肺炎克雷伯菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、頭孢菌素酶和qnr基因檢測及耐藥分析

張欣欣，王勇，楊慶斌

（安徽省合肥市第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽合肥230001）

肺炎克雷伯菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、頭孢菌素酶和qnr基因檢測及耐藥分析

張欣欣，王勇，楊慶斌

（安徽省合肥市第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽合肥230001）

目的檢測痰標本中肺炎克雷伯菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）、頭孢菌素酶（AmpC酶）和qnr基因的存在情況及耐藥性，為臨床合理使用抗菌藥物提供參考。方法收集痰標本中分離到的肺炎克雷伯菌114株，用瓊脂稀釋法檢測耐藥性，三維試驗法和聚合酶鏈式反應（PCR）法檢測ESBLs酶、AmpC酶及qnr基因存在情況。結果114株肺炎克雷伯菌中，ESBLs陽性58株（50.88%），產(chǎn)AmpC酶14株（12.28%），同時產(chǎn)ESBLs和AmpC酶10株（8.77%），qnr陽性2株；產(chǎn)酶株對抗菌藥物的耐藥率顯著高于不產(chǎn)酶株。結論痰標本中肺炎克雷伯菌耐藥基因的檢測率較高，多重耐藥明顯；碳青霉烯類具有較好的抗菌活性。

肺炎克雷伯菌；細菌耐藥；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶；頭孢菌素酶

肺炎克雷伯菌為呼吸道感染重要致病菌，患者病死率較高［1］。近年來，隨著抗菌藥物應用強度及程度的增加，肺炎克雷伯菌對抗菌藥物的耐藥率呈不斷升高趨勢。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）、頭孢菌素酶（AmpC酶）和qnr基因為肺炎克雷伯菌當前耐藥的重要原因。筆者收集了114株痰標本中分離到的肺炎克雷伯菌，對其進行ESBLs，AmpC酶和qnr耐藥基因檢測及耐藥性分析，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集來自安徽省多家醫(yī)院送檢的痰標本中分離出的114株肺炎克雷伯菌，菌株鑒定均由Vitek全自動微生物分析系統(tǒng)完成。

1.2 藥物敏感性試驗

采用瓊脂稀釋法，操作和結果判讀按照美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）2012版標準進行。其中選擇大腸埃希菌ATCC25922為不產(chǎn)酶株，陰溝腸桿菌029M為AmpC酶質控菌株，肺炎克雷伯菌ATCC700603為ESBLs質控菌株，菌株均由安徽省細菌耐藥監(jiān)控中心提供。氨芐西林（AMP，山東齊魯制藥有限公司），哌拉西林他唑巴坦（TZP，美國Wyeth-Ayerst公司），頭孢呋辛（CXM，上海新亞藥業(yè)有限公司），頭孢噻肟（CTX，安徽威爾曼制藥有限公司），頭孢曲松（CRO，臺灣泛生制藥廠股份有限公司），頭孢他啶（CAZ，葛蘭素史克公司），頭孢吡肟（FEP，中美上海施貴寶制藥有限公司），頭孢西丁（FOX，海口制藥廠有限公司），氨曲南（ATM，江西制藥有限責任公司），亞胺培南西司他丁（IMP，默沙東公司），美羅培南（MEM，日本住友制藥株式會社），慶大霉素（GEN，上海第一生化藥業(yè)有限公司），環(huán)丙沙星（CIP，廣州南新制藥有限公司），加替沙星（GAT，南京圣和藥業(yè)有限公司），左氧氟沙星（LVX，江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司），阿米卡星（AMK，上海旭東海普藥業(yè)有限公司）。

1.3 Am pC酶及ESBLs檢測

酶粗提物制備：參考文獻［2］描述的方法培養(yǎng)細菌，獲得菌體沉淀，反復凍融提取細菌酶液，在4℃以10 000 r/min離心10min提取上清液。上清液經(jīng)MH瓊脂平板細菌培養(yǎng)陰性后置-20℃冰箱保存，備用。

AmpC酶和ESBLs檢測：參考文獻［2］提供的方法行AmpC酶和ESBLs的三維試驗檢測。將受試菌液接種MH瓊脂平板上，取頭孢西丁紙片置平皿中心，余操作按步驟進行。如觀察到狹槽與抑菌圈交接處出現(xiàn)擴大的長菌區(qū)，視為AmpC酶三維試驗陽性。ESBLs檢測時用頭孢曲松取代頭孢西丁，余操作相同，如在狹槽與頭孢曲松交界處出現(xiàn)擴大的細菌生長區(qū)域，視為ESBLs陽性。

1.4 細菌質粒提取與聚合酶鏈式反應（PCR）擴增

對其中10株同時產(chǎn)ESBLs和AmpC酶的肺炎克雷伯菌行qnr基因PCR擴增，直接煮沸法提取細菌質粒。根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中公布的qnr基因序列設計PCR擴增引物，引物由北京賽百盛公司合成。PCR反應體系（50μL）包含：10×buffer 5μL，dNTPS mixture（2.5mmol/L）4μL，上下游引物各1μL（10μmol/L），rTaq酶（5μ/L）0.25μL，質粒模板4μL，上述試劑均購自大連寶生物公司。引物序列P1：5′-TCAGCAAGAGGATTTCTCA3′，P2：5′-GGCAGCACTATTACTCCCA 3′。PCR反應條件：預變性94℃5min，變性94℃1min，退火溫度48℃40 s，72℃延伸1min共35次循環(huán)，再72℃延伸5min。擴增片段長度為627 bp，擴增過程中以大腸埃希菌ATCC25922及空白為陰性對照，標準產(chǎn)酶株為陽性對照。選取PCR擴增陽性的產(chǎn)物送上海生工公司進行純化測序，測序儀器為ABIPRISM3730，測序試劑為BigDye terminator v 3.1，測序結果由GenBank blast程序行比對確定。

2 結果

2.1 產(chǎn)ESBLs及Am pC酶檢測

在114株肺炎克雷伯菌標本中，其中產(chǎn)ESBLs58株，陽性率達50.88%；產(chǎn)AmpC酶14株，陽性率達12.28%；同時產(chǎn)ESBLs和AmpC酶10株，陽性率為8.77%。

2.2 PCR擴增

10株肺炎克雷伯菌行PCR擴增后，2株qnr檢測陽性。將測序結果上網(wǎng)比對，與GenBank數(shù)據(jù)庫所提供的qnr基因序列一致。

2.3 肺炎克雷伯菌耐藥試驗

結果見表1。AmpC酶、ESBLs及同時產(chǎn)AmpC酶和ESBLs菌株對16種抗菌藥的耐藥率均高于陰性菌株，其中產(chǎn)ESBLs菌株僅對美羅培南、亞胺培南、哌拉西林他唑巴坦、頭孢他啶敏感，對其余抗菌藥物的耐藥率均達50%以上；產(chǎn)AmpC酶菌株除對碳青霉烯類藥物敏感外，其他抗菌藥物耐藥率基本在60%以上，且產(chǎn)酶肺炎克雷伯菌株多重耐藥現(xiàn)象明顯。

表1 肺炎克雷伯菌對抗菌藥物的耐藥率檢測結果［株（%）］

3 討論

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院獲得性肺炎常見致病菌，分離率一直呈增多趨勢［3］。隨著抗菌藥物的大量應用，肺炎克雷伯菌對藥物的耐藥性也呈現(xiàn)不斷增強的趨勢，耐藥株不斷增多，多重耐藥現(xiàn)象也明顯［4-5］，這其中最主要的原因是其能產(chǎn)生大量ESBLs和AmpC酶。β-內(nèi)酰胺酶主要通過水解β-內(nèi)酰胺環(huán)，使β-內(nèi)酰胺類抗生素喪失活性。肺炎克雷伯菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的重要機制就是產(chǎn)生ESBLs，ESBLs通過水解青霉素、廣譜頭孢菌素及單環(huán)β-內(nèi)酰胺類藥物的β-內(nèi)酰胺酶，導致抗生素耐藥。本研究中檢測了114株痰標本中肺炎克雷伯菌，其ESBLs陽性率高，達50%左右，可能與本地區(qū)醫(yī)院抗生素使用強度和種類有關，易誘導ESBLs產(chǎn)生。產(chǎn)ESBLs株僅對碳青霉烯類、哌拉西林他唑巴坦及頭孢他啶較敏感，對其余抗菌藥物的耐藥率均達50%以上，耐藥率較高。非產(chǎn)酶株對抗菌藥物的耐藥率幾乎均小于35%（除氨芐西林），產(chǎn)酶株對抗菌藥物的耐藥率明顯高于不產(chǎn)酶株。哌拉西林他唑巴坦較敏感，提示含有酶抑制劑的抗菌藥物可提高對產(chǎn)酶菌株的敏感性。頭霉素類抗菌藥物如頭孢西丁對產(chǎn)ESBLs細菌有較好的抗菌作用，但本試驗結果顯示，其耐藥性高，且頭霉素類易誘導細菌產(chǎn)生AmpC酶，故臨床不宜應用。檢測提示頭孢他啶相對較敏感，可能與本地區(qū)頭孢他啶的使用率較低及基因表型有關。因ESBLs基因存在多種表型，對頭孢菌素的水解能力有差異。但因臨床治療效果不佳，故其使用仍需慎重。

目前對AmpC酶穩(wěn)定的藥物主要有碳青霉烯類和第4代頭孢菌素類（如頭孢吡肟）。本檢測結果顯示，AmpC酶株對包括頭孢吡肟在內(nèi)的抗菌藥物耐藥率基本在60%以上，可能與第4代頭孢使用強度高及這14株中的10株同時產(chǎn)ESBLs酶有關，導致其耐藥率較高，應引起重視。但碳青霉烯類藥物仍具有較高的敏感度，故一旦發(fā)現(xiàn)AmpC酶陽性株，應首選。

肺炎克雷伯菌對抗菌藥物耐藥率高的主要原因是其能產(chǎn)生大量的ESBLs和AmpC酶，可通過質粒介導，導致耐藥菌的傳播［6-7］。肺炎克雷伯菌是多種耐藥質粒主要的宿主之一，因整合子、轉座子等作用，1種質粒可同時攜帶多個耐藥基因，使得產(chǎn)ESBLs和AmpC酶的肺炎克雷伯菌表現(xiàn)為多重耐藥。在114株肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)有10株同時產(chǎn)ESBLs酶和AmpC酶，陽性率達8.77%，本檢測結果顯示，除亞胺培南及美羅培南敏感外，對其余抗菌藥物藥率均超過60%，多重耐藥比較嚴重。

細菌對喹諾酮類藥物的耐藥機制主要有藥物作用靶位的改變、膜通透性改變及主動外排機制，這些機制由染色體介導，為主動耐藥機制［8-9］。qnr基因編碼的蛋白可保護細菌免受喹諾酮類藥物的攻擊，從而增強細菌的耐藥性［10-11］。qnr蛋白僅引起對喹諾酮類藥物的較低水平耐藥，但由于其具有對其他耐藥突變的保護作用，使菌群能達到二次突變的濃度，從而使細菌發(fā)生更高程度的耐藥［12-13］。本研究中檢測出2株qnr陽性，均同時產(chǎn)ESBLs及AmpC株，除美羅培南、亞胺培南外，其他14種抗菌藥均耐藥。雖然qnr基因檢測率較低，但由于qnr基因所在的質粒常攜帶其他耐藥基因（如aac，bla等），可在同種或不同細菌之間傳播，引起細菌耐藥性的增加，故臨床危害大。

綜上所述，痰標本中分離的肺炎克雷伯菌產(chǎn)生ESBLs及AmpC酶、qnr基因存在可能是其對抗菌藥物耐藥或多重耐藥的主要原因。產(chǎn)酶菌除碳青霉烯類敏感，對大多數(shù)抗菌藥物耐藥率高。我國耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物的耐藥率為10%左右，雖然大多數(shù)菌株仍對其敏感，但美國2011年發(fā)生了碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌流行［14］，值得警惕。為防止肺炎克雷伯菌感染的發(fā)生和流行，只有合理應用抗菌藥物，嚴格掌握用藥原則；同時及時準確地進行細菌培養(yǎng)及ESBLs與AmpC酶、qnr基因的檢測，才能為臨床合理應用抗菌藥物提供依據(jù)，以防止耐藥菌產(chǎn)生。

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Analysis of Drug Resistance and Detection of ESBLs，Am pCβ-lactamases and qnr in K lebsiella Pneum onia

Zhang Xinxin，Wang Yong，Yang Qingbin
（Department of Respiratory Medicine，Hefei Second People′s Hospital，Hefei，Anhui，China 230001）

Objective To investigate the antibiotic resistance and detection of ESBLs，Ampcβ-lactamases and qnr in Klebsiella pneumonia isolated from the sputum，and to provide reference for clinical rational use of antibiotics.Methods A total of 114 strains of Klebsiella pneumonia were selected，Agar dilution test was used in susceptibility testing.The Genotes of ESBLs，AmpC and qnr was detected and analyzed by three-dimensional test and PCR.Results In the 114 strains of Klebsielinsla pneumonia，58 strains（50.88%）produced ESBLs and 14（12.28%）produced AmpCβ-lactamases，10（8.77%）produced both ESBLs and AmpCβ-lactamases，2 strains carried qnr；The rates of resistance to most antibiotics in drug resistant enzyme strain were higher than negative counterparts.Conclusion The Klebsiella Pneurnonia Producing drug-resistant gene isolated from the sputum are common，most of them are multiple drug resistant.Almost all strains were susceptible to Carbapenem.

Klebsiella pneumonia；resistance to Drug；qnr；ESBLs；Ampc

R969.3；R915

A

1006-4931（2015）22-0054-03

2015-05-13）