內質網應激PERK-ATF4-CHOP通路在苦參堿誘導視網膜母細胞瘤細胞凋亡中的作用

來小丹，歐陽凈，石英

（中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院藥劑科，重慶400038）

內質網應激PERK-ATF4-CHOP通路在苦參堿誘導視網膜母細胞瘤細胞凋亡中的作用

來小丹，歐陽凈，石英

（中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院藥劑科，重慶400038）

目的探討內質網應激PERK-ATF4-CHOP通路在苦參堿誘導視網膜母細胞瘤細胞凋亡中的作用。方法采用0，1.0，2.0，4.0 g/L苦參堿處理HOX-Rb44細胞24 h，MTT、流式細胞術分析細胞增殖活性及凋亡情況，Western Blot檢測凋亡相關蛋白Bax，Bcl-2，內質網應激相關蛋白GRP94，GRP78，ATF4以及PERK下游peIF2α及CHOP蛋白表達水平。結果隨著苦參堿質量濃度的增加，HOX-Rb44細胞增殖抑制增加，凋亡率顯著升高（P＜0.05），GRP78與GRP94的表達水平逐漸升高，ATF及PERK下游peIF2α及CHOP蛋白表達升高。結論苦參堿處理視網膜母細胞瘤細胞能誘導細胞凋亡，內質網應激、PERK-ATF4-CHOP通路可能在其中有重要作用。

內質網應激；苦參堿；視網膜母細胞瘤；細胞凋亡

視網膜母細胞瘤（Rb）是小兒科常見的眼內惡性腫瘤，發病率居眼內惡性腫瘤的首位，嚴重威脅患兒的視力及生命［1］。在尚未擴展期對該病患兒給予及時治療，存活率可達95%［2］。內質網應激是介導細胞凋亡的獨立于死亡受體和線粒體途徑的第3條凋亡通路，近年研究表明，其參與帕金森病及阿爾茨海默病等疾病的發病，對神經細胞的凋亡有重要作用。內質網發生應激時蛋白激酶R樣內質網激酶（PERK）與Bip解離，PERK自身磷酸化被激活，磷酸化eIF2，抑制蛋白反應過程，包括下游激活轉錄因子4（ATF4），ATF4作為轉錄因子上調內質網分子伴侶和參與氨基酸轉運蛋白質的轉錄表達，有助于恢復內質網穩態［3］。ATF4持續過表達將促進細胞凋亡誘導基因的表達上調，如轉錄因子CHOP等［4］，最終導致細胞死亡［5］。苦參堿是苦參生物堿的主要活性成分。近年臨床及藥理學研究表明，苦參堿具有抗纖維化、抗病毒、抗炎、抗腫瘤等作用，能抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡作用，此外，張璐燁［6］的研究顯示，苦參堿能促進HOX-Rb細胞凋亡，減少Rb細胞mRNA表達，降低細胞端粒酶活性，抑制細胞增殖。本研究中對內質網應激PERK-ATF4-CHOP通路在苦參堿誘導Rb細胞凋亡中的作用，為尋找藥物干預關鍵節點，發現潛在的藥物作用靶點，為Rb臨床藥物的研發提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 儀器與試藥

流式細胞儀FACSAriaTM及分析軟件（美國BD公司）；熒光顯微鏡（美國Leica公司）；多功能離心機（瑞士Tecna公司）；垂直電泳槽（美國Bio-rad公司）；CO2培養箱（Sanyo公司，日本）。磷酸鹽緩沖液（PBS），RPMI-1640培養基（Gibcol），胎牛血清（Hyclone）；注射用青霉素鈉，注射用硫酸鏈霉素，四氮唑鹽（MTT），軟瓊脂，吖啶橙（AO），溴化乙啶（EB）均購自sigma公司；苦參堿注射液（廣州白云山明興制藥有限公司，國藥準字H10950071，規格為每支5 mL∶50 mg）。Model 550酶標儀（美國Bio-rad公司）；CO2細胞培養箱（美國Thermo Forma公司）；Hoechst 33342（北京雷根生物技術有限公司），人Rb細胞株（HXO-Rb44）來源于中南大學湘雅醫學院腫瘤研究所，一抗PERK，ATF4，CHOP及peIF2α等抗體購自Cell Signal公司。

1.2 方法

HXO-Rb44細胞培養：將細胞接種在含有RPMI-1640培養基，于37℃及5%CO2培養箱中培養。細胞懸浮生長，顯微鏡觀察細胞生長狀況及形態。培養1～2 d進行傳代，以離心半徑8 cm，1 200 r/min 4℃離心15min，棄上清液，加入配置好的含有10%胎牛血清、50 U/mL鏈霉素、青霉素的RPMI-1640培養基。細胞對數生長期加入不同質量濃度苦參堿處理，對照組給予等量RPMI-1640培養基，培養箱中培養24 h。

MTT法觀察細胞增殖情況：對數生長期HXO-Rb44細胞，胰酶消化制成細胞懸液，調整細胞濃度為20×104/mL，每孔種100μL細胞懸液加入不同質量濃度苦參堿溶液（1.0，2.0，4.0 g/L），并設置空白對照組，每孔加MTT溶液20μL，37℃繼續培養4 h后，終止培養，加二甲基亞砜（DMSO）200μL，避光振蕩15min混勻后，比色。腫瘤細胞生長抑制率（%）=（1-試驗組A490值/對照組A490）×100%。

細胞形態學觀察：收集細胞，加固定液，4℃固定10～20min，棄固定液，PBS洗2遍，棄上清液，保留約50μL，混勻后滴加在載玻片上，使細胞均勻分布，稍晾干后加500μLHoechst33342染液，染色5 min，吸水紙邊緣吸干后，PBS洗2遍，滴加抗熒光淬滅，熒光顯微鏡觀察。

流式細胞儀檢測細胞凋亡：將懸浮細胞直接收集到10mL離心管中，每個樣本有（1～5）×106個/mL細胞，1 000 r/min離心5min，棄去培養液。用孵育緩沖液洗滌1次，離心5min。用100μL的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育10～15 min。離心5 min沉淀細胞孵育緩沖液洗1次。加入熒光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20 min，避光并不時振動。流式細胞儀分析，激發光波長用488 nm，用一波長為515 nm的通帶濾器檢測異硫氰酸熒光素（FITC）熒光，另一波長于560 nm的濾器檢測碘化丙啶（PI）。

Western Blot檢測：收集細胞，加200μL裂解液（50 mmol/L Tris-Hcl pH 8.0，150 mmol/L PMSF，0.1%NP-40，蛋白酶抑制劑）。4℃，以離心半徑8 cm，12 000 r/min離心15min，取上清液，采用Bradford法檢測蛋白濃度；取上述制備的蛋白樣品50μg與等體積樣本緩沖液混合，沸水中加熱10min，冷卻后上樣到15% SDS-PAGE凝膠，電泳完畢后將蛋白電轉至硝酸纖維（NC）膜，轉膜后考馬斯亮藍染色凝膠，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉，分別加一抗，37℃孵育2 h，經0.1%TBST漂洗后加二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜后加ECL，X線膠片定影，掃描后用IPP 6.0進行圖像分析。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 不同濃度苦參堿對細胞增殖的影響

以MTT法檢測不同質量濃度苦參堿對HXO-Rb44增殖的影響，結果顯示其抑制率隨劑量增加而上升，呈明顯的劑量依賴性，處理質量濃度增加，吸光度降低，HXO-Rb44增殖抑制率顯著增加（P＜0.05），見表1。

表1 不同質量濃度苦參堿對HXO-Rb44增殖的影響（±s）

表1 不同質量濃度苦參堿對HXO-Rb44增殖的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

抑制率（%）0 g/L 6±0.045 3.72±0.021 1.0 g/L 1.426±0.038*17.21±1.161*2.0 g/L 1.018±0.044*36.52±2.461*4.0 g/L 0.864±0.037*49.52±3.047*

2.2 苦參堿處理后細胞凋亡情況

采用Hoechst33342/PI分析苦參堿處理后，隨著處理質量濃度的提高，HXO-Rb44細胞出現凋亡細胞核濃縮，呈現出亮藍色，在2.0 g/L和4.0 g/L苦參堿處理后死亡細胞被PI染色，見圖1。流式檢測細胞凋亡情況，結果顯示1.0，2.0，4.0 g/L苦參堿處理組對應的凋亡率分別為13.8%，21.9%及53.1%，顯著高于對照組。見圖2。

圖1 Hoechst33342/PI染色后熒光顯微鏡（×200）細胞凋亡情況

圖2 FCM檢測苦參堿處理后HXO-RB44細胞凋亡情況

2.3 PERK-ATF4-CHOP通路相關蛋白表達水平分析

Western blot法檢測了HOX-Rb44細胞GRP94及GRP78及凋亡相關蛋白的表達水平，顯示隨著苦參堿質量濃度的提高，HOX-Rb44細胞GRP78與GRP94的表達水平逐漸升高，提示高質量濃度苦參堿會誘導內質網應激。進一步分析了ATF4及PERK下游peIF2α及CHOP蛋白表達水平，顯示隨著苦參堿質量濃度的提高，ATF4及PERK下游peIF2α及CHOP蛋白表達水平升高，見圖3和表2。

3 討論

圖3 HOX-Rb44細胞GRP94，GRP78及凋亡相關蛋白的表達水平

表2 苦參堿作用后HOX-Rb44細胞相關蛋白定量分析結果（±s）

表2 苦參堿作用后HOX-Rb44細胞相關蛋白定量分析結果（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

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腫瘤的發生不僅由于細胞高增殖率，也與細胞凋亡受抑制有關，原癌基因的激活以及抑癌基因的失活，擾亂細胞的正常增殖、分化及凋亡，導致細胞增殖過度，分化不足，最終發展為腫瘤［7］。腫瘤治療往往是選擇快速分裂的細胞為靶細胞，但臨床學這種解釋差強人意［8］，可治療的癌癥有時生長緩慢，而抗藥性的癌癥也可能快速分裂，多項研究表明，治療可能是在腫瘤細胞中誘導凋亡，細胞凋亡試驗也是一種篩選抗癌藥物的快捷、有效的方法［9-10］。苦參堿是由中藥苦參中分離出的一類活性物質，是苦參生物堿的主要活性成分［11］，具有抗纖維化、抗病毒、抗炎、抗腫瘤等作用，能抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡［12］。苦參堿還能通過干擾細胞周期、降低端粒酶活性［13］、調控凋亡基因等多種機制，抑制腫瘤細胞分化和增殖，誘導凋亡［14-15］。

PERK是內質網膜上的跨膜蛋白，與GRP78解離后形成同源二聚體，并發生自身磷酸化被激活，PERK磷酸化被激活后使eIF2α磷酸化，并抑制其翻譯其實因子的功能，抑制大多數mRNA的翻譯，從而減少蛋白質的合成，減少內質網負荷，有助于恢復內質網的折疊和穩態［16］。eIF2α磷酸化能夠抑制大多數mRNA的翻譯，但ATF4mRNA翻譯增強，使ATF4合成增加，ATF4合成后轉錄到細胞核內，作為轉錄因子上調內質網分子伴侶和參與氨基酸轉運蛋白質的轉錄表達，同樣有助于恢復內質網穩態。如無法恢復內質網的穩態，將導致細胞死亡。研究表明，在缺乏PERK及ATF4的癌細胞中，在缺氧條件下細胞凋亡水平顯著增加，PERK-eIF2-AFT4通路在體內或體外環境下腫瘤細胞適應缺氧應激的重要因素。董傳芳等［17］的研究顯示，內質網應激在AGE-BSA誘導視網膜母細胞瘤SH-SY5Y細胞凋亡，且內質網相關蛋白GRP78，peIF2α及Caspase-12表達水平呈時間依賴性。

本研究中分別用不同質量濃度苦參堿處理細胞24 h，結果顯示，隨著苦參堿質量濃度的增加HOX-Rb44細胞凋亡率顯著升高；進一步分析內質網應激在苦參堿在誘導HOX-Rb44細胞凋亡中的作用，采用Western blot檢測了HOX-Rb44細胞GRP94及GRP78的表達水平，顯示GRP78與GRP94在處理組顯著較對照組升高；本研究中還分析了PERK信號通路peIF2α，ATF4及CHOP蛋白表達水平，顯示苦參堿處理24 h后HOX-Rb44細胞peIF2α及CHOP蛋白表達水平顯著升高。蛋白聚集激活eIF2a激酶-PERK并引起未折疊蛋白反應，觸發內質網應激，eIF2a的磷酸化亦會導致翻譯的普遍抑制，其中包括ATF4。而CHOP被PERK下游轉錄因子ATF4等誘導，啟動GADD34，Bim等基因，觸發細胞凋亡。因此，采用苦參堿處理Rb細胞能誘導細胞凋亡，出現內質網應激，PERK-ATF4-CHOP信號通路可能在其中有重要作用。

［1］宋芳，畢婧瑋，韓宇，等.視網膜母細胞瘤患兒家長親職壓力及其相關因素的調查研究［J］.中國實用護理雜志，2013，29（z2）：2.

［2］曾洵.多西紫杉醇及聯合卡鉑對人視網膜母細胞瘤株SORB50的增殖抑制［D］.昆明：昆明醫學院，2008.

［3］Bejarano-Escobar R，Blasco M，Durán AC,et al.Chronotopographical distribution patterns of cell death and of lectin-positive macrophages/microglial cells during the visual system ontogeny of the small-spotted catshark Scyliorhinus canicula［J］.JAnat，2013，223（2）：171-184.

［4］Notte A，Rebucci M，Fransolet M,et al.Taxol-induced unfolded protein response activation in breast cancer cells exposed to hypoxia：ATF4 activation regulates autophagy and inhibits apoptosis［J］.Int JBiochem Cell Biol，2015，62：1-14.

［5］Dai ZJ，Wang XJ.Association between APE1 Single Nucleotide Polymorphism（rs1760944）and Cancer Risk：a Meta-Analysis Based on 6，419 Cancer Cases and 6，781 Case-free Controls［J］.JCancer，2014，5（3）：253-259.

［6］張璐燁.苦參堿對視網膜母細胞瘤細胞survivin和端粒酶活性表達的影響［J］.醫學研究雜志，2013，42（8）：120-122.

［7］Bertin-Ciftci J，BarréB，Le Pen J,et al.pRb/E2F-1-mediated caspase-dependent induction of Noxa amplifies the apoptotic effects of the Bcl-2/Bcl-xL inhibitor ABT-737［J］.Cell Death Differ，2013，20（5）：755-764.

［8］吳林林.全反式維甲酸聯合放射線照射對食管癌細胞周期、凋亡及NF-κB、β-catenin、CyclinD1表達的影響［D］.石家莊：河北醫科大學，2008.

［9］林桂鳳，劉銀燕.去甲斑蝥素誘導腫瘤細胞凋亡機制的研究［J］.中國藥房，2007，18（16）：1 266-1 267.

［10］Hong S，Fang W.Risk of treatment-related deaths with vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors：a meta-analysis of 41 randomized controlled trials［J］.Onco Targets Ther，2014（7）：1 851-1 867.

［11］李哲清，方麗.苦參堿對人視網膜母細胞瘤細胞體外生長增殖的影響［J］.中國中醫眼科雜志，2011，21（3）：139-141.

［12］王文戰.氧化苦參堿誘導視網膜母細胞瘤細胞株SM-106凋亡的研究［J］.中國現代藥物應用，2009，3（15）：83-84.

［13］Ding PL，Liao ZX.（+）-12alpha-Hydroxysophocarpine，a new quinolizidine alkaloid and related anti-HBV alkaloids from Sophora flavescens［J］.Bioorg Med Chem Lett，2006，16（5）：1 231-1 235.

［14］申曉東，宋關斌，嚴潤彬.苦參堿和氧化苦參堿抗腫瘤作用的研究進展［J］.重慶大學學報：自然科學版，2005，28（6）：125-128.

［15］韋玉脈，黃贊松.苦參素抗腫瘤作用實驗與臨床研究進展［J］.右江民族醫學院學報，2008，30（4）：639-641.

［16］王輝，葉燕，禹志領，等.冬凌草甲素對HepG2細胞內質網應激蛋白IRE-1、PERK和CHOP的作用研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2012，23（3）：263-266.

［17］董傳芳，劉雪平，徐松，等.糖基化終末產物對SH-SY5Y細胞內質網應激的影響［J］.卒中與神經疾病，2012，19（2）：67-71.

Role of Endoplasmic Reticulum Stress PERK-ATF4-CHOP Pathway in Matrine Induced Retinoblastoma Apoptosis

Lai Xiaodan，Ouyang Jing，Shi Ying
（Department of Pharmacy，The First Affiliated Hospital of The Third Military Medical University，Chongqing，China 400038）

Objective To analyze the role of endoplasmic reticulum stress PERK-ATF4-CHOP pathway in matrine induced retinoblastoma cells apoptosis.Methods Different concentrations of 0,1.0,2.0,4.0 g/L matrine was used to treat the HOX-Rb44cells for 24 h，the cell viability was determined by MTT assay,HOX-RB44 apoptosis situation was determined by ow cytometry，western blot analysis was used to dectect the Bax，Bcl-2，GRP78，GRP94，AFT4，peIF2αand CHOP expression.Results As the increase of concentration of matrine，HOX-Rb44apoptosis rate increased significantly（P＜0.05）,GRP78 and GRP94 increased significantly,and ATF and PERK downstream peIF2αand CHOP were also increased significantly.Conclusion Matrine could promoted HOX-Rb44cell apoptosis,endoplasmic reticulum stress,where PERK-ATF4-CHOP pathway may play an important role.

endoplasmic reticulum stress；matrine；retinoblastoma；cell apoptosis

R285.5；R286

A

1006-4931（2015）22-0056-03

來小丹，女，碩士研究生，主管藥師，主要從事藥品采購工作，（電話）023-68754953（電子信箱）xiaodan-lai@ sina.com。

2015-05-13；

2015-08-04）