大豆磷脂對多發性腦梗死大鼠恢復期谷氨酸、γ-氨基丁酸含量及NMDA受體表達的影響

王從平，賈敏，李文靜，朱祖欣，劉群會

（湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫院神經內科，湖北恩施445000）

大豆磷脂對多發性腦梗死大鼠恢復期谷氨酸、γ-氨基丁酸含量及NMDA受體表達的影響

王從平，賈敏，李文靜，朱祖欣，劉群會

（湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫院神經內科，湖北恩施445000）

目的研究大豆磷脂對多發性腦梗死大鼠恢復期腦組織中谷氨酸（Glu）與γ-氨基丁酸（GABA）的含量及N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體各亞型表達的影響。方法對大鼠頸內動脈給予注射微球血管栓塞劑，建立大鼠多發性腦梗死模型，于腦梗死10 d后給予不同劑量的大豆磷脂，連續干預60 d。采用電子透射顯微鏡觀察并記錄腦組織的超微病理結構變化，采用高效液相色譜法分析腦組織中Glu和GABA的含量，采用免疫組化法分析腦組織中NMDA的受體各亞型，包括NR1，NR2A及NR2B的表達變化情況。結果與假手術組大鼠相比，模型組大鼠的恢復期腦組織的神經膠質細胞、神經元及突觸的超微結構均有變化，神經遞質Glu與GABA的表達均明顯減少，而NMDA的受體各亞型NR1，NR2A及NR2B的表達則明顯增加。結論大豆磷脂能改善大鼠多發性腦梗死恢復期腦組織的超微結構，并促進神經遞質Glu與GABA的合成分泌，抑制NMDA的受體各亞型NR1，NR2A和NR2B的表達，在一定程度上起到保護神經的作用。

大豆磷脂；多發性腦梗死；恢復期；N-甲基-D-天門冬氨酸受體

腦缺血的發病機制涉及到自由基攻擊、鈣離子超載、繼發性炎性反應及興奮性神經毒反應等聯合作用，病理學較復雜，主要表現為神經細胞受損或腦部功能性障礙［1］。大鼠發生腦缺血約30 d后會出現腦組織受損的連續病理學變化，提示腦組織發生缺血后需及時采取積極有效的治療方案以減輕缺血性損傷［2］。N-甲基-D-天門冬氨酸受體（NMDAR）在腦組織處于缺血缺氧狀態時產生興奮性神經毒性效應，進一步引發腦缺血受損，由于該神經毒性受谷氨酸（Glu）與γ-氨基丁酸（GABA）所誘導，故對其進行干預可保護缺血半暗帶的腦組織，加速腦功能的恢復［3］。腦梗死時，腦內的磷脂酶將被激活，其可分解磷脂使其含量下降，大豆磷脂可補充腦梗死大鼠腦內下降的磷脂，抑制腦部局灶性腦梗死大鼠腦中的Glu與GABA的分泌釋放，從而達到保護腦組織的作用［4］，但對于處于多發性腦梗死的恢復期，其是否還具有同樣的調節作用，需作進一步探討。本研究中建立了多發性腦梗死大鼠模型，分析了大豆磷脂對腦組織中Glu和GABA的釋放及NMDA受體的表達影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

試藥：大豆磷脂（黑龍江三江油脂廠，質量標準按1995年版《美國藥典》中卵磷脂的質量標準）。鹽酸美金剛片（丹麥靈北藥廠，國藥準字H20120268）；海藻酸鈉微球血管栓塞劑（KMG，北京圣醫耀科技公司，批號為20093770407）。免疫組化用一抗為NMDAR1（型號NBP1-20085）、NMDAR2A（型號NBP1-21459）、NMDAR2B（型號R-1001-100），均為兔抗大鼠的多抗，由美國NovusBiologicals公司生產；枸櫞酸鹽緩沖液、磷酸鹽（PBS）緩沖液、二氨基聯苯胺（DAB）及二抗（型號PV-6000）均為北京中杉金橋公司產品；水合氯醛（國藥集團化學試劑公司）。

主要儀器：電化學高效液相色譜儀及工作站（包括16通道Coularray陣列、542自動進樣器、582泵、5600A電化學檢測器及6210碳石墨電極）；可控溫元件（型號CTO-324，美國ESA公司）；低溫冷凍離心機（型號IECCL31R，美國Therm公司）；電子透射顯微鏡（型號H7500，日本日立公司）；顯微鏡（型號Nikon 55I）；水系（0.22μm）微孔濾膜（天津騰達過濾器廠）；分析天平（型號AG2245）與pH計（型號TELTA 320，上海Mettler Toledo公司）；切片機（型號LEICARM2235）。

動物：60只雄性SD大鼠，體重為235～260 g，由北京維通利華有限公司［動物合格證編號為SCXK（京）2002-0011］培育提供。

1.2 動物造模與分組

所有動物在適應性條件下飼養3 d后開始造模。采用3.5%水合氯醛溶液（給藥劑量為0.4 g/kg）給予大鼠腹腔麻醉，頸部去毛并消毒，并于正中作一切口，將頸總動脈、頸內動脈及頸外動脈分離并將頸外動脈遠心端進行結扎，使用動脈夾將頸總動脈夾閉［5］，頸外動脈插管并用注射器由外動脈向內動脈注射0.1mLKMG，使栓子可由內動脈進入顱內到達大腦的各個動脈，形成多發性腦梗死［6］。對于假手術組的大鼠，由外動脈向內動脈注射0.1mL的0.9%氯化鈉注射液，將動脈夾松開，并將頸外動脈的近心端結扎，最后將傷口縫合，回籠進行常規飼養。采用青霉素給予抗感染，次日觀察各組大鼠的行為表現，如大鼠前肢發生行為學的則判為建模成功［7］。大鼠造模成功后，按給藥類型不同隨機均分為假手術組（A組）、模型組（B組）、鹽酸美金剛組（C組）及大豆磷脂高劑量和低劑量組（D1組和D2組），各12只。于術后第10天開始分別采用灌胃給藥的方式給予其蒸餾水、鹽酸美金剛（給藥劑量為20mg/kg）、大豆磷脂（給藥劑量為D2組16.5mg/kg和D1組33.0mg/kg）。每日1次，連續給藥60 d。

1.3 指標檢測

Glu與GABA含量測定：采用高效液相色譜-電子化學檢測（HPLC-ECD）法測定大鼠大腦皮層及海馬Glu與GABA的含量［8］。對大鼠快速斷頭并取腦，將其前皮層及海馬進行分離，采用液氮進行固化處理，-70℃冰箱保存。然后于每0.1 g的腦組織中加入1mL的低溫工作液，冰浴條件下采用勻漿器勻漿，15 s后在4℃條件下14 000 r/min離心，20 min后取上清液，用0.22μm的濾膜對上清液過濾分裝，于-20℃冰箱保存。HPLC測定條件為MSC18色譜柱（50mm×3.0mm，2.5μm），流動相磷酸氫二鈉100mmol/L、20%甲醇、3.5%丙烯腈，pH為（6.70±0.03），流速為0.4mL/min，電勢為+150mV及+650mV，柱溫為30℃，進樣量為20μL。

NMDA受體各亞型表達量分析：采用免疫組化法分析［9］。于右側大腦的囟門和囟門后2mm處冠狀切開大腦，取出中間腦組織并固定、包埋、切片及脫蠟至水洗。抗原修復，采用3%的過氧化氫處理，15min后水洗，經PBS洗滌3次后加入一抗（稀釋比例為1∶100），4℃過夜孵育，將切片取出放于室溫30 min，經PBS洗滌3次后加入二抗，室溫孵育30min后經PBS洗滌3次，采用DAB顯色，于鏡下控制反應時間。經水洗、蘇木素復染、脫水及封片后鏡下觀察。采用IPP 6.0圖像分析系統對圖像進行分析，測定陽性細胞的平均灰度值。

腦組織常規病理學觀察：采用免疫組化法制備石蠟切片（厚度均為4μm），經HE染色后采用乙醇梯度脫水，二甲苯使之透明并用樹膠封片。于光鏡下對腦組織的神經元壞死、變性、炎性反應及小膠質細胞的增生情況進行觀察并記錄。

腦組織病理形態觀察：大鼠處死后，快速將其腦部取出，前皮層切成約1mm3的塊狀并浸入4%的戊二醛磷酸緩沖液（pH為7.2）內固定。進行PBS沖洗、乙醇梯度脫水、包埋及切片等過程［10］。將厚度為50 nm的切片經醋酸鈾及檸檬酸鉛雙重染色，采用電子透射顯微鏡觀察神經元、神經突觸及膠質細胞的結構變化。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 對Glu和GABA含量的影響

結果見表1。與A組大鼠相比，B組大鼠腦皮層的Glu和GABA含量、海馬的Glu含量均明顯下降（P＜0.05）；給藥60 d后，與B組大鼠相比，C組腦皮層及海馬中的Glu和腦皮層的GABA含量均明顯升高（P＜0.05），D1組及D2組腦皮層及海馬的Glu、D2組腦皮層中的GABA含量均明顯升高（P＜0.05）。

表1 大豆磷脂對大鼠腦組織中Glu和GABA的含量影響（±s，n=12）

表1 大豆磷脂對大鼠腦組織中Glu和GABA的含量影響（±s，n=12）

組別A組B組C組D1組D2組腦組織（μg/g）海馬（μg/g）Glu 124.90±56.60 74.10±14.00 154.60±108.30 145.20±49.70 148.30±52.10 GABA 19.90±10.00 12.40±5.20 23.80±17.40 11.20±7.00 17.50±4.80 Glu 110.40±52.80 60.40±23.90 137.50±46.70 104.90±35.30 145.90±56.00 GABA 25.20±17.20 17.90±7.10 19.20±10.70 18.00±12.40 21.20±13.20

2.2 對NMDA受體各亞型表達的影響

NMDA各受體亞型包括NR1，NR2A及NR2B在大鼠的前皮層神經細胞胞膜與胞漿發生著色。與A組大鼠相比，B組大鼠腦組織的NMDA各受體亞型高水平表達，其積分灰度值（IOD）差異有統計學意義（P＜0.05）；與B組大鼠相比，C組腦組織的NMDA各受體亞型的表達量均明顯下降（P＜0.05）；同時D1組的腦組織中各受體亞型的表達量明顯下降（P＜0.05），而D2組則僅有NR1和NR2B 2個受體亞型的表達量明顯下降（P＜0.05）。詳見圖1。

2.3 腦組織病理學變化

經腦組織病理學分析，A組術側神經元未見變性、壞死或軟化灶，也未發生小膠質細胞的增生；B組大鼠神經元發生變性、壞死或軟化灶，伴有小膠質細胞發生重度增生；D1組和C組的神經元有變性、壞死或炎性細胞反應，小膠質細胞發生輕度增生，但軟化灶不明顯；D2組大鼠神經元發生變性、壞死或軟化灶，間質炎細胞反應較輕度，小膠質細胞發生中度增生。

2.4 對神經元、膠質細胞和神經突觸形態學的影響

通過顯微鏡觀察，A組大鼠的神經元形態較完整，細胞器豐富，可觀察到大量的粗面內質網、核糖體及線粒體，且線粒體的嵴較完整；B組大鼠的神經細胞出現了嚴重的水腫現象，細胞器的數量也明顯下降，線粒體的嵴絕大部分出現了融合或模糊不清的現象，空泡化較明顯，粗面內質網發生了明顯的脫顆粒現象；D1組的神經元細胞的線粒體部分嵴發生少量融合或模糊不清，少數嵴發生斷裂或缺失，粗面內質網有輕度的脫顆粒現象，游離核糖體也有減少。

從形態學看來，A組大鼠的神經膠質細胞的細胞器和細胞核大小及形狀均正常，線粒體的嵴較完整；B組大鼠的神經膠質細胞線粒體的大部分嵴已模糊不清，部分發生缺失、空泡甚至斷裂，粗面內質網中也有顆粒融合或者脫顆粒的現象；D1組的神經膠質細胞，其胞內線粒體的部分嵴模糊不清，有的已缺失或斷裂，粗面內質網出現了輕度的脫顆粒。

A組大鼠的突觸表現正常；B組的突觸間隙表現為模糊不清，突觸小泡減小，突觸前呈明顯的水腫，線粒體表現異常；D1組的突觸前線粒體呈明顯的空化，部分膜發生融合，模糊不清，且突觸小泡減少，但間隙較清楚。

3 討論

發生腦梗死時，腦中的磷脂酶會被激活，可將磷脂分解為游離的脂肪酸，使細胞膜受損，細胞內、外的物質交換及能量代謝將受到影響。維持細胞膜的完整性及其正常的生理功能需使腦內的磷脂含量維持在一個合適的水平［11］。抑制腦梗死患者腦內磷脂含量降低的措施較多，傳統方法常采用磷脂酶A2的抑制劑，如磷脂酶C抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF），但其特異性較差，不良反應較大。胞二磷膽堿在體內可生成膽堿而促進腦中磷脂酰膽堿的合成，從而減少腦中的磷脂含量。在治療腦梗死時，大豆磷脂對患者的神經功能缺損具有顯著的改善作用，臨床療效較明顯［12］。

Glu作為動物中樞神經系統的主要神經遞質，可有效激活脊髓神經元和海馬神經元的電生理活動，通過激活相應受體而對神經元的分化、神經系統的發育及神經元與膠質細胞的偶聯均有重要的作用［13-14］。本研究中，通過觀察神經系統的超微結構和腦部組織中Glu與GABA的含量變化，可看出在多發性腦梗死恢復期的過程中，腦缺血缺氧引發的神經元中線粒體的呼吸功能減退而使中樞神經系統發功能性障礙，進而引起腦部功能性障礙。

NMDA受體作為興奮性氨基酸受體，在靜息狀態下，Mg2+結合于通道上以阻止Ca2+內流［15］。當腦組織發生缺血缺氧時，會引發細胞膜的去極化，Mg2+對NMDA受體的阻滯作用被削弱，NMDA受體被活化，Ca2+大量內流而使神經元受損，加大了Glu的興奮性毒性，可通過阻斷NMDA受體來干預谷氨酸的興奮性毒性作用，避免對神經元的損傷［16］。本研究結果表明，模型組的腦部神經元的NMDA各受體亞型NR1，NR2A及NR2B的表達均較高。可見在多發性腦梗死恢復期時NMDA受體的高表達可破壞神經元。因此，通過控制神經遞質Glu和GABA的表達水平及NMDA的受體表達，可減緩腦梗死恢復期的神經元受損，促進腦功能的恢復。

本研究中采用大豆磷脂治療多發性腦梗死恢復期的大鼠，結果表明，其可使腦組織中Glu與GABA的含量升高，還可下調NMDA受體的表達，證實大豆磷脂可促進中樞神經功能的恢復，還可減緩神經元受損。其作用機制可能為：大豆磷脂主要成分是磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇和磷脂酰乙醇胺，這些組分可被磷脂酶分解；發生腦梗死時，梗死的部位能量被大量耗竭，由膽堿合成磷脂酰膽堿的代謝受阻，且隨缺血程度的加重，代謝更加困難，而大豆磷脂中各磷脂成分屬于完整的磷脂，無需耗能即可合成，其進入機體即被磷脂酶分解，然后可添補細胞膜缺損，使缺血部位的磷脂含量不至減少過多，保持了細胞膜的完整性，大大減緩了磷脂酶對神經元的損傷。

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Effect of Soybean Lecithin on Content of G lu，GABA and Expression of NMDA Receptor Subtypes in Recovery Period of Multiple Cerebral Infarction Rats

Wang Congping，Jia Min，Li Wenjing，Zhu Zuxin，Liu Qunhui
（Department of Neurology，The Central Hospital of Enshi Autonomous Prefecture，Enshi，Hubei，China 445000）

Objective To analyze the effects of soybean lecithin on levels of Glu，GABA and the expression of NMDA receptor subtypes in recovery period of multiple cerebral infarction rats.Methods To establish multi-infarct model rats by injecting embolizing micro-sphere via internal carotid artery，10 d after cerebral infarction，different content of soybean lecithin were given for the treatment for 60 d. The pathological changes of brain ultrastructure were observed and recorded by electron transmission microscope.The expression levels of Glu and GABA of brain tissue were measured and analyzed with HPLC.And the expression of NMDA receptors of each subtypes including NR1，NR2A and NR2B in neurons was measured by immune histochemical staining.Results Compared with the rats of sham there were some abnormal changes in the ultra structures of neurons and neuroglia cells and synapses of the model rat，the levels of Glu and GABA decreased significantly，but the expression of NR1，NR2A and NR2B increased significantly.Conclusion Soybean lecithin can improve the ultra structure of cerebral tissue，facilitate synthesis the levels of Glu and GABA，and induce the expression of subtypes of NR1，NR2A and NR2B in neurons，and it has neuroprotective effect.

Soybean lecithin；multiple cerebral infarction；recovery period；NMDA receptor

R285.5；R282.71

A

1006-4931（2015）22-0085-04

王從平（1974-），男，土家族人，大學本科，副主任醫師，研究方向為腦血管疾病的診治，（電子信箱）wcp0413@ 163.com。

2015-06-17）