候選抑癌基因RASSF6在胃癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系

劉新蘭，李淑璟，張海霞

（1.寧夏醫科大學總醫院腫瘤醫院腫瘤內科，銀川 750004；2.寧夏醫科大學研究生院，銀川 750004）

腫瘤的形成是多基因病變的過程，其發生發展與抑制細胞突變和異常增殖的抑癌基因功能失活密切相關。RASSF6近年來在多種腫瘤中被發現和證實是潛在的抑癌基因，但在胃癌中罕見報道。本研究應用組織微陣列通過免疫組化SP法、實時熒光定量RT-PCR和Western blot法檢測候選抑癌基因RASSF6在胃癌組織中的表達情況，分析它們與胃癌臨床病理特征的關系，探討RASSF6是否為胃癌的抑癌基因。

1 資料與方法

1.1 標本來源及處理 選取在寧夏醫科大學總醫院手術并經病理證實的胃癌及癌旁正常組織標本各100例，其中80份為2010年1月-2013年3月的胃癌及癌旁正常組織石蠟標本，20份為2013年4月-6月新鮮胃癌及癌旁正常組織標本，新鮮標本以無菌手術器械剪取癌組織和距癌灶5 cm的癌旁組織，所有標本切取后分為2份，一份放入經0.1%DEPC（焦磷酸酯）水處理過的凍存管內，置-80℃冰箱凍存；另一份經10%中性福爾馬林溶液固定常規石蠟包埋、切片。所有患者術前未接受任何放、化療等抗腫瘤治療。男性67例，女性33例；年齡：<60歲35例，≥60歲65例；腫瘤大小：<3 cm的38例，≥3 cm的62例；漢族61例，少數民族39例；分化程度：高分化19例，中分化24例，低分化57例；浸潤深度：黏膜及黏膜下22例，肌層23例，漿膜及漿膜外55例；有淋巴結轉移者53例，無淋巴結轉移者47例；TNM分期按照2010年國際抗癌聯盟（UICC）公布的標準：…期32例，…期14例，Ⅲ期46例，…期8例。

1.2 組織微陣列技術免疫組化SP法 兔抗人RASSF6多克隆抗體1∶200稀釋，購自美國Abcam公司，DAB等試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，制備孔徑為3mm的含有52個組織芯的組織芯片，連續制成4μm厚切片若干張，進行SP法免疫組化染色。每例標本選4張切片，1張用于HE染色，其余3張用于IHC染色，實驗步驟按試劑盒說明書進行，嚴格控制實驗條件。用已知陽性的肝癌組織切片作為陽性對照，PBS作為陰性對照。結果依照Fromowitz綜合計分法，將細胞著色強度與陽性著色細胞所占百分比二者結合判定，細胞著色強度：不著色計0分；淡黃色計1分；棕黃色計2分；棕褐色計3分。二者積分相加：0～1分為陰性，≥2分為陽性。陽性細胞百分數為10個視野陽性細胞的平均數占這10個視野中細胞數的百分比：<5%計0分；5%～25%計1分；26%～50%計 2分；51%～75%計3分；>75%計4分。

1.3 實時熒光定量RT-PCR 提取新鮮胃癌組織及對應癌旁正常組織的總RNA，并逆轉錄為cDNA后擴增和分析。采用β-actin為內參照,RASSF6和β-actin RNA引物序列由上海生物工程有限公司設計合成，RASSF6上、下游引物分別為：5c-AGCTGCCAGTTCTTGGAATG-3c、5c-AGGCCAGAC AGCTCTGATGT-3c；β-actin上、下游引物分別為：5c-CCACGGCTGCTTCCAGCTCC-3c，5c-GGACTCC ATGCCCAGGAAGGAA-3c。反應條件為25μL的反應體系，94℃預變性 3min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1min，35個循環，最后72℃延伸5min，至4℃終止。實驗數據用2-△△Ct進行處理。

1.4 Western blot液氮中取出組織后裂解液裂解，同時加蛋白酶及磷酸酶抑制劑，BCA法測蛋白濃度，100℃5min變性蛋白，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉PVDF膜25V30min，以含5%脫脂奶粉的TBS-T室溫封閉1 h，加RASSF6一抗（1∶500）、內參照 GAPDH 一抗（1∶1 000），4 ℃過夜；二抗（1∶5 000）室溫 1 h，顯影后凝膠成像系統掃描，并用圖像分析軟件進行定量分析。

1.5 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件處理數據。計數資料采用χ2檢驗，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，Spearman相關分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織微陣列技術免疫組化SP法

2.1.1 RASSF6的表達與胃癌臨床病理特征的關系

胃癌組織中RASSF6的表達在分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及胃癌臨床分期差異均有統計學意義（P<0.05），見表 1。

表1 RASSF6的表達與胃癌臨床病理特征的關系Tab1 Expressionsof RASSF6 in gastric cancer and itsassociation with clinicopathologic feature

2.1.2 胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中RASSF6的表達 RASSF6陽性染色主要定位于胃癌細胞的細胞漿和細胞核，呈深棕色顆粒狀（圖1），100例胃癌組織中RASSF6陽性表達率為31.0%，明顯低于癌旁正常胃黏膜組織中的陽性表達率76.0%，差異有統計學意義（P<0.05），見圖2。

圖1 胃癌組織中RASSF6的表達(SP×200)Fig 1 Expressionsof RASSF6 in gastric cancer(SP×200)

圖2 正常胃黏膜中RASSF6的表達(SP×200)Fig 2 Expressionsof RASSF6 in adjacentnorm al tissues(SP×200)

2.2 實時熒光定量RT-PCR法 20例胃癌組織中RASSF6mRNA的表達量明顯低于癌旁正常組織，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

表2 RASSF6mRNA在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達Tab 2 Expressionsof RASSF6mRNA levels in thegastric cancers and theadjacentnorm al tissues

2.3 Western blot法 20例胃癌組織中RASSF6蛋白的表達量為1.589±2.237，明顯低于癌旁正常胃組織中的表達5.723±1.939，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 3、圖 4。

圖3 GAPDH在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達（T為胃癌組織、N為正常組織）Fig3 ExpressionsofGAPDH in thegastric cancersand theadjacent norm al tissues

圖4 RASSF6在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達（T為胃癌組織、N為正常組織）Fig 4 ExpressionsofRASSF6 in thegastric cancersand theadjacent normal tissues

3 討論

胃癌仍是全球范圍內因癌死亡的第二位原因[1]，在我國其發病率和死亡率也居各種消化系統惡性腫瘤之首。主要原因是臨床上診斷分析缺乏特異的腫瘤標志物，早期診斷率低。因此尋找與胃癌早期診斷和治療相關的新的基因已成為目前胃癌研究的重點內容。近年來有學者認為RASSF6基因可能是胃癌新的候選抑癌基因，其在胃癌發生發展過程中的作用值得深入研究。

RASSF6是Ras相關結構域家族（RASSFs）新成員之一，位于染色體4q13.3，含13個外顯子，有3個轉錄本（RASSF6A～RASSF6C）[2-3]，該家族是 2000 年由Dammann等[4]首次發現并命名，參與不同的細胞內機制如凋亡、細胞周期控制、微管穩定性等，一些還表現出抑制腫瘤的功能[2,5-6]。有研究發現RASSF6可在HeLa、MCF-7和HepG2等細胞株中檢測到，但在原發性乳腺癌、甲狀腺癌組織中表達減少[7-9]，因此推測RASSF6可能在腫瘤形成中起作用[8-9]。

本研究采用組織微陣列技術，通過免疫組織化學方法檢測RASSF6在100例胃癌組織及癌旁正常胃組織中的表達，結果發現RASSF6在胃癌組織中的陽性表達率為31.0%，明顯低于其在正常胃組織中的表達（76.0%），差異有統計學意義。為了進一步證實RASSF6在胃癌中的表達差異，筆者又通過實時熒光定量RT-PCR及Western blot方法檢測了20例新鮮胃癌及癌旁正常胃黏膜組織中RASSF6 mRNA及蛋白的表達情況，結果同樣發現在胃癌組織中RASSF6mRNA及蛋白表達量均明顯低于癌旁正常胃組織，這與免疫組化結果相一致。因此推測RASSF6可能是胃癌中新的抑癌基因，其表達缺失可能導致腫瘤更易向惡性表型發展。經過上述的驗證后筆者又對RASSF6蛋白陽性表達與胃癌臨床病理特征的關系進行了分析，其結果顯示，RASSF6表達與胃癌的分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期有關，而與性別、年齡、腫瘤大小及民族無關，這與文獻報道[7，10]相一致。提示RASSF6在胃癌的發生、進展和浸潤轉移過程中發揮了負性調控的作用。

綜上，RASSF6在胃癌中可能為新的抑癌基因。其表達缺失可促進胃癌的發生發展，也可致腫瘤更易向惡性表型發展。在胃癌早期進行RASSF6失表達的檢測，可能為胃癌的早期篩查和診斷提供有利的生物學信息。雖然RASSF6的具體作用機制目前尚不明確，但相信隨著對RASSF6基因的深入研究，會對其在腫瘤中的作用有一個更全面的認識。

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