藏茴香水溶性抑菌活性成分的分離與純化研究

王樹林，王蕊，王秀玉

（青海大學農牧學院，青海西寧810016）

藏茴香水溶性抑菌活性成分的分離與純化研究

王樹林，王蕊，王秀玉

（青海大學農牧學院，青海西寧810016）

以單因素和正交試驗優化了AB-8大孔樹脂純化藏茴香種子水溶性抗菌活性成分的工藝，并進行抑菌活性驗證；結果表明吸附時間為8 h，加入樣液3 BV的水稀釋樣液，用50%乙醇做洗脫劑洗脫得到的抗菌成分抑菌效果最好，采用優化工藝能夠快速高效分離純化藏茴香水溶性抑菌成分，且純化成分具有較好地抑菌效果。

藏茴香；水溶性；抗菌成分；純化

藏茴香（Caraway）是傘形科葛縷子屬植物，該植物為多年生草本植物，在亞洲、歐洲、北美洲和北非洲等地均有分布。在我國主要分布在東北、華北、西北、四川、青海、西藏等地。其生長條件對土壤，環境要求不嚴格。生長于海拔400 m～800 m的路旁，草原，山溝，河灘及山坡等處［1-3］。它不僅是重要的中藏藥材，也是重要的香料及蔬菜資源［4］。在歐洲自古以來將其作為芳香性驅風藥和香料使用，藏茴香也具有祛脹氣，助消化的作用。其藥用價值在我國傳統中藥和藏藥典籍中均有記載，藏茴香的根，種子入藥具有祛風除濕，治感冒，關節疼，平喘，明目，利膽，抑菌，殺真菌等功效［2］。近年來，藏茴香人工種植技術不斷成熟，藏茴香資源日益增加。青海藏茴香資源具有產量高，分布廣及無污染等特點，同時有易采集，成本低，便于開發利用等優點。因此研究藏茴香在食品，藥品領域的應用將極大地提高該植物資源種植的經濟效益，為廣大農牧民開展特色種植，提高經濟收入開拓新渠道。

藏茴香的精油是強力殺菌劑，能治痙攣，殺真菌［4］。將藏茴香種子用水蒸氣蒸餾法提取精油，其蒸煮液中存在的活性成分，也具有抑菌殺菌活性。將藏茴香水煮液經分離并純化，預期可分離得到具有抑菌特性的活性成分。茴香水溶性成分主要有單萜，單萜葡糖苷，羥基葡糖苷，芳香化合物，糖族化合物等［5］。藏茴香水提液中具有抑菌特性的成分有羥基麝香草酚及糖苷［6］。大孔吸附樹脂技術是以大孔吸附樹脂為吸附劑，利用其對不同成分的選擇吸附和篩選作用，通過適宜的吸附和解析條件借以分離純化某一種或某一類有機化合物的技術。該技術具有吸附快，解析率高，吸附容量大，洗脫率高，樹脂可再生等優點，因此被廣泛的運用于天然產物的分離純化［7］。

伴隨著人們綠色，健康意識的不斷增強，安全、綠色、天然、植物源的消殺產品市場需求不斷增長［8-9］。本研究以微生物平板培養-打孔法［10-11］驗證藏茴香水溶性活性成分的抗菌活性，以單因素和正交試驗優化水溶性活性成分分離純化工藝，以期為藏茴香開發、加工消殺產品與應用提供必要的試驗參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料

1.1.1.1藏茴香種子

購自青海省樂都縣。

1.1.1.2試劑

蒸餾水、無水乙醇（分析純）：天津市河東區紅巖試劑廠；AB-8大孔吸附樹脂：天津波鴻樹脂科技有限公司。

1.1.2供試菌種及培養基

大腸桿菌菌種：青海大學農牧學院微生物實驗室提供。

營養瓊脂（BR）：北京奧博星生物技術有限責任公司；氯化鈉（AR）：天津市致遠化學試劑有限公司；培養皿、打孔器、接種環。

1.2儀器與設備

FZ102微型植物粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；RE-2000B旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-Ⅲ型循環水真空泵：上海亞榮生化儀器廠；TGL20MN臺式大容量高速冷凍離心機：湖南郝西儀器裝備有限公司；DK-98-11電子萬用爐：天津市泰斯特儀器有限公司；JM-B2003電子天平：諸暨市超澤衡儀器設備有限公司；LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；DHG-9070A電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；WDP-450電熱恒溫培養箱：上海安亭科學儀器有限公司；THZ-82恒溫振蕩器：國華企業；Z型層析柱：上海精科實業有限公司；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；鍍鉻游標卡尺：佳木斯計量儀器實驗廠。

1.3試驗方法

1.3.1藏茴香水溶性活性成分樣液的制備

稱取已粉碎的藏茴香種子50 g，加10 BV水，浸泡1 h，蒸餾3 h，除去精油。收集剩下的蒸煮液，得到藏茴香水溶性成份粗取液。將粗提液離心（5 000 r/min，15 min）除去肉眼可見的雜質后，旋轉蒸發濃縮（溫度為40℃，壓力為0.065 MPa）約10倍，制得藏茴香水溶性活性成分提取液，冷藏備用。

1.3.2藏茴香種子中水溶性活性成分分離純化工藝流程

將1.3.1項制得的提取液與已處理好的AB-8大孔吸附樹脂以一定體積比混勻，裝入100 mL三角瓶中，放入恒溫水浴振蕩器中震蕩吸附，使其達到飽和吸附。用濾紙過濾吸附好的樹脂，并將樹脂濕法上層析柱。藏茴香種子水提液中主要的抗菌成分有麝香草酚及糖苷，酚類物質顯弱酸性，當上樣液pH偏大時，活性成分不易吸附。樣液制備好后，測得樣液pH為 4.87，顯弱酸性，因此此處可忽略pH對分離純化效果的影響。合適的徑高比可為解析提供較好的效果，若徑高比太小，會因為洗脫劑與吸附飽和的樹脂接觸面積不足或洗脫劑量不足而影響解析率，因此此處確定徑高比為1.5∶20。洗脫流速太快時，活性成分不易解析，因此解析流速應控制在3 mL/min～4 mL/min。

上柱完成后，先以100 mL蒸餾水洗脫雜質（以3 mL/min～4 mL/min流速洗脫），然后以乙醇100 mL為洗脫劑進行解析（以3 mL/min～4 mL/min流速），并收集洗脫液。將收集液放入烘箱低溫（40℃～50℃）干燥，所得干物質加入1.0 mL蒸餾水溶解，即得純化的活性部分。其工藝流如圖1所示。

圖1　藏茴香水溶性活性成分分離純化工藝流程Fig.1Flow of separation and purification about water soluble active ingredient from caraway

1.3.3培養基的制備及抑菌試驗方法

采用打孔法［10］測定抑菌圈直徑來衡量抑菌活性。將培養皿及營養瓊脂在121℃高壓蒸汽滅菌15 min，將融化的營養瓊脂培養基倒入滅菌的培養皿中（培養基量為15 mL/1個培養皿）。自然冷卻，凝固后備用。預先把大腸桿菌供試菌菌種用營養瓊脂固體培養基進行菌種活化，然后挑取菌苔用滅菌生理鹽水配制成含菌數約106個/mL～107個/mL的菌懸液，備用。待瓊脂冷卻凝固后，在超凈臺上，用無菌棉球蘸取菌懸液以劃線法均勻涂在培養基上。靜置10 min，用滅菌的孔徑為7 mm的打孔器打孔，用滅菌鑷子取出瓊脂快留下圓形小孔。將藏茴香水溶性活性成分樣液吸取一定體積，滴于圓形孔中，其中一個孔，不加樣液，做空白對照。將培養皿放入恒溫培養箱在37℃下培養12 h后，翻面繼續培養12 h。取出后，測量抑菌圈直徑的大小［10-11］。

1.3.4干物質測定方法及抑菌物質得率的測定

1.3.4.1干物質測定方法

將稱量瓶洗凈，置于50℃烘箱中烘2 h左右，烘干水分，取出冷卻后用分析天平稱重。復烘至恒重（2次稱重相差不超過0.002 g即為恒重）。此重量即為稱量瓶重量（W1），記錄該稱量瓶的號碼和重量。加入一定體積1.3.2項收集的樣品液至已恒重的稱量瓶中，將樣液搖勻，放入烘箱中烘干。將稱量瓶及樣液從烘箱中取出后，用分析天平稱重。復放入烘箱中烘3 h～4 h，取出稱重。重復操作至兩次稱重相差不超過0.002 g后，記錄烘干恒重后總重量（W2）。

式中：W為樣品干物質量，g；W2為稱量瓶和試樣至恒重總重量，g；W1為稱量瓶重量，g。

1.3.4.2抑菌物質得率的計算方法

精密量取1.3.1項下制得的樣液（干物質總含量1.66 g/mL）10 mL，樣液中總干物質含量為M1。經1.3.2工藝樹脂吸附，解析處理后得到乙醇收集液。將乙醇洗脫液放入烘箱烘干，得到分離純化后抑菌成分干物質M2。抑菌物質得率的計算公式如下：

式中：η為抑菌物質得率；M1為樣液中總干物質質量，g；M2為抑菌成分干物質質量，g。

1.3.5AB-8型大孔吸附樹脂預處理

大孔吸附樹脂用于分離純化中藥有效成分具有十分廣闊的前景，與其它純化方法相比顯示出其優越性。同時，樹脂可以連續使用3次以上而對試驗結果影響不大［12-13］，連續使用后可再加入乙醇、酸、堿類介質進行再生處理后繼續使用。初次使用，其預處理方法如下：

將AB-8大孔吸附樹脂先用蒸餾水浸泡2 h，濾去蒸餾水。以一定量的濃度為95%的乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹。用蒸餾水沖洗至浸液中加適量蒸餾水無白色渾濁現象，再用蒸餾水反復沖洗干凈至無醇味，濾紙吸干表面水分備用。

1.3.6單因素試驗設計

考察不同吸附時間、樣品上柱液濃度、洗脫劑濃度3個因素對大孔吸附樹脂分離純化效果的影響。

1.3.6.1吸附時間對AB-8型大孔吸附樹脂吸附效果的影響

精密量取預處理好的AB-8型大孔吸附樹脂20mL共四份，分別置于100 mL三角瓶中。精密加入1.3.1項下制得的樣液各10 mL，樣液濃度為1.66 g/mL。放入恒溫振蕩器振蕩吸附不同時間（2 h～12 h恒溫振蕩器溫度為30℃）。將吸附好的樹脂濕法上柱，上柱徑高比（層析柱內徑與樹脂裝入高度比）為1.5∶20。按1.3.2項的方法處理吸附好的樹脂，即先加入100 mL蒸餾水洗去雜質，然后用濃度70%的乙醇100 mL為洗脫劑（洗脫雜質用蒸餾水及洗脫劑流速均控制在3 mL/min～4 mL/min）進行解析。收集洗脫液，將收集液放入烘箱（控制在40℃～50℃之間）將乙醇完全揮發干凈。繼續烘干，得到抑菌活性物質，所得干物質用1.00 mL蒸餾水溶解，平板培養基打孔法驗證不同吸附時間對吸附抑菌試驗驗證抑菌效果。

1.3.6.2樣品上柱液濃度AB-8型樹脂對回收率的影響

精密量取預處理好的AB-8型大孔吸附樹脂20 mL共四份，分別置于100 mL三角瓶中。精密吸取1.3.1項下制取的樣液各10 mL，分別加入不同體積的蒸餾水混勻。混勻稀釋后，樣液濃度范圍為0.55 g/mL～1.66 g/mL。分別加入到三角瓶中與樹脂混勻，放入恒溫振蕩器振蕩吸附12 h（恒溫振蕩器溫度為30℃），使其達到飽和吸附。以蒸餾水，70%濃度的乙醇各100 mL為洗脫劑進行解析。以1.3.2項的方法得到抑菌成分干物質，依次計算活性成分得率，并做抑菌試驗測其抑菌圈直徑。由此測定不同濃度樣品上柱對分離純化的影響效果。

1.3.6.3洗脫劑濃度對AB-8型樹脂洗脫效果的影響

精密量取預處理好的AB-8型大孔吸附樹脂20 mL共四份，分別置于100 mL三角瓶中，精密加入1.3.1項制取的樣液各10 mL，樣液濃度為1.66 g/mL。放入恒溫振蕩器振蕩吸附12 h（恒溫振蕩器溫度為30℃），使其達到飽和吸附。將吸附好的樹脂分別濕法上柱，對應先加入100 mL蒸餾水洗去雜質，然后分別以30%～90%不同濃度的乙醇各100 mL為洗脫劑進行解析。所得解析液按1.3.2方法處理。由所得抑菌成分得率和抑菌試驗測得的抑菌圈直徑來分析洗脫劑濃度對洗脫效果的影響。

1.3.7正交優化試驗

綜合單因素試驗結果，選定吸附時間（A）、樣品上柱液濃度（B）、洗脫劑濃度（C）3個對活性成分分離純化效果影響較大的因素，進行3因素3水平的正交優化試驗。試驗因素與水平設計見表1。

表1　正交因素水平表Table 1Levels and factors of orthogonal design

2結果與討論

2.1單因素試驗結果及分析

2.1.1吸附時間對吸附效果的影響

吸附時間對吸附效果的影響見表2及圖3。

由表2可知，其他條件一定時，隨著樹脂吸附時間的延長，最終得到的干物質含量增多。當吸附時間達到8 h以上，抑菌成分的得率較大。圖2表明，隨著吸附時間的延長，得到的活性成分抑菌圈直徑呈增長趨勢。表2及圖2說明，在其他條件不變時，吸附時間的長短直接影響著藏茴香水溶性活性物質的得率大小及抑菌效果。如圖3所示，吸附時間較長時，吸附的活性物質量較大，吸附效果較好，用乙醇解析后得到的抗菌物質含量較高，抑菌效果較好，抑菌圈直徑較大（如圖3所示）。

表2　吸附時間對吸附效果的影響Table 2Effect of adsorption time on adsorption

圖2　吸附時間對抑菌成分抑菌效果的影響Fig.2Influence of adsorption time on antibacterial effect

圖3　吸附2 h（左）和吸附12 h（右）得到的抑菌成分抑菌效果圖Fig.3Pictures of antibacterial effect of active ingredient after adsorption 2 h（left）and 12 h（right）

2.1.2樣液濃度對分離純化效果的影響

樣液濃度對活性成分分離純化效果的影響見表3及圖4和圖5。

表3　上柱液濃度對吸附效果的影響Table 3Influence of concentration of solution on adsorption effect

圖4　樣液上柱濃度對分離純化抑菌成分效果的影響Fig.4Effect of concentration of liqueur samples on purification

圖5　樣液加水0BV（左）和2BV（右）抑菌效果圖Fig.5Pictures of antibacterial effect of active ingredients from different dilution such as 0BV and 2BV

由表3可見，在其他條件一定時，將樣液加水稀釋可以增大抗菌物質得率。當樣液加水體積增加至2 BV，活性成分得率為最大。當稀釋倍數繼續增大，活性成分得率和抑菌效果又趨于下降。在一定范圍內，樣液濃度過大，分子間作用力增大，游離有效成分減少導致吸附量下降。而樣液太稀時，流動性太大，相同時間內樹脂難以充分吸附。由圖4及圖5可見，將樣液稀釋一定體積，抑菌圈直徑逐漸增大，加水體積增大至兩倍時，抑菌圈直徑最大。繼續稀釋，抑菌圈直徑又會變小。因此，適當的樣液稀釋利于活性抑菌物質的吸附，進而得到較大的抑菌圈直徑。同時還可除去部分雜質，由此增強抑菌效果。

2.1.3洗脫劑濃度對分離純化效果的影響

洗脫劑濃度對洗脫效果的影響見表4及圖6和圖7。

表4　洗脫劑濃度洗脫效果的影響Table 4Effect of ethanol concentration on the elution

圖6　洗脫劑濃度對分離純化效果的影響Fig.6Effect of ethanol concentration on purification

由表4可知，在其他條件一定時，隨著洗脫劑乙醇濃度增大，抑菌成分的得率逐漸增大。由圖6及圖7可知，乙醇濃度增大的時，抑菌物質對大腸桿菌的抑菌圈直徑逐漸增大。乙醇濃度增至70%～90%時洗脫率已經很高，但是乙醇濃度高卻極易揮發，從經濟，節約出發選用較低乙醇洗脫即可有明顯的抑菌效果。

圖7　30%乙醇（左）和90%乙醇（右）做解析液抑菌效果圖Fig.7Pictures of antibacterial effect of active ingredients from different elution liquid such as 30%and 90%ethanol

2.2藏茴香水溶性活性成分分離純化正交試驗結果

2.2.1正交試驗結果及分析

正交分析試驗設計結果如表5。

表5　正交試驗設計及結果Table 5Design and results of orthogonal

由表5可見，各因素對指標X抑菌圈大小影響的主次為B>C>A，即樣品上柱液濃度>洗脫劑濃度>吸附時間。根據K值選擇的較優參數組合為A2B3C3，即吸附時間為8 h，加入樣液3 BV的水稀釋樣液，用90%乙醇做洗脫劑洗脫水溶性抑菌成分。對于指標Y抑菌成分得率的主次因素為B>A>C，即樣品上柱液濃度>吸附時間>洗脫劑濃度。較優參數組合為同上，為A2B3C3。

2.2.2較優工藝條件的驗證

結合正交試驗得出提取的最佳工藝參數為：吸取1.3.1項下制備的樣液10 mL加入樣液3 BV的水稀釋樣液，與20mL經預處理的AB-8大孔在30℃水浴振蕩器中吸附為8h。將吸附好的樹脂濕法上柱，保持徑高比為1.5∶20。先用100 mL蒸餾水以3 mL/min～4 mL/min的流速洗去雜質，再用90%乙醇100 mL做洗脫劑以3 mL/min～4mL/min的流速進行解析。將得到的收集液放入烘箱烘干，完全除去乙醇的干擾后，做抑菌試驗。平行試驗3次，藏茴香水溶性抑菌成分得率分別為1.83%、1.90%、1.88%，平均得率為1.87%。抑菌圈直徑分別為19.54、19.70、19.62 mm，平均抑菌直徑為19.62 mm。根據正交試驗結果直接選擇的試驗因素水平最佳組合為A2B3C1，平均抑菌圈直徑為20.4 mm，抑菌物質得率為2.21%，抑菌圈直徑及抑菌物質得率均高于根據K值選擇的組合A2B3C3。因此，最終選擇的最佳工藝條件為A2B3C1，即吸附時間為8 h，加入樣液3 BV的水稀釋，洗脫液乙醇濃度為50%。

3結論

試驗結果表明，吸附時間、上柱液濃度、乙醇濃度對藏茴香水溶性活性成分分離純化效果的影響作用大小依次為上柱液濃度>乙醇濃度>吸附時間。通過正交分析法優化了藏茴香水溶性抗菌成分分離純化工藝，純化工藝條件為：吸附時間為8 h，加入樣液3 BV的水稀釋樣液，用50%乙醇做洗脫劑洗脫水溶性抑菌成分得率及活性都較高，驗證試驗結果與正交試驗結果接近，說明采用正交試驗篩選藏茴香水溶性活性成分分離純化工藝是可行的。

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Separation and Purification of Water Soluble Active Ingredient from Garaway

WANG Shu-lin，WANG Rui，WANG Xiu-yu
（Agriculture and Animal Husbandry College，Qinghai University，Xining 810016，Qinghai，China）

The technologies of purification of water-soluble antibacterial ingredients from caraway were studied using single factor and orthogonal test.The results showed that the adsorption time of 8 h，3 BV of water added to sample solution，with 50%ethanol as eluent to obtain antibacterial ingredient，which showed had good inhibitory effect on bacterial of E.coli.

caraway；water-soluble；anti-bacterial ingredients；purification

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.008

2013-11-25

青海省科技廳中小型企業創新補助資金（2012-G-C05）項目

王樹林（1970—），男（漢），教授，博士，研究方向：食品生物及食品加工技術。