mir－181c靶向作用Smad7在神經母細胞瘤中的調控機制研究

李 勇 王莉華

鄭州大學附屬鄭州中心醫院神經外科 鄭州 450000

研究表明miRNA 參與多種生物過程［1］，有許多關于miRNA 對神經母細胞瘤（Neuroblastoma，NB）組織下調機制的研究的報道［2－3］。我們先前的研究發現miR－181c抑制NB細胞的生長，然而，miR－181c對NB 的靶向調控機制有待于進一步研究。

1 實驗步驟

1.1 細 胞 系 和 轉 染 人 類NB 細 胞 系SK－N－SH 和SHSY5Y。MiR－181c模 塊，Smad7siRNA 和 反 義siRNA 購 買 于上?；蛑圃旃??；蚓幋aSmad7放大和插入pcDNA3向量（上 游：5“CGAAGCTTATGTTCAGGACCAAACGATCTGCGC 3”；下游：5“CCCTCGAGGGGCGCAGATCGTTTGGTCCTGAACAT 3”）。使用Lipofectamine TM 2000細胞轉染試劑（英杰公司）進行細胞轉染。

1.2 綠色熒光蛋白報告基因分析 擴增Smad7的野生型3‘UTR，并插入到pcDNA3／EGFP媒介的下游。Smad7DE 突變體3‘UTR（UGAAUGA 突變為AGUAAGA）進行擴增，并克隆到載體pcDNA3／EGFP 的下游。對于EGFP 報告基因的分析，使用mir－181c模塊或ASO－mir－181c和野生型Smad7的3＇UTR 或突變體3＇UTR 進行細胞共轉染。RFP表達質粒轉染效率增高。在轉染48h后，通過一個F－4500熒光分光光度計來測定裂解的細胞和GFP密度。

1.3 免疫蛋白印跡分析 在6孔板中培養細胞，密度為30×104個細胞／孔，并且在第2天細胞數量達到大約80%的時候進行細胞轉染。轉染后48h，用RIPA 緩沖液，在4度裂解細胞30min。使用BCA方法測定蛋白質濃度并且用20μg的蛋白質上樣來進行SDS－PAGE分析。一抗是兔抗人Smad7的抗體（1：500，Abcam 公 司，美 國）和 兔 抗 人GAPDH 抗 體（1：1 000，Abcam 公司，美國）。二抗是羊抗兔IgG 結合辣根過氧化物酶（1：1 000，Abcam 公司，美國）。使用的ECL Plus Western印跡檢測系統（GE Healthcare）檢測結合的抗體，并使用高性能的化學發光膜（GE Healthcare）上進行檢測。

1.4 RNA 的提取和實時定量PCR 根據制造商的說明方案，使用Trizol提取總的RNA。使用1μg的RNA 進行逆轉錄。對于miRNA 的逆轉錄反應，使用特定的miR－181c RT 引物，然后用于總RNA 的逆轉錄，Oligo（dT）作為一個通用的引物。使用SYBR GreenPCR 混合物進行實時定量PCR。所有使用的引物如下：miR－181cRT primer：5’CTCAAC TGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTCACCG 3’；miR－181c forward primer：5’ACACTCCAGCTGGGAACATTCAACCTG 3’；Reverse primer：5’TGGTGTCGTGGAGTCG 3’；Smad7sense：5’TCTGCTCCTGGATCTCCCTGA GATG 3’；Smad7antisense：5’GCTTGCTGGCCTAATAGCAGAGCTT3’。

1.5 腫瘤細胞存活實驗（MTT） 鋪96孔板，4000個／每孔轉染細胞。在轉染48h 后，用MTT 培養4h。加入DMSO100μL，解除MTT 并將細胞放置搖晃10min。用分光光度計測定吸光值A（波長570nm）。細胞增殖率（%）＝ATest／AControl×100%。

1.6 Transwell小室遷移試驗和侵襲試驗 無血清培養基培養24h，消化細胞并離心收集細胞，細胞懸液（細胞密度2.5×104）250μL 加入transwell上室，腔室底部則加入750μL的含有10%～20%血清的培養液。20h后取出transwell小室，使用棉簽輕輕擦拭小室上層細胞，使用4%多聚甲醛固定transwell小室。取出固定好的小室，使用自來水沖洗小室，結晶紫染色15min沖洗。將染好色的小室經梯度酒精脫水，風干后取下膜層，用中性樹脂封片，顯微鏡下計數即可。

1.7 統計學分析 數據分析選用SPSS 13.0軟件，所有數據采用mean±SD，兩組間比較采用雙樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 mi－181c的直接目標基因Smad7 為了探索mir－181c對NB 細胞的調控機制，使用生物信息學技術我們預測了mi－181候選目標基因，認為候選基因對癌有潛在作用。我們挑選了Smad7，MAT2A，CDKN2AIP，TGFB1 當作候選靶向基因。為了確定這些基因是否被mir－181c調控，我們首先檢測mir－181c控制3＇UTR 段綠色熒光蛋白的（Green Fluorescent Protein GFP）強 度。如 圖4B 示，mir－181c 減 少3＇UTR 段Smad7、CDKN2AIP 和TGFB1 的GFP 強 度，而MAT2A 除外。另外，蛋白印跡法（Western blot）分析表明，mir－181c蛋白水平上減少對Smad7 和CDKN2AIP 的表達，而對TGFB1 和MAT2表達增高。鑒于mir－181c對Smad7的表達影響較CDKN2AIP顯著，我們選擇了Smad7作為進一步 研 究 對 象。Figure 1D 示，mir－181c 的 結 合 位 點 在Smad7 3＇UTR，而且產生了多個突變位點。我們用mir－181c對野生型／3＇UTR 段突變的Smad7重新轉染細胞，發現mir－181c減少Smad 3＇UTR 段GFP強度，對突變的Smad7 3＇UTR段GFP強度沒有影響。在蛋白水平上，mir－181c對Smad7 mRNA 的表達減少約40%。這些數據表明mir－181c直接靶向作用于Smad7，mir－181c可抑制Smad7的表達。

圖1 mi－181c的直接目標基因Smad7

2.2 Smad7 介導mir－181c在NB 細胞中的抗腫瘤作用Smad7作為mir－181c的直接靶向基因，我們試圖確定mir－181c是否引誘Smad7可以調節其生物學行為，我們用mir－181c模塊和Smad7 過度表達載體pcDNA3／Smad7（無Smad7 3＇UTR）共同轉染細胞發現，兩者均能控制Smad7表達量。通過Western blot和RT－PCR 驗證了Smad7 的表達。MTT 和Transwell侵襲實驗分析表明，Smad7過度表達可以恢復細胞活力，促進遷移和侵襲能力。對修復細胞活性，遷移和入侵能力。此外，進一步驗證Smad7在NB 細胞中的作用，我們用siRNA 技術抑制了Smad7的表達。我們發現Smad7的敲除抑制細胞的生長，遷移和入侵?？偠灾?，這些數據表明，Smad7 蛋白可能作為的mir－181c在NB腫瘤發生的重要介質。

圖2 Smad7介導mir－181c在NB細胞中抗腫瘤作用

3 討論

先前關于miR－181家族靶標基因研究主要是5p段結合位點干擾基因的研究［4］，最近研究人員用信息預測靶點法預測結合位點，進一步用突變3′段綁定結合位點干擾基因表達，檢測靶點位目的基因表達率，發現miRNA－9靶定MMP－14基因3′段，并抑制其表達，對NB 起到抑制作用［5］。miR－181簇在癌癥中起到的不同作用主要取決于它的靶向基因，通過靶向基因調節miRNA 的功能。為了了解mir－181c在NB細胞系中的抑癌作用機制，進一步研究靶向結合位點和堿基突變對基因表達的影響，本實驗用EGFP 檢測3＇UTR段Smad7綠色熒光蛋白（GFP）強度，發現mir－181c結合位點在Smad73＇UTR 段，而且有多個結合位點（本研究發現有6個結合位點，Smad73＇UTR1460－1466），而且發現mir－181c對突變的Smad73＇UTR 段GFP 強度沒有影響（圖1），驗證了Smad7是mir－181c的直接靶向基因，并確定了3＇UTR 段靶向位點，進一步明確mir－181c對Smad7起負表達作用。

通過功能研究（圖2），證實Smad7 和pcDNA3／Smad7（Smad7超表達載體－無Smad7 3＇UTR）對NB細胞促進生長，遷移和入侵作用。本實驗兩個細胞系均轉染Smad7和pcDNA3／Smad7后MTT／Transwell結果示對NB細胞有積極作用，重要的是mir－181c－mmics＋pcDNA3 組對NB細胞的抑制作用最顯著，說明mir181c與超表達的Smad7 起到抑制NB細胞生長，遷移和侵襲作用，由此可以說明Smad7直接誘導mir－181c產生抗腫瘤作用。然而，以往研究結果表明，Smad7在EGF信號通路中起負性調控作用，在乳腺癌中抑制TGF－β1的表達，從而抑制腫瘤細胞生長［6］，與本次實驗數據形成了鮮明的對比。這個結果表明，Smad7 具有組織特性，在不同腫瘤中起到不同的作用。由此我們可以假設，mir－181c可能在乳腺癌和NB中起到不同的作用。

實質性證據表明，Smad的腫瘤抑制作用與TGF－β信號通路有關。Smad7在惡性腫瘤演變過程中的扮演不同的角色（抑癌／促癌）。Smad7通過防止信號轉導復合物的活化抑制TGF－β1通路［7］。Smad7具有競爭性抑制作用外，還能夠調節TGF／BMP 通路中Smurf遍在蛋白。Smurf2 連接到Smad7蛋白，降低信號傳導，進而調節Smad7的遍在蛋白化和降解Smad。然而，到目前為止Smad7的功能仍然不清楚。通 過抑 制TGF－β，Smad7 過 度 表 達 抑 制 骨 和 肺 轉 移［8－9］。Smad7同時通過減少MMP－2和MMP－9的分泌［10］抑制黑色素瘤細胞的生長和腫瘤發生。與此相反，Smad7的可誘發大腸癌轉移［11－12］。符合Smad7 在結直腸癌促轉移作用，我們的數據還表明，Smad7蛋白促進NB 細胞生長，遷移和侵襲。因此，Smad7蛋白功能機制有待進一步研究。

總之，我們研究證明了mir－181c通過Smad7 的表達抑制，調控NB 細胞的生長和轉移，充當一種腫瘤抑制基因。這些結果為基因治療NB患者奠定了重要基礎。

［1］ Bartel DP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116（2）：281－297.

［2］ Guo J，Dong Q，Fang Z，et al.Identification of miRNAs that are associated with tumor metastasis in neuroblastoma［J］.Cancer biology ＆therapy，2010，9（6）：446－452.

［3］ Terrile M，Bryan K，Vaughan L，et al.miRNA expression profiling of the murine TH－MYCN 10neuroblastoma model reveals similarities with human tumors and identifies novel candidate miRNAs［J］.PloS one，2011，6（12）：e28 356.

［4］ Lima RT，Busacca S，Almeida GM，et al.MiRNA regulation of core apoptosis pathways in cancer［J］.Eur J Cancer，2011，47（2）：163－174.

［5］ Zhang H，Qi M，Li S，et al.mircroRNA－9targets matrix metalloproteinase 14to inhibit invasion，metastasis，and angiogenesis of neuroblastoma cells［J］.Mol Cancer Ther，2012，11（7）：1 454－1 466.

［6］ Kim S，Han J，Lee SK，et al.Smad7acts as a negative regulator of the epidermal growth factor（EGF）signaling pathway in breast cancer cells［J］.Cancer letters，2012，314（2）：147－154.

［7］ Itoh S，Landstrom M，Hermansson A，et al.Trans－forming growth factor beta1induces nuclear export of inhibitory Smad7［J］.The Journal of biological chemistry，1998，273（44）：29 195－29 201.

［8］ Javelaud D，Mohammad KS，McKenna CR，et al.Stable overexpression of Smad7in human melanoma cells impairs bone metastasis［J］.Cancer research，2007，67（5）：2 317－2 324.

［9］ Azuma H，Ehata S，Miyazaki H，et al.Effect of Smad7expression on metastasis of mouse mammary carcinoma JygMC（A）cells［J］.Journal of the National Cancer Institute，2005，97（23）：1 734－1 746.

［10］ Javelaud D，Delmas V，Moller M，et al.Stable overexpression of Smad7in human melanoma cells inhibits their tumorigenicity in vitro and in vivo［J］.Oncogene，2005，24（51）：7 624－7 629.

［11］ Halder SK，Rachakonda G，Deane NG，et al.Smad7induces hepatic metastasis in colorectal cancer［J］.British journal of cancer，2008，99（6）：957－965.

［12］ Li Q，Zou C，Han Z，et al.MiRNA－25functions as a potential tumor suppressor in colon cancer by targeting Smad7［J］.Cancer letters，2013，335（1）：168－174.