高效液相色譜-二極管陣列檢測器法測定保健食品和中成藥中違法添加的10種降糖類西藥

隋海山，王立娟，謝菲

（1.山東省濰坊市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東濰坊261041；2.山東省濰坊市紅十字中心血站，山東濰坊261041）

高效液相色譜-二極管陣列檢測器法測定保健食品和中成藥中違法添加的10種降糖類西藥

隋海山1，王立娟2，謝菲1

（1.山東省濰坊市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東濰坊261041；2.山東省濰坊市紅十字中心血站，山東濰坊261041）

目的建立高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）法，測定保健食品和中成藥中添加的10種降糖類西藥。方法色譜柱采用Agilent ZORBAX SB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為0.01mol/L的乙酸銨水溶液（A）-甲醇（B）梯度洗脫，進(jìn)樣量為10μL，DAD掃描范圍為190～400 nm，檢測波長為235 nm，流速為1.0 mL/min。通過比較樣品峰與對(duì)照品峰的保留時(shí)間，DAD光譜、一級(jí)質(zhì)譜、二級(jí)質(zhì)譜圖確定樣品中是否添加了降糖類藥物，并根據(jù)回歸方程計(jì)算添加藥物的準(zhǔn)確含量。結(jié)果10種藥物的分離度良好，回收率為95.50%～101.95%。結(jié)論該方法簡便準(zhǔn)確，靈敏度高，可作為保健品及中成藥非法添加降糖類藥物的測定方法。

保健品；非法添加；降糖藥；高效液相色譜-二極管陣列檢測器

2013年資質(zhì)認(rèn)定擴(kuò)項(xiàng)工作中，用高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）法和高效液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜（HPLCMS/MS）法都檢出2批樣品（保健食品和醫(yī)院自制制劑）含鹽酸苯乙雙胍、格列本脲、馬來酸羅格列酮，檢出違法添加西藥種類與文獻(xiàn)［1］報(bào)道一致。筆者總結(jié)了10種降糖類藥物的DAD圖譜，以供保健食品和中成藥中違法添加降糖藥物監(jiān)測工作參考。

1 儀器與試藥

Agilent1260型液相色譜儀，Infinity 1260型DAD檢測器；ST-16R型Thermo冷凍離心機(jī)；Synthesis A10型超純水系統(tǒng)；XS-205DU型電子天平（德國梅特勒公司）；KQ-200KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司）。鹽酸苯乙雙胍（批號(hào)為201203，純度為99.7%）、格列本脲（批號(hào)為200404，純度為100%）、鹽酸二甲雙胍（批號(hào)為201203，純度為100%）、格列喹酮（批號(hào)為201002，純度為99.37%）、格列吡嗪（批號(hào)為201203，純度為99.5%）、鹽酸吡格列酮（批號(hào)為201202，純度為100%）、格列齊特（批號(hào)為201004，純度為99.9%）、格列美脲（批號(hào)為201102，純度為99.1%）、瑞格列奈（批號(hào)為201102，純度為99.7%）、馬來酸羅格列酮對(duì)照品（批號(hào)為200701，純度為99.5%），均來自中國食品藥品檢定研究院；保健食品（糖安帕拉硒化VE膠囊，通化力神保健品公司，批號(hào)為20110106，規(guī)格為每粒300mg）；醫(yī)院自制制劑（降糖膠囊，山東省臨朐縣糖尿病研究所，批號(hào)為20100912，規(guī)格為每粒0.5 g）；甲醇（默克公司）、乙酸鈉均為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件［2-4］

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：含0.01mol/L的乙酸銨水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～30 min，40%B；30～40 min，40%→60%B；40～60 min，60%B；60～70 min，60%→70%B；70～80 min，70%B；80～90min，70%→40%B；90～95min，40%B）；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL；DAD掃描范圍：190～400 nm；檢測波長：235 nm。DAD圖譜見圖1。

2.1.2 溶液制備

準(zhǔn)確稱取含鹽酸苯乙雙胍、格列本脲、鹽酸二甲雙胍、格列喹酮、格列吡嗪、鹽酸吡格列酮、格列齊特、格列美脲、瑞格列奈、馬來酸羅格列酮各10.0mg，分別用甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為1 g/L的貯備液，于4℃下保存，使用前用甲醇稀釋，得對(duì)照品貯備液。分別準(zhǔn)確吸取1.0mL各對(duì)照品貯備液置100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。取保健食品和醫(yī)院自制制劑各20粒，傾出內(nèi)容物，研碎，混勻，精密稱取1次口服劑量的內(nèi)容物，加甲醇25 mL超聲處理20 min，靜置，放冷，以8 000 r/min的速率離心15 min，取上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，得供試品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系及檢出限、定量限考察：取各對(duì)照品貯備液，準(zhǔn)確配制系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)進(jìn)樣，測定3次，以各物質(zhì)峰面積平均值（Y）對(duì)被測組分的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，見表1。以信噪比（S/N）3和10為標(biāo)準(zhǔn)，測得10個(gè)待測組分的檢出限及定量限。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批次樣品6份，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下測定峰面積。結(jié)果的RSD為0.8%～2.9%（n=6），表明該方法重復(fù)性好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批次樣品，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下分別于0，2，4，6，8，10 h時(shí)測定峰面積。結(jié)果的RSD為0.9%～3.1%（n=6），表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

表1 10種降糖類西藥的線性關(guān)系檢出限及定量限（n=3）

表2 樣品含量測定結(jié)果（μg）

表3 質(zhì)譜分析條件參數(shù)

2.1.4 樣品含量測定

取不同批號(hào)的樣品，精密稱定，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下測定，計(jì)算樣品含量。結(jié)果見表2。

2.2 質(zhì)譜鑒定

2.2.1 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離源；正離子模式檢測；CAD（噴撞氣）：4 psi；CUR（氣簾氣）25 psi；GS1（噴霧氣）65 psi；GS2（輔助加熱氣）65 psi；IS（離子化電壓）5 500 V；溫度（TEM）：600℃；采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。參數(shù)見表3。經(jīng)對(duì)比，樣品中3種成分的質(zhì)譜圖與對(duì)照品質(zhì)譜圖一致。

表4 10種化合物加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2.2 加樣回收試驗(yàn)

各取3份（按中、高、低量級(jí)加入）不含降糖類藥物的1次劑量空白基質(zhì)，各加入2.1.2項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每份作2次平行試驗(yàn)。結(jié)果見表4。

3 討論

參照國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件2009029的方法進(jìn)行了HPLC法的檢驗(yàn)，原標(biāo)準(zhǔn)將鹽酸二甲雙胍和鹽酸苯乙雙胍和其余8種物質(zhì)分開，用不同的HPLC法檢驗(yàn)，本試驗(yàn)中同時(shí)檢測10種成分，提高了效率［5-8］。

梯度洗脫程序較原標(biāo)準(zhǔn)延長30 min，75 min時(shí)洗脫出較多雜質(zhì)，10種成分均較好分離。故選擇洗脫時(shí)間為75 min。

本試驗(yàn)中，DAD檢測器檢測樣品檢出了鹽酸苯乙雙胍、格列本脲、羅格列酮3種違禁成分，與對(duì)照品的紫外光譜和二級(jí)質(zhì)譜基本一致，保留時(shí)間也一致。

本試驗(yàn)中建立了降糖類藥物的DAD標(biāo)準(zhǔn)圖庫，樣品中未知峰的DAD圖譜通過自動(dòng)匹配功能就能提高非法添加物的靶向性。

［1］肖樹雄，李楊杰.由降糖中成藥和保健食品檢驗(yàn)情況探索非法添加化學(xué)成分的系統(tǒng)快篩思路［J］.藥物分析雜志，2011，31（2）：418-422.

［2］劉起中，李慧義，杭太俊.中藥降糖制劑中非法摻入的化學(xué)降糖藥物成分的檢測［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2008，25（1）：61-63.

［3］羅干明.降糖類中藥及保健食品中摻入的鹽酸苯乙雙胍檢測［J］.中國藥業(yè)，2009，18（4）：31.

［4］張妤琳，曹玲.降糖保健食品中非法添加鹽酸苯乙雙胍和格列本脲的檢測［J］.藥學(xué)與臨床研究，2007，15（5）：423-426.

［5］張吉吉，高青，余倩.中藥制劑及保健品中違禁添加9種化學(xué)降糖藥的HPLC-MS/MS定性檢測［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2007，38（1）：39-43.

［6］劉惠軍，付萍萍，劉敏芳，等.降糖類中藥制劑中添加化學(xué)藥品的檢測方法研究［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2008，25（6）：525-527.

［7］潘煒，鄭順利，毛希琴，等.LC-MS/MS測定中成藥制劑中12種口服降糖藥［J］.藥物分析雜志，2009，29（4）：569-574.

［8］董銀芬.液相色譜-質(zhì)譜檢測中藥及相關(guān)制品中非法添加化學(xué)藥物的應(yīng)用進(jìn)展［J］.中國藥物與臨床，2012，12（3）：358-359.

Detection of 10 Kinds of Antidiabetics Illegally Added in Traditional Chinese Medicines and Health Care Products by HPLC-DAD

Sui Haishan1，Wang Lijuan2，Xie Fei1
（1.Weifang Center for Food and Drug Conrtol，Weifang，Shandong，China，261041；2.Weifang Red Cross Blood Center，Weifang，Shandong，China，261041）

Objective To establish an HPLC-DAD method for the determination of 10 antidiabetic agents illegally added in traditional Chinese medicines and health care products.Methods The analytes were separated on an Agilent ZORBAX SB-C18column（250 mm×4.6 mm，5μm）with 0.01 mol/L ammonium acetate solution and methanol as mobile phase by gradient elution.DAD scanning range was 190-400 nm，detection wavelength of 235 nm，flow rate of 1.0 mL/min.The retention time，DAD spectrum，primary mass spectrometry and peak area obtained were used to identify and determine the contents of antidiabetic in traditional Chinese medicines and health care products.Results A good resolution was obtained for the 10 kinds of chemical drugs under the HPLC conditions.The standard addition recoveries were in the range of 95.50%-101.95%.Conclusion The method is simple，rapid，accurate and highly sensitive，which can be used for the determination of illegal contents in the traditional Chinese medicines and health care products.

healthy care products；added illegally；antidiabetics；HPLC-DAD

R927.2；R977.1+5；R954

A

1006-4931（2015）22-0110-03

2014-10-17；

2015-07-13）