重樓皂苷D抑制A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用及機(jī)制研究

呂蕓，李曉玲

（1.陜西省西安市第四醫(yī)院，陜西西安710004；2.中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)，陜西西安710032）

重樓皂苷D抑制A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用及機(jī)制研究

呂蕓1，李曉玲2

（1.陜西省西安市第四醫(yī)院，陜西西安710004；2.中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)，陜西西安710032）

目的觀察重樓皂苷D對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞A549遷移與侵襲，以及基質(zhì)金屬蛋白酶2及9（MMP-2，MMP-9）表達(dá)的影響。方法培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞A549，加入不同質(zhì)量濃度的重樓皂苷D（1，2μmol/L），采用劃痕試驗(yàn)，Transwell侵襲試驗(yàn)觀察重樓皂苷D對(duì)A549遷移與侵襲的影響，以免疫印跡試驗(yàn)（Western Blot）法檢測(cè)細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)。結(jié)果與結(jié)論重樓皂苷D可有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞A549的遷移、增殖與侵襲，可濃度依賴性地降低MMP-2和MMP-9的表達(dá)。機(jī)制可能為其降低了MMP-2和MMP-9的表達(dá)。

重樓皂苷D；遷移；侵襲；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

40%的肺癌患者初診時(shí)已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，確診肺癌后5年生存率不足13%，這與肺癌易發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)［1］。因此，尋找能有效抑制肺癌轉(zhuǎn)移的藥物，對(duì)于改善肺癌患者的生存質(zhì)量具有重要意義。重樓又名七葉一枝花，為百合科植物，以根莖入藥，具有鎮(zhèn)咳平喘、消腫止痛、清熱定驚、敗毒抗癌等功效；主要用于針對(duì)癰腫肺癆久咳、淋巴結(jié)核、骨髓炎、跌打損傷、蛇蟲咬傷等癥；具有生物活性的主要成分是多種甾體皂苷［2-4］。本試驗(yàn)中觀察了重樓皂苷D對(duì)肺癌細(xì)胞A549增殖與轉(zhuǎn)移的抑制作用，并初步研究了其相關(guān)作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

重樓皂苷D（純度＞98%）購(gòu)自上海純優(yōu)生物有限公司。人肺癌細(xì)胞株A549購(gòu)于美國(guó)ATCC公司；培養(yǎng)基（DMEM，Hyclone公司，批號(hào)為NAD1269）；胎牛血清（Thermo Fisher公司，批號(hào)為140202）；胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA，北京索萊寶公司，批號(hào)為20140211）；β-肌動(dòng)蛋白（actin）抗體（Bioworld公司，批號(hào)為AP0060）；基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2，9抗體（Epitomic公司，批號(hào)為ARE6040，ARE6041）。

1.2 方法

細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理人肺癌細(xì)胞：將A549細(xì)胞加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置37℃及5%CO2細(xì)胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)。重樓皂苷D以DMSO配置為1mmol/L母液，置4℃冰箱保存，臨用前稀釋成工作濃度，工作濃度為1，3，10，30μmol/L。

MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率：取生長(zhǎng)良好的A549細(xì)胞以2×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板內(nèi)，置37℃及5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜，使細(xì)胞充分貼壁后隨機(jī)分組，每組設(shè)3個(gè)平行孔。給藥處理組分別加入含各種濃度的重樓皂苷培養(yǎng)液（1，3，10，30μmol/L）200μL，并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出培養(yǎng)板，每孔加入5 g/LMTT溶液20μL，再繼續(xù)孵育4 h。棄去孵育液，每孔加入150μLDMSO，于微量振蕩儀上低速振蕩10min，待結(jié)晶物充分溶解后，在Bio-Rad酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD）值。計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率（%）=（試驗(yàn)組OD值-對(duì)照組OD值）/對(duì)照組OD值×100%。重復(fù)3次。

劃痕試驗(yàn)：取生長(zhǎng)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔密度接種至24孔板中。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至融合時(shí)（約24 h），用200μL移液頭在細(xì)胞層上劃出一道劃痕。磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次后，加入含1.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下捕捉0 h劃痕圖片。培養(yǎng)24 h后，顯微鏡再次捕捉劃痕圖片。

Transwell侵襲試驗(yàn)：包被基底膜，50mg/L的基膜基質(zhì)以1∶8稀釋，包被Transwell小室底膜的上表面（約80μL/孔），室溫風(fēng)干；水化基底膜，吸出孔中殘余液體，每孔加入50μL含1%牛血清白蛋白（BSA）的無(wú)血清培養(yǎng)液，37℃孵育30min；接種細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105/mL，每孔膜的上層加入細(xì)胞懸液100μL，下層加入含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，用4%多聚甲醛室溫固定膜下層細(xì)胞15min。PBS清洗3次后，行結(jié)晶紫染色，顯微鏡照相，捕捉圖片。

免疫印跡試驗(yàn)（Western Blot）法測(cè)定MMP-2和MMP-9的表達(dá)：以細(xì)胞刮刮取對(duì)照組和重樓皂苷D處理24 h（1，2μmol/L）細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，蛋白定量、變性后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。NC膜用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加兔抗MMP-2（1∶500）、MMP-9（1∶500）及鼠抗β-actin（1∶1 000）一抗4℃孵育過(guò)夜，PBS洗膜后加1∶7 000稀釋的相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗，室溫孵育2 h，洗膜后，采用ECL發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑制A549細(xì)胞的增殖

以不同濃度重樓皂苷D處理A549細(xì)胞24 h后，采用MTT法測(cè)定各組OD值。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，重樓皂苷D（1，3，10，30μmol/L）作用于細(xì)胞24 h后能顯著抑制A549細(xì)胞增殖，抑制率分別為（10.01±1.07）%，（17.67±3.01）%，（54.96±8.13）%，（71.66±4.61）%（P＜0.01），作用呈濃度依賴性，見(jiàn)圖1。

圖1 重樓皂苷D對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

2.2 抑制A549細(xì)胞的遷移

1μmol/L及2μmol/L的重樓皂苷D孵育細(xì)胞24 h后，細(xì)胞的遷移均受到明顯抑制，抑制率為（23.46±3.53）%和（48.92±4.26）%（P＜0.01），作用呈一定的濃度依賴性，見(jiàn)圖2。

圖2 重樓皂苷D對(duì)A549細(xì)胞遷移的影響

2.3 抑制A549細(xì)胞的侵襲

在對(duì)照組中，大量的A549細(xì)胞從上層侵入到下方的小室。在重樓皂苷D處理各組，從上層進(jìn)入下方小室的細(xì)胞顯著減少（P＜0.01）。醋酸溶解結(jié)晶紫后，在570 nm波長(zhǎng)處讀取OD值，發(fā)現(xiàn)該作用呈濃度依賴性，1μmol/L組和2μmol/L組侵襲抑制率分別為（21.33±4.63）%和（56.37±2.11）%（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖3 重樓皂苷D對(duì)A549細(xì)胞侵襲的影響

2.4 對(duì)A549細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響

Western Blot法檢測(cè)結(jié)果表明，重樓皂苷D可使A549細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平呈濃度依賴性降低，見(jiàn)圖4。

圖4 重樓皂苷D對(duì)A549細(xì)胞中MMP-2，MMP-9表達(dá)的影響

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，重樓皂苷D可濃度依賴性地抑制A549的遷移和侵襲。腫瘤遷移和侵襲是決定腫瘤惡性程度的重要因素。腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的降解和破壞在腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。MMPs是一類與鋅結(jié)合、能降解細(xì)胞外基質(zhì)活性的酶類，在正常生理?xiàng)l件下，其合成、分泌及降解受到嚴(yán)格調(diào)控。而惡性腫瘤細(xì)胞分泌的MMPs酶活性明顯增強(qiáng)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在MMPs中，MMP-2和MMP-9是參與細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要成分，這兩者是不同形式的Ⅳ型膠原酶，又稱明膠酶A和明膠酶B。MMP-2主要由腫瘤間質(zhì)細(xì)胞分泌，MMP-9則主要由腫瘤細(xì)胞分泌［5-10］。本研究結(jié)果顯示，重樓皂苷D可濃度依賴性地降低細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平。

綜上所述，重樓皂苷D可能通過(guò)下調(diào)MMP-2和MMP-9的水平，從而發(fā)揮抑制A549細(xì)胞侵襲與遷移的作用。雖然重樓皂苷D的抑制結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的活性與機(jī)制有待進(jìn)一步研究，但該結(jié)果將為重樓及其成分開發(fā)提供依據(jù)。

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Effect and Mechanism of Polyphyllin D on Metastasis of A549 Cells

Lyu Yun1，Li Xiaoling2
（1.The Fourth hospital of Xi′an，Xi′an，Shaanxi，China 710004；2.The Fourth Military Medical Universtiy，Xi′an，Shaanxi，China 710032）

Objective To investigate the effects of Polyphyllin D on the migration and invasion and the expression MMP-2，MMP-9 in human lung cancer cells A549.Methods A549 cells were administered with different concentrations of Polyphyllin D（1，2μmol/L）. Cell migration and invasion were then evaluated by wound healing and trans well assays.MMP-2 and MMP-9 expression were assessed by Western blot.Results Polyphyllin D can inhibit the migration and invasion of A549 significantly.Polyphyllin D can reduce MMP-2 and MMP-9 expression in a concentration dependent manner.Conclusion Polyphyllin D can inhibit A549 migration and invasion，the mechanism may be the expression of MMP-2 and MMP-9 are affected.

Polyphyllin D；migration；invasion；MMP-2；MMP-9

R285.5；R282.71

A

1006-4931（2015）22-0035-02

2014-10-27；

2015-04-21）