司來吉蘭對帕金森病模型大鼠結(jié)腸α－Syn Bcl－2表達(dá)的影響

畢樹立 高海英

1）河北唐山市開平醫(yī)院急診科 唐山 063021 2）河北唐山市豐南區(qū)醫(yī)院 唐山 063300

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是中、老年人臨床常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性疾病。除典型的運(yùn)動癥狀表現(xiàn)外［1］，常伴自主神經(jīng)功能紊亂，腸神經(jīng)功能紊亂等非運(yùn)動系統(tǒng)癥狀，且發(fā)生率較高［2］，便秘等結(jié)腸功能紊亂是臨床中常見的下消化道功能紊亂［3－5］。本研究以魚藤酮制作的帕金森病大鼠模型為對象，觀察司來吉蘭對帕金森病大鼠模型結(jié)腸中α－Syn及Bcl－2表達(dá)的影響，探討司來吉蘭在帕金森患者消化道功能紊亂中的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 鹽酸司來吉蘭（Orion CorPoration，芬蘭）；魚藤酮（北京博奧森生物工程有限公司，北京）；葵花油（唐山沃爾瑪超市，唐山）；兔抗大鼠Bcl－2抗體和兔抗大鼠α－Syn抗體（Cell Signaling Technology，美 國）；SP 免 疫 組 化試劑盒、DAB顯色液購自（中杉生物有限公司，北京）；奧林巴斯BX63全自動顯微鏡掃描系統(tǒng)（OLYMPUS，日本）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 體質(zhì)量180～250g的健康雄性SD 大鼠60只，按照隨機(jī)原則將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為正常對照組（對照組）、帕金森病模型組（PD 組）和司來吉蘭治療組（治療組），各組再隨機(jī)分為模型制作成功后4d和8d2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各10只。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 帕金森病模型的制備：采用頸背部皮下注射魚藤酮制備帕金森病模型［6］。具體操作方法：魚藤酮應(yīng)用葵花油溶解配制成2mg／mL 魚藤酮葵花油乳液，充分震蕩混勻后避光保存。PD 組和治療組大鼠稱質(zhì)量后以魚藤酮2mg／kg計(jì)算魚藤酮葵花油乳液用量。常規(guī)碘伏消毒后，捏起大鼠頸背部皮膚，用1mL注射器皮下注射魚藤酮葵花油乳液。以出現(xiàn)行為學(xué)改變作為判定模型成功的指標(biāo)［7］，選擇2～6分作為實(shí)驗(yàn)大鼠。模型制備成功后，治療組：司來吉蘭0.5 mg／kg每日灌胃，4d及8d2個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別連續(xù)灌胃4d和8d。對照組及PD 組每只每日均連續(xù)灌胃等體積生理鹽水，直至試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)。

1.3.2 標(biāo)本制備及檢測：腹腔注射10%水合氯醛溶液4 mL／kg麻醉實(shí)驗(yàn)大鼠。滿意后用4%多聚甲醛灌流組織固定，剖腹后取大鼠結(jié)腸，清洗干凈后去除多余組織，取約3cm腸標(biāo)本多聚甲醛固定24h 過夜行免疫組化檢測，另取約3 cm 腸標(biāo)本投入液氮，于－80 ℃保存以備行Western blotting。免疫組化檢測：將結(jié)腸標(biāo)本制作成石蠟切片，采用免疫組化SP 法，切片常規(guī)脫蠟脫水，3%H2O2溶液室溫作用封閉內(nèi)源性酶，微波進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加血清封閉，滴加適當(dāng)稀釋的兔抗大鼠一抗（Bcl－2、α－Syn均為1∶200），濕盒孵育，4℃過夜，滴加HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗，37 ℃恒溫箱孵育30 min，蒸餾水洗滌后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、中性樹脂封片，顯微鏡觀察。采用Image Pro－Plus 6.0圖像分析軟件分析。每張切片在高倍鏡下觀察，陽性產(chǎn)物為棕黃色，以積分光密度（intensive optical density，IOD）為指標(biāo)進(jìn)行圖像分析，計(jì)算5個(gè)高倍顯微鏡下平均光密度值。Western blotting蛋白印記：取各組制備好的大鼠結(jié)腸組織20μg，10%SDS－PAGE 電泳分離后，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。轉(zhuǎn)移后的PVDF膜于封閉液中封閉，然后分別加入兔抗大鼠Bcl－2一抗（1∶1000）、兔抗大鼠α－Syn一抗（1∶1000）孵育過夜。PBS 洗膜，加人相應(yīng)濃度的二抗（羊抗兔，1∶2000），室溫反應(yīng)1h，洗膜后ECL 顯色，膠片曝光顯影后，使用Image J軟件進(jìn)行測定平均灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以ˉx±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組α－Syn及Bcl－2免疫組化檢測結(jié)果 3組試驗(yàn)大鼠結(jié)腸中均可見α－Syn與Bcl－2陽性表達(dá)細(xì)胞。PD 組與對照組比較，發(fā)現(xiàn)α－Syn表達(dá)在2個(gè)不同試驗(yàn)點(diǎn)上均明顯增高（P＜0.05）；Bcl－2在2個(gè)不同試驗(yàn)點(diǎn)上均明顯減低（P＜0.05）。PD 大鼠通過司來吉蘭治療后，治療組與對照組比較，發(fā)現(xiàn)Bcl－2表達(dá)在2個(gè)試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)上明顯減低（P＜0.05），α－Syn表達(dá)在2個(gè)不同試驗(yàn)點(diǎn)上均明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。治療組與PD 組比較，發(fā)現(xiàn)Bcl－2 表達(dá)在2 個(gè)試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)上明顯增強(qiáng)（P＜0.05），α－Syn表達(dá)在2個(gè)不同試驗(yàn)點(diǎn)上均明顯減低（P＜0.05）。各組在不同時(shí)間點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)治療組8d時(shí)較4d時(shí)α－Syn表達(dá)顯著減低（P＜0.05），Bcl－2 表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠結(jié)腸組織中α－Syn及Bcl－2平均光密度比較

表1 各組大鼠結(jié)腸組織中α－Syn及Bcl－2平均光密度比較

注：與對照組比較，aP＜0.05；與對照組比較，b P＜0.05；與PD 組比較，c P＜0.05；8d與4d比較，＊P＜0.05

組別 4d α－Syn 8d 4d Bcl－2 8d對照組 130.23±4.65 129.56±5.58 140.65±5.62 142.45±5.54 PD組 168.45±5.52a 170.28±6.24a 102.24±5.23a 99.04±4.82a治療組 156.32±4.42bc 148.54±4.57bc＊115.54±5.43bc 124.54±6.95bc＊

2.2 Western blotting蛋白印記檢測結(jié)果 結(jié)果顯示PD 組與對照組不同時(shí)間點(diǎn)比較，α－Syn蛋白表達(dá)較對照組明顯增加（P＜0.05），Bcl－2蛋白表達(dá)較對照組明顯減低（P＜0.05）。司來吉蘭治療后，治療組與PD 組不同時(shí)間點(diǎn)比較，α－Syn蛋白表達(dá)較對照組明顯降低（P＜0.05），Bcl－2蛋白表達(dá)較對照組明顯增加（P＜0.05）；但與對照組比較，α－Syn蛋白表達(dá)較對照組明顯增強(qiáng)（P＜0.05），Bcl－2蛋白表達(dá)較對照組明顯減低（P＜0.05）。各組在不同試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)治療組8d時(shí)較4d時(shí)，α－Syn蛋白表達(dá)顯著減低（P＜0.05），Bcl－2表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠結(jié)腸組織中α－Syn及Bcl－2 Western blotting表達(dá)比較

表2 各組大鼠結(jié)腸組織中α－Syn及Bcl－2 Western blotting表達(dá)比較

注：與對照組比較，aP＜0.05，b P＜0.05；與PD 組比較，c P＜0.05；8d與4d比較，＊P＜0.05

組別 4d α－Syn 8d 4d Bcl－2 8d對照組0.20±0.08 0.21±0.06 15.23±0.20 15.45±0.16 PD組 0.66±0.08a 0.68±0.09a 6.42±0.32a 6.34±0.28a治療組 0.55±0.09bc 0.47±0.06bc＊ 8.28±0.26bc 10.19±0.34 bc＊

3 討論

突觸核蛋白（synuclein，syn）存在于突觸前末梢和神經(jīng)元核內(nèi)的蛋白質(zhì)，有α、β和γ等類型，其中α－突觸核蛋白（αsyn）最初于1988年分離而得［8］，研究表明其存在于多種神經(jīng)退行性疾病的突觸末梢以及細(xì)胞漿的包涵體中［9－10］。

帕金森病是多巴胺能神經(jīng)元變性、缺失，從而出現(xiàn)典型嗜酸性包涵體－路易小體。在患者的病變路易小體中，研究發(fā)現(xiàn)大量的a－syn寡聚體存在，導(dǎo)致多巴胺在細(xì)胞體內(nèi)累積過多而釋放減少，并能產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)加速細(xì)胞死亡，在帕金森病的腸神經(jīng)系統(tǒng)中，肌間神經(jīng)叢及黏膜下神經(jīng)叢神經(jīng)元也存在相同的改變［11］，從而引起腸道功能紊亂，研究［12］發(fā)現(xiàn)使用6－OHDA 制作PD 大鼠模型，在大鼠胃竇以及結(jié)腸肌間神經(jīng)叢中α－Syn的表達(dá)顯著增強(qiáng)，表明PD 患者出現(xiàn)胃腸道功能紊亂可能與α－syn增多而引起腸神經(jīng)系統(tǒng)損害造成的。本實(shí)驗(yàn)通過魚藤酮制作PD 模型，發(fā)現(xiàn)在PD 組中α－Syn表達(dá)顯著強(qiáng)于對照組（P＜0.05）；但經(jīng)司來吉蘭治療后，治療組 的α－Syn 表 達(dá) 顯 著 低 于PD 組，但 仍 高 于 對 照 組（P＜0.05）；且治療8d后，α－Syn的表達(dá)顯著低于治療4d時(shí)（P＜0.05），表明司來吉蘭能有效抑制PD 結(jié)腸中α－Syn 過度表達(dá)，從而減少α－Syn在細(xì)胞體內(nèi)的聚集，并減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)而延緩細(xì)胞死亡的進(jìn)程，進(jìn)而緩解胃腸道功能紊亂。

B淋巴細(xì)胞瘤－2基因（B－cell lymPhoma－2，Bcl－2）為存在于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及連續(xù)的核周膜的細(xì)胞存活促進(jìn)因子，能夠阻止細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，從而抑制了細(xì)胞凋亡。引起胃腸道機(jī)械活動的起搏細(xì)胞為Cajal間質(zhì)細(xì)胞，此細(xì)胞的凋亡可能與結(jié)腸動力障礙相關(guān)。Bcl－2的低表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡的作用可能減弱，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡加快，從而引發(fā)諸如便秘等的結(jié)腸動力障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，在PD模型中，Bcl－2的表達(dá)較對照組明顯降低（P＜0.05）；經(jīng)司來吉蘭治療后，治療組的Bcl－2表達(dá)較PD 組明顯增強(qiáng)，但較對照組仍為低表達(dá)（P＜0.05）；且經(jīng)8d的治療后，較治療4d時(shí)，Bcl－2的表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。表明司來吉蘭治療能使Bcl－2的表達(dá)增強(qiáng)，從而抑制細(xì)胞凋亡，緩解由細(xì)胞凋亡引起的結(jié)腸功能障礙。

綜上可知，PD 引起的腸道能紊亂，可能與α－Syn的高表達(dá)以及Bcl－2的低表達(dá)有關(guān)，司來吉蘭治療PD 能有效緩解腸道功能紊亂，可能與減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)以及延緩細(xì)胞的凋亡有關(guān)。但PD 是多種致病因素引起的導(dǎo)致神經(jīng)元退行性變，從而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)以及腸神經(jīng)系統(tǒng)的改變而引發(fā)多系統(tǒng)出現(xiàn)障礙，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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