腫瘤壞死因子-β基因G252A多態性與川崎病的關聯性研究*

曾才秀，詹霞，袁海斌，李青，謝圭，謝綱，楊作成

腫瘤壞死因子-β基因G252A多態性與川崎病的關聯性研究*

曾才秀1，詹霞2，袁海斌1，李青1，謝圭2，謝綱1，楊作成2

（1.湖南省湘潭市婦幼保健院兒科，湖南湘潭411100；2.中南大學湘雅三醫院兒科，湖南長沙410013）

目的探討腫瘤壞死因子-β（TNF-β）基因G252A多態性與川崎病發病及川崎病冠狀動脈損傷的關聯性。方法應用基因測序方法，對100例川崎病患兒與92例健康兒童TNF-β基因G252A位點多態性進行檢測。結果川崎病組TNF-β基因G252A位點AG、AA、GG基因型分布與健康對照組比較差異無統計學意義（χ2=4.86，P＞0.05），川崎病組A、G等位基因頻率與健康對照組比較差異有統計學意義（χ2=4.53，P＜0.05），川崎病合并冠狀動脈損傷組（CAL）與無冠狀動脈損傷組（NCAL）基因型和等位基因頻率比較差異無統計學意義（χ2=3.37和0.59，P＞0.05）。結論尚未發現TNF-β基因G252A位點基因型分布與川崎病的發病及冠狀動脈損傷存在關聯性，但川崎病患者G等位基因頻率較健康對照組高。

腫瘤壞死因子-β；川崎病；基因多態性

川崎病是以全身性血管炎癥為主要病理改變的一種發熱出疹性疾病，冠狀動脈病變是其嚴重并發癥。盡管大劑量丙種球蛋白的運用使得川崎病冠狀動脈并發癥的發病率明顯降低，但仍有2%～3%患兒最終可能發生冠狀動脈狹窄、閉塞，預后不良。該病的病因及致病機制至今未完全闡明，遺傳因素可能在其發病中起一定作用。腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）是體內具有多種生物活性的重要致炎細胞因子，目前已知的TNF分為TNF-α和TNF-β兩種，分別由TNF-α基因和TNF-β基因編碼。研究發現，TNF與川崎病的發病存在相關［1］，但其多態性與川崎病的關系仍在研究中。本文應用基因測序方法檢測TNF-β基因G252A位點多態性，觀察川崎病患兒TNF-β基因G252A多態性與川崎病發病及川崎病冠狀動脈損傷的相關性，以探討其與川崎病發病的關聯性。

1 資料與方法

1.1研究對象

1.1.1川崎病組選取2010年-2015年在湖南省湘潭市婦幼保健院及湘雅三醫院兒科就診的100例川崎病患兒，均符合《諸福棠實用兒科學》川崎病診斷標準［2］。所有患兒均為漢族，年齡4個月～7歲，其中男64例，女36例，平均年齡（2.49±1.49）歲。所有患兒均調查其年齡、性別，同時檢測血常規、血清免疫球蛋白、補體C3、肝功能、C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、血紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR），并進行動態心臟彩超多普勒檢查（見表1）。其中川崎病合并冠狀動脈損傷（coronary artery lesion，CAL）的診斷指標參考日本川崎病研究委員會標準：＜2歲，冠狀動脈主干內徑≥2.5 mm；＜5歲，冠狀動脈主干內徑≥3.0 mm；≥5歲，冠狀動脈主干內徑≥4.0 mm；某段管徑為鄰近段的1.5倍及以上；冠狀動脈內徑與主動脈根部內徑之比＞0.3；管壁明顯不規則。

表1100　例川崎病患兒臨床資料（入院5 d內所收集的資料）

1.1.2健康對照組2010年-2015年在本院體檢的92例中國漢族兒童，排除感染性疾病、心血管疾病、風濕性疾病以及既往川崎病病史等，年齡9個月～9歲，其中男57例，女35例，平均年齡（2.62± 2.02）歲。

1.2研究方法

1.2.1.基因組DNA的提取應用Pure Gene DNA提取試劑盒，提取各組外周血基因DNA，置于-20℃冰箱冷凍儲藏備用［3］。

1.2.2.TNF-β基因G252A位點多態性的基因檢測應用PCR-RFLP檢測TNF-β基因G252A位點多態性，引物設計：正向為5'-CCTCAGCCTTTCCT GCCTTTG-3'，反向為5'-CGTGGTGGGATGTGGAGG AGGA-3'（上海生物工程技術服務有限公司合成）。PCR反應體系為25μl體系，包括模板DNA 2μl（約200 ng），正反向引物各0.5μl（1μmol/l），2×Master Mix 12.5μl，去離子水加至25μl。反應在PCR擴增儀（美國基因公司，PCR system 9700）上進行。PCR反應條件：預變性95℃（5 min）后，95℃（30 s）→61℃（60 s）→72℃（60 s）（35個循環），終末延伸72℃（10 min）。PCR擴增產物送鉑尚生物技術（上海）有限公司以雙脫氧鏈終止法（Sanger法）進行基因測序。

1.3統計學方法

采用直接計數法計算出川崎病組和健康對照組TNF-β基因G252A位點各種基因型頻率和等位基因頻率，經Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，表明各基因型頻率已達遺傳平衡，具有群體代表性。各組間構成比用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1TNF-β基因PCR產物圖

TNF-β基因G252A位點PCR擴增片段為669 bp，見圖1。

2.2TNF-β基因G252A位點測序圖

將TNF-β基因G252A位點PCR擴增產物經Sanger法進行基因測序，其不同基因型的測序圖見圖2。

2.3TNF-β基因G252A位點的基因型分布及等位基因頻率

由表2可見，川崎病組TNF-β基因G252A位點AG、AA、GG基因型分布與健康對照組比較，差異無統計學意義（χ2=4.86，P＞0.05），川崎病組TNF-β基因G252A位點A、G等位基因頻率與健康對照組比較差異有統計學意義（χ2=4.53，P＜0.05），川崎病組的合并冠狀動脈損傷（CAL）組與無冠狀動脈損傷（NCAL）組基因型和等位基因頻率比較差異無統計學意義（χ2=3.37和0.59，P＞0.05）。

圖1　TNF-β基因PCR產物圖

圖2　TNF-β基因G252A位點測序圖

表2　TNF-β基因G252A位點川崎病組和正常對照組基因型分布及等位基因頻率比較例（%）

3 討論

TNF-β是腫瘤壞死因子超家族中的重要成員之一，具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗病毒、參與炎癥反應和免疫調節等。TNF-β可上調血管內皮細胞表面黏附分子的表達，參與激活巨噬細胞、促進炎癥反應；參與脂質代謝的調節，從而在動脈粥樣硬化的形成和發展過程中起著重要作用［4］。TNF-β由活化的T細胞產生，故又名淋巴毒素。TNF-β位于主要組織相容性復合體（MHC）Ⅲ類基因區HLA-DR以及HLA-B位點之間的HLA-Ⅲ抗原基因簇，即6p21區域，與MHC基因緊密連鎖。TNF-β全長約為3 kb，包括4個外顯子和3個內含子，并含34個氨基酸殘基組成的信號肽，由205個氨基酸殘基組成。其252位點位于第1內含子內，在轉錄起始位點下游存在鳥嘌呤（G）→腺嘌呤（A）的單核苷酸多態性變化（+252G/A）［4-5］，該多態性的改變使其與受體結合能力提高，從而提高了TNF-β的轉錄活性。

川崎病在亞急性期和恢復期，可因冠狀動脈擴張、狹窄、閉塞和動脈瘤而發生心肌缺血、甚至心肌梗死，已經成為兒童獲得性心臟病的常見原因之一。川崎病的發病及其并發的冠狀動脈損傷等均與遺傳易感性存在關聯，既往研究也發現多個基因的多態性變化與其發病相關［3，6］。AHN等［7］發現川崎病患兒血漿TNF-α明顯增高，說明川崎病存在免疫調節改變。但對TNF-α啟動子區域-238及-308位點的多態性進行檢查，結果未發現該位點多態性與川崎病的發生及冠狀動脈損傷存在關聯。文獻報道TNF-β基因252位點多態性與淋巴瘤［8］、偏頭痛的畏光［9］、慢性乙型肝炎和丙型肝炎等［10］有關。在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的研究中發現，TNF-β基因252位點與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者血清三酰甘油、低密度脂蛋白水平存在相關性［4］。CRUZOLIVO等［11］首次對墨西哥48例川崎病患兒淋巴毒素基因+252位點基因多態性進行檢測發現，其基因型和等位基因頻率和川崎病及川崎病冠狀動脈損傷間均未見明顯關聯性。本研究顯示，川崎病組TNF-β基因G252A位點AG、AA、GG基因型分布與健康對照組比較差異無統計學意義；而川崎病組TNF-β基因G252A位點G等位基因頻率明顯高于健康對照組，而A等位基因頻率明顯低于健康對照組（χ2=4.53，P＜0.05），說明其A、G等位基因頻率與川崎病的發生存在一定的關聯性。TNF-β基因G252A位點的多態性可能在川崎病的發病機制中起到一定作用，或可能是川崎病因中的一個風險因子，但川崎病合并CAL組與NCAL組基因型和等位基因頻率與健康對照組比較差異無統計學意義，說明兩者間無明顯關聯性，或與樣本量仍然偏小有一定關系。由于TNF-β基因多態性與川崎病發病的關聯性研究尚少，因此，有關TNF-β基因G252A位點多態性與川崎病及其冠狀動脈損傷的關系及其與川崎病發病及預后的確切關聯性有待進一步深入研究。基因多態性直接關系到人類對疾病的易感性、對環境因子及治療反應的差異性以及疾病臨床表型的多樣性，而TNF-β基因G252A位點多態性與川崎病關系的進一步研究可能把炎癥和遺傳兩種機制在一定程度上聯系起來，以更好地為臨床工作提供參考。

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（張蕾編輯）

Association of locus G252A polymorphisms of tumor necrosis factor-β gene with Kawasaki disease*

Cai-Xiu ZENG1，Xia ZHAN2，Hai-Bin YUAN1，Qing LI1，Gui XIE2，Gang XIE1，Zuo-Cheng YANG2
（1.Department of Pediatrics，Maternal and Child Health Hospital of Xiangtan City，Xiangtan，Hunan 411100，P.R.China；2.Department of Pediatrics，the Third Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan 410013，P.R.China）

【Objective】To investigate the association of the locus G252A polymorphisms of tumor necrosis factor-β（TNF-β）gene with Kawasaki disease（KD）.【Methods】The Sanger gene sequencing method was employed to detect the locus G252A polymorphisms ofTNF-βgene in 100 patients with KD and 92 healthy controls.【Results】For locus G252A polymorphism inTNF-βgene，there was no significant difference between the KD patients and healthy controls in genotyping frequencies of AG，AA or GG（χ2=4.86，P＞0.05）. However，there was a significant difference in the allele frequencies of A and G between the KD patients and healthy controls（χ2=4.53，P＜0.05）.And there were no significant differences in genotype frequencies or in allele frequencies（χ2=3.37 and 0.59，P＞0.05）between the KD patients complicated with coronary artery injury group（CAL）and that without coronary artery lesion group（NCAL）.【Conclusions】There is no correlation between genotype of the locus G252A ofTNF-βgene and either the risk of KD or coronary artery injury of KD patients.But the G allele frequency in KD patients is higher than that in healthy controls.

tumor necrosis factor-β；Kawasaki disease；polymorphism

R725.4

A

1005-8982（2015）36-0035-04

2015-09-09

湘潭市科技局科研基金資助項目（No：SF20142002）