-17］。以峰面積為橫坐標，3種黃酮濃度平均值（mg/mL）為縱坐標，3條標準曲線的回歸方程分別為：蘆丁，Y=538.31X-0.3226（R2=0.9999；線性范圍為0.0005～0.16mg/mL）；金絲桃苷，Y=828.86X（R2=0.9996；線性范圍為0.0016～0.05mg/mL）；槲皮素，Y=550.85X+0.044（R2=0.9997；線性范圍為0.0005～0.015mg/mL）。

圖1　黃酮混合標準溶液（A）和山楂黃酮提取液（B）色譜圖Fig.1　Chromatogram of flavonoid mixture standard（A）and hawthorn flavonoid extract（B）

2.2乙醇體積分數對山楂黃酮得率的影響

乙醇體積分數對山楂黃酮得率的影響如圖2所示，乙醇體積分數對得率影響較大，體積分數為90%的乙醇得率最高，其次是80%，乙醇體積分數較高或較低得率都不佳。黃酮類化合物易溶于含有一定比例水的乙醇溶液中，乙醇價廉無毒，常用一定體積分數的乙醇溶液作為黃酮類化合物的萃取溶劑［9，19-20］，極性較強的黃酮類化合物隨提取劑中乙醇體積分數的增大反而降低［21］，乙醇體積分數增大，黃酮苷元類化合物的溶解性增大，脂溶性黃酮類化合物的溶解性也隨之增大，乙醇體積分數為0%～50%內，總黃酮的提取率隨乙醇體積分數的增大而增加［19-20］。因此，本實驗設定的乙醇體積分數從50%起，隨乙醇體積分數的增加（50%～90%），黃酮得率逐漸增加，在超過90%后，山楂黃酮得率逐漸降低，這與以山楂葉為原料的實驗結果不同［21］，是因為實驗所用原料不同，本實驗采用的山楂粉中主要黃酮類物質蘆丁和金絲桃苷為黃酮醇類化合物［16-17］，從圖2的實驗結果中可以看出，90%體積分數乙醇對山楂黃酮類化合物的溶解能力最強，體積分數為80%和90%乙醇為溶劑的得率間沒有顯著差異（p＞0.05），考慮到成本因素，因此選擇體積分數為80%的乙醇進行下一步實驗。

圖2　乙醇體積分數對山楂黃酮得率的影響Fig.2　Effect of ethyl alcohol volume fraction on the extraction content of flavonoids from hawthorn

2.3壓力對山楂黃酮得率的影響

超高壓實驗機壓力對山楂黃酮得率的影響如圖3所示，在壓力為200～450MPa范圍內，隨著超高壓壓力的加大，山楂黃酮得率從0.0285%增加到0.0438%，可見，在一定范圍內（200～450MPa），超高壓壓力的增加有利于山楂黃酮提取效率的提高，這與樊振江等以柿葉為原料和王居偉的提取效果相似［20，23］，提高壓力有助于溶劑擴散到物料的細胞內部，加快物料被提取溶劑浸潤的速度，并通過升壓、保壓和卸壓等方式，破壞細胞壁和胞內各種膜，打破物料細胞內外平衡，降低了有效成分的傳質阻力，加快黃酮物質向外擴散的速率［24］。而在壓力超過450MPa后，黃酮得率呈現下降的趨勢，可能是較大的壓力導致山楂細胞破碎的小顆粒過多，堵塞了活性成分的溶出通道，同時破碎的組織細胞吸附了部分黃酮，導致提取效率反而降低，因此，選擇450MPa作為合適的壓力進行下一步實驗。

圖3　超高壓壓力對山楂黃酮得率的影響Fig.3　Effect of extracting ultrahigh pressure on the extraction content of flavonoids from hawthorn

2.4液固比對山楂黃酮得率的影響

液固比對山楂黃酮得率的影響如圖4所示，隨著液固比的增大，山楂黃酮得率在一定范圍內（液固比10∶1～35∶1mL/g）有增加的趨勢，但是液固比在15∶1～35∶1mL/g范圍內變化時，黃酮得率的變化很小，這與縱偉等超高壓提取金銀花黃酮的實驗結果相似［25］，說明液固比在15∶1～35∶1mL/g范圍內是超高壓提取黃酮的適宜范圍。當液固比為35∶1mL/g時，得率最高（0.0445%）。這主要是因為隨著液固比的增加，活性成分在山楂粉末與提取液接觸面間的壓力差增大，黃酮類化合物就越容易浸提出來；當液固比增大到一定值后，由于山楂中黃酮類化合物的含量有限，黃酮得率的增加趨于平緩，而后繼處理時間的增加導致黃酮損失加大，因此，當液固比超過35∶1mL/g后，隨著液固比的繼續增大，山楂黃酮得率反而有下降的趨勢，考慮到一定的液固比有助于后期抽濾等工作的順利進行，因此，選擇液固比25∶1mL/g進行下一步實驗。

圖4　液固比對山楂黃酮得率的影響Fig.4　Effect of solvent to solid ratio on yield of flavonoids from hawthorn

2.5保壓時間對山楂黃酮得率的影響

保壓時間對山楂黃酮得率的影響如圖5所示，在保壓10min以內，隨著保壓時間的增加，山楂黃酮得率從0.0428%增加到0.0467%。而當保壓時間超過10min后，山楂黃酮得率明顯下降，說明長時間處于較高壓力下，山楂黃酮的損失增大，而此時，黃酮類物質的浸出已經達到平衡，導致黃酮得率降低。因此，選擇保壓時間10min進行下一步實驗。

圖5　保壓時間對山楂黃酮得率的影響Fig.5　Effect of retention time of UHPE on extraction content of flavonids from hawthorn

2.6響應面實驗結果

通過單因素實驗，選取乙醇體積分數（X1）、液固比（X2）、壓力（X3）和保壓時間（X4）進行四因素三水平的響應面實驗，實驗設計的因素、水平和實驗結果見表2。用Design-Expert 8.0.6軟件對實驗數據進行多元回歸擬合，得到山楂中黃酮類化合物得率的回歸方程如下：

方差分析結果見表3所示，模型的F值顯著（p＜0.05），而失擬的F值不顯著（p＞0.05），模型的相關系數R2為76%，說明模型擬合程度較好，可以用該模型方程來分析和預測不同超高壓輔助提取條件下山楂黃酮得率的變化。在所選的各因素水平范圍內，液固比和保壓時間之間存在交互作用顯著（p＜0.05），四個考查因素對山楂中黃酮類化合物得率的影響排序為：乙醇體積分數＞保壓時間＞液固比＞壓力。

2.7最優提取工藝參數的優化

最佳工藝參數為：乙醇體積分數90%，液固比24∶1mL/g，壓力500MPa，保壓時間為12min，山楂黃酮得率預測值為0.0543%。在優化工藝條件下超高壓提取山楂黃酮，其得率為0.0553%，與預測值的相對誤差為0.07%。

2.8不同提取方法的比較

分別比較了不同提取方法（索氏抽提、超聲波提取和超高壓提取）對山楂黃酮提取效率的影響，結果見表4，從表4可以看出，超高壓提取技術在提取時間和黃酮得率上均比索氏抽提和超聲波提取法有著明顯的優勢，而索氏抽提一般認為是效率最高的脂溶性活性成分提取方法，因為相比于超聲波和超高壓這類常溫提取方法，索氏抽提通常采用溶劑沸點附近的提取溫度，而山楂黃酮的溶解度隨溫度的增加而不斷增大［26］，采用索氏抽提通常可獲得較高的提取效率。但在本實驗中，超聲波提取和超高壓提取兩種提取方法在山楂黃酮提取效率上顯然更有優勢，鑒于超聲波破碎儀在工作過程中還是會產生一定的熱量，有利于提取效率的提高，而超高壓則沒有熱效應，而熱醇浸提更有利于黃酮提取效率的提高，為了更好的解釋相比于索氏抽提法，超高壓冷提技術更有利于山楂黃酮高效提取這一實驗結果，利用場發射掃描電鏡觀察提取前的山楂黃酮干燥粉末以及索式提取、超聲波輔助提取和超高壓輔助提取后經過50℃烘干的山楂提取后剩余殘渣的干燥粉末，結果見圖7。從圖7可以看出，4種樣品通過場發射掃描電鏡掃描成像之后，在同樣的顯微倍數下（4000倍），其微觀組織結構出現了很大不同，索氏抽提后的殘渣顆粒中，細胞組織表面出現輕微的碎裂痕跡，而超高

表2　響應面實驗結果及分析Table 2　Experimental results and analysis of the response surface

表3　方差分析結果Table 3　Analysis of variance results

表4　不同提取方法的比較Table 4　Comparison of different extracting methods

圖7　掃描電鏡圖片（4000×）Fig.7　Scanning electron microscopy photograph（4000×）

壓或超聲波輔助提取后，殘渣顆粒表面孔隙明顯變多、變大，其組織結構被破壞的更加嚴重，表面也變得更為疏松，比表面積增大，這些變化都有利于山楂黃酮類物質的溶出，因此在短時間內，可達到較高的提取效率。

3　結論

對山楂黃酮超高壓提取工藝進行了優化，所選擇的影響因素的主次順序為：乙醇體積分數＞保壓時間＞液固比＞壓力，同時建立了超高壓輔助提取山楂黃酮的數學模型，確定超高壓輔助山楂黃酮的最佳工藝參數為：乙醇體積分數90%，液固比24∶1mL/g，壓力500MPa，保壓時間為12min，在此優化條件下超高壓提取山楂中黃酮，其得率為0.0553%；比較了索氏抽提、超聲波提取和超高壓提取對山楂黃酮得率的影響，發現在提取時間和黃酮得率上，超高壓提取都有著明顯的優勢，對各自提取殘渣的掃描電鏡檢測結果表明，經過超聲波和超高壓短時間處理的物料表面組織結構破壞程度比長時間索氏抽提更嚴重，因此短時間內可以達到較高的提取效率。

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Optimization of extracting technique assisted by
ultrahigh pressure extraction（UHPE）of flavonoids from hawthorn

SUN Xie-jun，LI Xiu-xia*，FENG Yan-bo，ZHANG Li-hua
（College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Engineering and Technology Research Center of Food Preservation，Processing and Safety Control of Liaoning Province，Jinzhou 121013，China）

Extracting technique assisted by ultrahigh pressure extraction method of flavonoids from hawthorn was optimized.The total yields of rutin，hyperin，and quercetin were used as response value，ethyl alcohol volume percentage，liquid to solid（L/S）ratio，power，and retention time were investigated in this experiment. The results showed that the sequence of different factors on flavonoid yield was：ethyl alcohol volume percentage＞retention time＞L/S ratio＞power；and the mathematical model of ultrahigh pressure extraction hawthorn flavonoid extraction was established，the optimal condition was that ethyl alcohol volume percentage 90%，L/S 24∶1mL/g，ultrahigh pressure 500MPa，retention time 12min，under the optimal condition，the hawthorn flavonoid yield was 0.0553%.Compared with sohxlet extraction method and ultrasonication extraction，there was obvious advantage at extracting time and extracting efficiency，it was observed from the scanning electron microscopy（SEM）that the destroy was more serious after treated by ultrasound and ultrahigh pressure than by long time sohexlet extracting，intracellular substances were dissoluted easier，and higher extraction efficiency was achieved within a short time.

hawthorn；rutin；hyperin；quercetin；ultrahigh pressure extraction

TS219

B

1002-0306（2015）02-0291-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.54

2014－07－02

孫協軍（1969-），男，本科，實驗師，主要從事食品資源開發利用方面的研究。

李秀霞（1973-），女，博士研究生，副教授，主要從事水產品貯藏加工方面的研究。

“十二五”國家科技支撐計劃（2012BAD29B06）；遼寧省食品安全重點實驗室開放課題（LNSAKF2011015）。