紫杉醇參與逆轉(zhuǎn)肺部腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的機(jī)制研究

張桂芝，方向群

（中國人民解放軍總醫(yī)院南樓呼吸科，北京100853）

紫杉醇參與逆轉(zhuǎn)肺部腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的機(jī)制研究

張桂芝，方向群

（中國人民解放軍總醫(yī)院南樓呼吸科，北京100853）

目的分析紫杉醇類抗腫瘤藥物紫杉醇參與逆轉(zhuǎn)肺部腫瘤細(xì)胞免疫逃逸機(jī)制，為治療肺部腫瘤提供參考。方法采用Lewis肺癌細(xì)胞株和紫杉醇（5×108mol/L）處理細(xì)胞株抗原肽轉(zhuǎn)運(yùn)體（TAP），通過流式單抗TAP1及TAP2進(jìn)行體外試驗(yàn)檢測，體內(nèi)試驗(yàn)分為腫瘤組和化療組，并設(shè)置空白對照組，化療組小鼠采用Lewis肺癌細(xì)胞株經(jīng)尾靜脈注射成瘤，取小鼠肺部組織，采用流式三染法測定調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）。結(jié)果經(jīng)紫杉醇處理的Lewis肺癌細(xì)胞株紫杉醇組表面TAP1表達(dá)為（5.68±0.65）%，TAP2表達(dá)為（89.54±4.81）%，顯著高于Lewis肺癌細(xì)胞株組的（1.93±0.25）%和（66.84±5.16）%（P＜0.05）；正常小鼠Treg細(xì)胞表達(dá)為（12.45±1.53）%，顯著低于荷瘤小鼠肺部Treg細(xì)胞表達(dá)的（25.49±2.29）%（P＜0.01）；紫杉醇化療組小鼠肺部Treg細(xì)胞表達(dá)為（17.52±2.28）%，顯著低于荷瘤小鼠肺部Treg細(xì)胞表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)論紫杉醇類抗腫瘤藥物紫杉醇可能通過消除腫瘤局部Treg的產(chǎn)生，部分參與逆轉(zhuǎn)肺部腫瘤細(xì)胞免疫逃逸機(jī)制。

肺部腫瘤；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；紫杉醇

在腫瘤常規(guī)治療中，常用的化學(xué)療法主要通過最大限度殺傷腫瘤細(xì)胞達(dá)到治療目的［1］。但化療藥物的使用會在不同程度上損壞機(jī)體免疫系統(tǒng)［2-3］。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，一些化療藥物對患者自身免疫并無太大影響，但能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫活性，并抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg），增強(qiáng)機(jī)體免疫力［4］。紫杉醇類抗腫瘤藥物紫杉醇就是一個代表。本研究中以小鼠為研究對象，探討了紫杉醇參與逆轉(zhuǎn)肺部腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 材料與動物

小牛血清（美國Gibco公司）；重組鼠源性GM-CSF，IL-4（Peprotech公司）；PE-CD11b，APC-B220，PEFoxP3等（Biolegend公司）；FITC-MB1，F(xiàn)ITC-Calreticulin，F(xiàn)ITC-TAP2等流式一抗（Biotechnologies公司）；流式二抗（DAKO公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

將培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞分為兩組，Lewis肺癌細(xì)胞株（3LL，中科院細(xì)胞研究所）組的細(xì)胞在RPMI-1640完全培養(yǎng)，放置在培養(yǎng)箱中（溫度37℃，5%CO2）培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后細(xì)胞消化貼壁生長。另外一組細(xì)胞為紫杉醇組，采用與Lewis肺癌細(xì)胞株同樣的培養(yǎng)方法，在細(xì)胞貼壁生長5 d后，在培養(yǎng)液中加入5×108mol/L紫杉醇（上海施貴寶制藥有限公司，批準(zhǔn)文號H20080613，規(guī)格為每支16.7mL∶100mg），培養(yǎng)2 d后收集細(xì)胞。小鼠購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證編號：SCXK（冀），20080103，C57BL/6，雄性，體重24～35 g；飼養(yǎng)條件為溫度20～26℃，相對濕度50%，光照12 h，水瓶每周更換2次。將兩組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，每支細(xì)胞懸液管加單細(xì)胞（2～5）×106mol/L，采用PBS（北京生物制品研究所，國藥準(zhǔn)字S10850002，規(guī)格為1.0mL）洗滌，在常溫下采用多聚甲醛（2%）固定20min，洗滌轉(zhuǎn)移至玻璃試管中，微波處理直至沸騰，冰浴冷凍，采用PBS（含1%BSA）洗滌，樣品采用BSA（1%）和PBS（0.1%皂角苷）滲透0.5 h，加入同型對照，加入FITC-TAP1和FITC-TAP2，室溫下作用30min，分別采用PBS（含1%BSA）、PBS（0.1%皂角苷）洗滌2次，加入流式二抗，室溫下作用30min，再次采用PBS（含1%BSA）、PBS（0.1%皂角苷）洗滌2次，采用多聚甲醛（0.5%）固定，檢測。

取0.3×1063LL腫瘤細(xì)胞，加入500μL PBS溶液制成懸浮液，通過小鼠尾靜脈注入懸浮液，接種后，將小鼠隨機(jī)分為化療組、腫瘤組和對照組，3組小鼠尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞8 d后，化療組小鼠每只接種0.012 5mg紫杉醇，加入500μL PBS溶液制成懸浮液。腫瘤組小鼠胸腔內(nèi)注射PBS溶液（500μL），作用21 d后，分別取3組小鼠肺部細(xì)胞，重復(fù)試驗(yàn)3次，空白組小鼠注射等量生理鹽水。

混合透明質(zhì)酸酶、DNA酶和膠原酶，取出小鼠肺部組織細(xì)胞，采用眼科手術(shù)剪剪碎肺部組織，將組織放置在4.5 mL混合酶中，在培養(yǎng)箱（溫度37℃，5%CO2）中培養(yǎng)20 min，取出磨碎，將磨碎后的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸浮液，濃度設(shè)定在1×106個/mL。FACS緩沖液洗滌→加入FoxP3固定液→室溫作用20 min→緩沖液洗滌→懸浮液→避光反應(yīng)15min→洗滌，將懸浮液分為5管，設(shè)置同型對照，在試管中分別加入FITC-CD11b，PE-CD11b，APC-B220，APC-B220+FITCCD4+PE-FoxP3和生理鹽水等各20μL，室溫下避光反應(yīng)30 min，洗滌后分析。CD25及CD4雙陽性細(xì)胞采用二維點(diǎn)陣圖勾勒，確定FoxP3細(xì)胞與Treg細(xì)胞比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。小鼠肺部腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)抗原肽轉(zhuǎn)運(yùn)體（TAP）表達(dá)、肺部Treg細(xì)胞表達(dá)以±s表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肺部腫瘤細(xì)胞表面TAP表達(dá)

經(jīng)紫杉醇處理的Lewis肺癌細(xì)胞株表面TAP1與TAP2表達(dá)顯著高于Lewis肺癌細(xì)胞株組（P＜0.05），詳見表1。

表1 肺部腫瘤細(xì)胞表面TAP表達(dá)（±s，%）

表1 肺部腫瘤細(xì)胞表面TAP表達(dá)（±s，%）

組別紫杉醇組Lewis肺癌細(xì)胞株組P值TAP1 5.68±0.65 1.93±0.25 0.006 TAP2 89.54±4.81 66.84±5.16 0.036

2.2 流式分析定義Treg細(xì)胞

前向散射儀和側(cè)向散射儀參數(shù)勾勒所需分析的細(xì)胞定為R1，見圖1 A；CD25和CD4雙陽性細(xì)胞定為R2，見圖1 B；Treg細(xì)胞為R2陽性表達(dá)細(xì)胞，見圖1 C。

圖1 Trep細(xì)胞流式分析圖

2.3 肺部腫瘤局部Treg細(xì)胞表達(dá)

肺部腫瘤局部Treg細(xì)胞表達(dá)見圖2。其中圖2 A為正常小鼠肺部Treg細(xì)胞表達(dá)，圖2 B為生理鹽水治療小鼠肺部Treg細(xì)胞表達(dá)，圖2 C為紫杉醇治療后小鼠Treg細(xì)胞表達(dá)，圖中黑色表示CD25+CD4+FoxP3+Treg細(xì)胞。正常小鼠Treg細(xì)胞表達(dá)為（12.45±1.53）%，顯著低于荷瘤小鼠肺部Treg細(xì)胞表達(dá)的（25.49±2.29）%（P＜0.01），紫杉醇化療組小鼠肺部Treg細(xì)胞表達(dá)為（17.52±2.28）%，顯著低于荷瘤小鼠肺部Treg細(xì)胞表達(dá)（P=0.004）。

圖2 肺部腫瘤局部Trep細(xì)胞表達(dá)圖

3 討論

紫杉醇是從紫衫樹皮中提取的具有高效抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物，具有明確的抗腫瘤效果，是目前公認(rèn)的新型抗腫瘤藥物［5］。目前對紫杉醇抗癌機(jī)制的研究一直是熱點(diǎn)，研究紫杉醇參與逆轉(zhuǎn)肺部腫瘤細(xì)胞免疫逃逸機(jī)制具有顯著的理論和應(yīng)用價值。

紫杉醇是目前肺部腫瘤化療首選藥物，一般認(rèn)為，紫杉醇能結(jié)合到β-微管蛋白N端31位氨基酸，促進(jìn)微管聚合穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G2/M期，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的快速分裂、死亡［6］。也有研究指出，紫杉醇在阻滯腫瘤細(xì)胞有絲分裂中，可能通過抑制有絲分裂所需要的微管網(wǎng)正常動態(tài)再生而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用。本研究中試圖通過紫杉醇對逆轉(zhuǎn)肺部腫瘤逃脫免疫監(jiān)視來揭示紫杉醇的抗腫瘤作用。

在以往的分析中，關(guān)于紫杉醇參與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）逆轉(zhuǎn)肺癌免疫逃逸的研究國內(nèi)很少報(bào)道。國外有研究指出，紫杉醇可抑制腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞免疫抑制，達(dá)到巨噬細(xì)胞恢復(fù)免疫因子能力［7］。體外研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇能促進(jìn)白細(xì)胞介素（IL）-12的產(chǎn)生，糾正腫瘤誘導(dǎo)引起的免疫功能失常。本研究中主要分析紫杉醇對TAP表達(dá)和Treg的影響來反映抗腫瘤機(jī)制。TAP是參與腫瘤抗原傳遞重要蛋白質(zhì)，TAP1和TAP2是其2個重要亞單位，主要負(fù)責(zé)細(xì)胞抗原肽段的轉(zhuǎn)運(yùn)［8］，其表達(dá)下降意味著腫瘤組織復(fù)合物表達(dá)下降，也就是腫瘤復(fù)制出現(xiàn)異常，若腫瘤呈現(xiàn)出弱抗原性，將會導(dǎo)致抗原無法被正常傳遞給CD8+，從而實(shí)現(xiàn)監(jiān)管免疫。在以往的分析中，腫瘤免疫逃脫機(jī)制也包括外周耐受［9］，即腫瘤免疫逃逸通過Treg作用實(shí)現(xiàn)，Treg可通過細(xì)胞基礎(chǔ)依賴性機(jī)制抑制免疫細(xì)胞功能，也可通過與效應(yīng)細(xì)胞競爭抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［10］。鐘華等［11］在研究紫杉醇作用機(jī)制中，通過調(diào)節(jié)TAP表達(dá)可達(dá)到抗腫瘤效果，以往研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致。5×108mol/L紫杉醇曾被認(rèn)為能刺激體內(nèi)抗原遞呈細(xì)胞發(fā)揮作用，故在本研究中，紫杉醇組小鼠體外注射紫杉醇濃度為5×108mol/L，每只小鼠0.012 5mg，結(jié)果經(jīng)紫杉醇處理的Lewis肺癌細(xì)胞株表面TAP1和TAP2表達(dá)顯著高于Lewis肺癌細(xì)胞株組（P＜0.05），提示紫杉醇能上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面MHC-I類分子的表達(dá)。在分析紫杉醇對局部Treg細(xì)胞表達(dá)中，Treg細(xì)胞檢測分析采用流式三染法技術(shù)，結(jié)果正常小鼠Treg細(xì)胞表達(dá)顯著低于荷瘤小鼠肺部Treg細(xì)胞表達(dá)（P＜0.01），紫杉醇化療組小鼠肺部Treg細(xì)胞表達(dá)顯著低于荷瘤小鼠肺部Treg細(xì)胞表達(dá)（P=0.004），表明紫杉醇具有抑制消除Treg效果，證實(shí)了化療與自身機(jī)體的免疫并不是簡單的對抗關(guān)系，在藥物和劑量合適情況下，能促進(jìn)腫瘤抗原的暴露，從而促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答的發(fā)生。

總之，紫杉醇可能部分參與逆轉(zhuǎn)肺部腫瘤細(xì)胞免疫逃逸機(jī)制，能消除腫瘤局部Treg的產(chǎn)生，化學(xué)治療藥物能系統(tǒng)清除腫瘤抗原，提高腫瘤抗原特異性效應(yīng)細(xì)胞比例，提高自身免疫。

［1］夏學(xué)軍，王艷寶，徐佳茗，等.高效液相色譜法測定紫杉醇亞微乳含量［J］.中國藥業(yè)，2014，23（3）：26-27.

［2］婁娜娜，楊衿記，嚴(yán)紅虹，等.吉非替尼與紫杉醇聯(lián)合卡鉑治療晚期肺腺癌患者的效果分析［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2014，94（30）：2337-2 341.

［3］周嬋，李月雅，楊等霞，等.EP/CE聯(lián)合與不聯(lián)合紫杉醇方案治療復(fù)合性小細(xì)胞肺癌的臨床價值［J］.中國腫瘤臨床，2015，10（2）：91-95.

［4］王婷，馬云.紫杉醇聯(lián)合替吉奧一線治療晚期胃癌25例生存分析［J］.中國藥業(yè)，2013，22（5）：69-71.

［5］張蓉，李斌，白萍，等.紫杉醇聯(lián)合鉑類在局部晚期宮頸癌新輔助化療中的應(yīng)用［J］.中華腫瘤雜志，2011，33（8）：616-620.

［6］鄧穎，鄧春美，胡洪林，等.奈達(dá)鉑或順鉑聯(lián)合紫杉醇同步放化療局部晚期鼻咽癌的療效比較［J］.實(shí)用癌癥雜志，2011，26（2）：175-177.

［7］戚麟，高天慧，劉明月，等.紫杉醇脂質(zhì)體與普通紫杉醇治療胃癌療效比較［J］.山東醫(yī)藥，2011，51（16）：66-67.

［8］孔德鑫，黃夕洋，李鋒，等.基于FTIR的曼地亞和南方紅豆杉不同部位紫杉醇含量分析與評價［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2011，31（3）：656-660.

［9］周蔚，周彩存，孟淑燕，等.靶向肺癌的紫杉醇長循環(huán)脂質(zhì)體抑瘤作用研究［J］.腫瘤，2011，31（3）：203-209.

［10］郭守俊，曾紅學(xué)，康昭洵，等.紫杉醇聯(lián)合奧沙利鉑與順鉑治療老年晚期非小細(xì)胞肺癌的臨床研究［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2011，27（14）：2 634-2 636.

［11］鐘華，韓寶惠.紫杉醇通過上調(diào)TAP-1，TAP-2以及消除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞逆轉(zhuǎn)肺癌免疫逃逸［J］.中國肺癌雜志，2010，13（10）：937-941.

Immune Escape Mechanism s of Paclitaxel Involved in Reversal Lung Cancer Cells

Zhang Guizhi，F(xiàn)ang Xiangqun
（Department of Respiration，South Building，Chinese PLA General Hospital，Beijing，China 100853）

Objective To analyze immune escape mechanisms of paclitaxel involved in reversal lung cancer cells.Methods The cell line antigen peptide transporter（TAP）was processed adopted Lewis lung carcinoma cells lines and paclitaxel 5×108mol/L，in vitro assay was performed by flow through monoclonal TAP1，TAP2.In vivo test was divided into the tumor group and the chemotherapy group，and control group was set.The chemotherapy group was adopted Lewis lung carcinoma cell lines via the tail vein injection into the tumor，the mice lung tissue was selected，the flow was determined by three-regulatory T cells staining（Treg）.Results The TAP1 and TAP2 of Lewis lung cell surface treated by paclitaxel was（5.68±0.65）%and（89.54±4.81）%，which were significantly higher than（1.93±0.25）%and（66.84±5.16）%of the Lewis lung carcinoma cell line group，respectively（P＜0.05），the Treg cells of normal mice was（12.45±1.53）%，which was significantly lower than（25.49±2.29）%of mice lung Treg cells（P＜0.05）；the Treg of cells paclitaxel mice lung was（17.52±2.28）%，which was significantly lower than that of mice lung cells（P＜0.05）.Conclusion Taxol anticancer drugs paclitaxel may eliminate tumors Treg by local regulatory T cells，and partly involved in reversing lung tumor cell immune escape mechanisms.

lung cancer；regulatory T cells；paclitaxel

R285.5；R286

A

1006-4931（2015）22-0041-03

張桂芝（1970-），女，江蘇豐縣人，博士研究生，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)榉尾磕[瘤診治，（電話）010-66876230；方向群（1967-），男，浙江淳安人，博士研究生，主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)榉尾扛腥荆疚耐ㄓ嵶髡撸娫挘?10-66876230。

2015-05-13；

2015-08-19）