枯草芽孢桿菌發酵小米糠對其抗氧化肽含量與抗氧化活性的影響

郭利娜，朱　玉，刁明明，陸兆新，呂鳳霞，趙海珍*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

枯草芽孢桿菌發酵小米糠對其抗氧化肽含量與抗氧化活性的影響

郭利娜，朱玉，刁明明，陸兆新，呂鳳霞，趙海珍*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

為提高小米糠的附加值，本實驗以多個枯草芽孢桿菌為起始菌株，透明圈直徑與菌 落直徑之比（H C值）為初篩指標，通 過酪蛋白平板培養法進行高產 蛋白酶菌株的初步篩 選。將初篩所獲得菌株在小米糠 基礎培養基上進行發酵，對其發酵上清液的總蛋白酶活力、多肽含量及總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）進行測定，進一步篩選出最適菌株。用此菌株對小米糠進行發酵，并對其最適發酵時間及上清液的抗 氧化活性進行測定。結果表明：NattoD-3為最佳發酵菌株，其產蛋白酶活力為90.22 IU/mL，發酵小米糠72 h時所獲得發酵上清液4 種體外抗氧化活性相對最高，分別為T-AOC值38.04 U/mL、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率75.37%、總還原力0.18及Fe2+螯合能力44.34%，最終發酵上清液的多肽含量為4.28 mg/mL，纖溶酶活力為522.64 IU/mL。

枯草芽孢桿菌；發酵；小米糠；抗氧化肽

谷子是中國傳統的谷物，每年產量約450 萬t。小米糠占谷子總量的6%～8%，每年將產生小米谷糠40 萬t左右，是一種產量較大的可再生利用資源［1-2］。研究顯示，小米糠蛋白含量和消化率均高于小米蛋白。小米糠蛋白中的8 種必需氨基酸的氨基酸評分和化學評分（分值都大于1，達到全價蛋白 的標準，且小米糠中的氨基酸組成更接近聯合國糧食及農業組織/世界衛生組織（Food and Agriculture Organization/World Health Organization，FAO/WHO）聯合食品標準計劃推薦的標準模式，營養價值堪比牛奶和雞蛋［3］。

利用微生物對食物蛋白進行發酵水解提高其營養價值，一直是食品領域的研究熱點。許多微生物具有酶的抗氧化機制，發酵后可將蛋白水解成多肽或氨基酸，可提高其生物活性及其抗氧化特性［4-5］。Chung等［6］報道，經Bacillus subtilis IMR-NK1發酵過的紅豆制品呈現出顯著的抗氧化活性。Zhu Yunping等［7］使用 Bacillus subtilis B2發酵豆腐渣蛋白，發現發酵產物中的多肽含量有了很大的提高，并且發酵產物的自由基清除活力和抗氧化活性比原來的豆腐渣蛋白有了顯著的提高。祁紅兵等［8］利用微生物對米糠進行發酵，發現其上清液的抗氧化能力有顯著提高。Amadou等［9］利用乳酸菌發酵小米，并對其發酵物進行分析，發現分子質量為600 D左右的多肽的抗氧化能力較好。枯草芽孢桿菌是一種產蛋白酶、α-淀粉酶活力較高的菌種，如果能用于小米糠發酵，將有利于小米糠資源的可再生利用，同時提高其附加價值。

本實驗以多個枯草芽孢桿菌為出發菌株，以透明圈直徑與菌落直徑之比（HC值）為指標，初步篩選出產蛋白酶活力高的菌株。然后以多肽含量、蛋白酶活力及總抗氧化能力（total antioxidative capacity，T-AOC）為復篩指標，對初篩得到的菌株進行復篩，從而獲得對小米糠發酵產蛋白酶活力、多肽含量及T-AOC較高的菌株。國內外至今尚未有關于使用Bacillus subtilis對小米糠進行液態發酵并研究其多肽和抗氧化活性變化的報道。本研究是目前深度開發利用小米糠蛋白的一個新的發展方向，對于提高小米糠的利用價值具有一定的理論指導意義。

1　材料與方法

1.1材料、菌株與培養基

小米糠 山西沁水縣，蛋白質、脂肪、淀粉、水分、灰分、纖維素、多酚、植酸含量分別為10.02%、6.15%、10.02%、9.11%、6.71%、54.16%、0.89%、2.04%。

27 株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）由南京農業大學酶工程實驗室篩選并保存。

NA培養基：牛肉浸膏3.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl 5.0 g/L、瓊脂18.0 g/L、pH 7.0。斜面培養基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏5 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂15 g/L。酪蛋白平板：蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、NaCl 0.5%，pH 7.0～7.2，脫脂奶粉1.5%。基礎培養基：脫脂小米糠6 g、葡萄糖0.1 g、NaCl 0.5 g、蒸餾水100 mL置于250 mL的三角瓶，自然pH值，115 ℃條件下滅菌20 min。

Gly-Gly-Tyr-Arg、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、菲洛嗪 美國Sigma公司；T-AOC 南京建成科技有限公司；培養基成分均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

AY120電子天平、UV-2450紫外-可見分光光度計日本Shimadzu公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺蘇州凈化設備有限公司；Anke DL-5-B離心機 上海安亭科學儀器廠；HYG-G型三層搖床 太倉實驗設備廠。

1.3方法

1.3.1菌株發酵培養

將安瓿管中的菌種接入裝有100 mL NA培養基的三角瓶中，棉塞封口，置于空氣搖床中進行擴大培養，在37 ℃、180 r/min條件下培養24 h，使菌種轉接活化。

1.3.2菌種初篩

分批取活化好的菌株進行酪蛋白平板涂布，在37 ℃恒溫培養箱內培養24 h。通過測量透明圈直徑和菌落直徑，計算HC值（透明圈直徑與菌落直徑之比）。選出HC值較高的菌株進行復篩。接種至斜面培養基上保存，數據測3 次取平均值。

1.3.3發酵培養

將初篩得到的菌種在NA培養基中進行活化，然后接入基礎培養基，置于空氣搖床中，在180 r/min、30 ℃條件下恒溫培養48 h，進行液體發酵，結束后取發酵液進行處理分析。

1.3.4發酵上清液制備

發酵培養到48 h后，將各菌株發酵液在100 ℃條件下滅菌10 min，于4 000 r/min離心20 min，取上清液，用0.45 μm濾膜過濾，濾過液即為發酵上清液。

1.3.5發酵液蛋白酶活力測定

不同菌株接入基礎培養基，在180 r/min、30 ℃條件下培養48 h，離心取上清液。上清液中酶活力的測定以2%酪蛋白為底物，采用Folin-酚法進行測定［10］。酶活力單位定義為40 ℃條件下，pH值為7.5，以每分鐘1 mL酶溶液水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸為一個酶活力單位（IU）。

酶活力標準曲線繪制：取質量濃度為0、10、20、30、40、50 μg/mL的酪氨酸標準溶液各1.00 mL，各加入0.4 mol/L碳酸鈉溶液5.00 mL，Folin-酚試劑使用液1.00 mL，然后置于（40±2） ℃水浴中顯色20 min，取出，用分光光度計于680 nm波長處分別測定其吸光度（A）值。以吸光度A680nm為縱坐標，酪氨酸的質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線方程為y=0.011 8x（R2=0.999 1）。

1.3.6小米糠發酵上清液中多肽含量的測定

取發酵上清液3 mL，加入3 mL 10 g/100 mL三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）水溶液，于漩渦混合儀上混合均勻，靜置30 min，5 000 r/min離心20 min，取1 mL上述溶液置于試管中，加入雙縮脲試劑4 mL，于漩渦混合儀上混合均勻，靜置30 min，取上清液于540 nm波長處測定A540nm值，與標準曲線對照得出樣品溶液中的多肽質量濃度，計算出發酵上清液中的多肽含量［11］。

多肽標準曲線繪制：取不同體積的Gly-Gly-Tyr-Arg標準溶液其單位為mg/mL，按照上述方法測定吸光度，以吸光度為縱坐標，多肽質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到回歸方程為y=0.045 9x+0.008 0（R2 = 0.999 9）。

1.3.7總抗氧化活力測定

根據文獻［12］采用總抗氧化活性試劑盒對小米糠發酵上清液的總抗氧化活力進行測定，平行測定3 次。抗氧化物質能將Fe3+還原為Fe2+，而Fe2+能使菲啉類物質形成穩固的絡合物，在520 nm波長處通過比色測出其抗氧化能力的高低。總抗氧化活力定義為在37 ℃條件下，每分鐘每毫升抗氧化物質使反應體系的A520nm值每增加0.01，為一個總抗氧化活力單位（U）。

式中：X為總抗氧化活力/（U/mL）；A1為測定樣的A520nm值；A0為對照樣的A520nm值；V為反應液總體積/mL；V0為取樣量/mL；n為稀釋倍數。

1.3.8DPPH自由基清除能力測定

參考Saiga等［13］的方法。樣品組是小米糠發酵上清液用蒸餾水稀釋6 倍后，與等體積的0.2 mmol/L DPPH溶液（用95%的乙醇溶解）混合；對照組是稀釋6 倍后的發酵液與95%乙醇等體積混合；空白組是95%乙醇與等體積的0.2 mmol/L DPPH溶液（用95%的乙醇溶解）混合。各組混合物搖勻，在遮光和室溫條件下反應30 min，在517 nm波長處定A517nm值。小米糠發酵上清液對DPPH自由基清除能力計算公式如下。

式中：X為小米糠發酵上清液的DPPH自由基清除率/%；As是稀釋后發酵液的A517nm值；Ac是對照組的A517nm值；Ab是空白組的A517nm值。

1.3.9Fe2+螯合能力測定

［14］方法并進行一定的改進。3 mL發酵上清液和50 μL 2 mmol/L FeCl2溶液混合，加入750 μL的蒸餾水，再加入200 μL 5 mmol/L的菲洛嗪溶液。充分混合后，在室溫下反應10 min，之后在562 nm波長處測定A562nm值。空白組是以3 mL蒸餾水代替發酵上清液與上述反應液混合，以蒸餾水調零。發酵上清液Fe2+螯合能力的計算公式如下。

式中：X為發酵上清液的Fe2+螯合能力/%；A0為空白組A562nm值；A1為發酵上清液A562nm值。

1.3.10發酵上清液總還原能力的測定

參照Kaur等［15］的方法。將2 mL的發酵上清液和5 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）混合，然后加入5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混合物在50 ℃保溫20 min。加入5 mL 10 g/100 mL TCA溶液，混勻，3 000 r/min離心10 min。取2 mL上清液和1 mL蒸餾水混合，再加入0.5 mL 0.1 g/100 mL FeCl3溶液，在700 nm波長處測定A700nm值，吸光度越高說明樣品的還原能力越強。

1.3.11纖溶酶活力測定

利用所篩選菌株對小米糠進行液態發酵后，5 000 r/min離心25 min，取上清液，測定纖溶酶酶活力。纖溶酶的活力測定采用瓊脂糖-纖維平板法［16］。將10 μL樣品液點樣在瓊脂糖纖維平板表面，置于37 ℃培養箱中保溫18 h，用游標卡尺測定溶解圈的直徑，根據標準曲線計算小米糠發酵上清液中纖溶酶的活力。

2　結果與分析

2.1菌株初篩

圖1　不同菌株產蛋白水解透明圈HC值Fig.1　HC values of protein hydrolysis transparent circles produced with different strains

由于枯草芽孢桿菌能夠分泌蛋白酶，在酪蛋白平板上可產生透明的蛋白水解圈，可通過HC值初步確定菌株產蛋白酶活力的強弱，從而獲得目的菌株。根據圖1中各菌株之間HC值的差異顯著性分析，選取HC值較大的10 種菌株進行下一步復篩實驗，分別為NattoD-3、fmbj-6、BSns、BSnd-2、NattoD-2、BSnj-1、BSnjp-1、BSnw-1、BSnm-2和BSns-3，其水解圈HC值達到4.3左右。

2.2菌株復篩

2.2.1不同菌株在基礎培養基上的發酵酶活力

圖2　不同菌株發酵上清液中蛋白酶活力Fig.2　Protease activity of fermentation supernatant with different strains

枯草芽孢桿菌具有產蛋白酶和淀粉酶能力［17］，而蛋白酶可以水解蛋白產生具有活性的短肽物質或游離氨基酸。因此，蛋白酶活力可作為復篩的一種指標。由圖2可知，NattoD-3在以上發酵菌種中產蛋白酶活力最高，與其他菌株相比差異顯著（P＜0.05），酶活力達到90.22 IU/mL。納豆芽孢桿菌本身可產納豆激酶，是蛋白酶一種，這可能是此菌株蛋白酶活高的主要原因［18］。

2.2.2不同菌株發酵產T-AOC能力及多肽含量比較

圖3　不同菌株發酵上清液中的T-AOC值和多肽含量Fig.3　T-AOC values and polypeptide contents of fermentation products with different strains

由圖3可知，NattoD-3菌株發酵上清液的T-AOC值及多肽含量顯著高于其他9 株菌株的及無菌基礎培養基（P＜0.05），其中NattoD-3發酵上清液的T-AOC值為36.13 U/mL，多肽含量為3.50 mg/mL。說明利用NattoD-3發酵的方式來提高小米谷糠中的總抗氧化活力及多肽是有意義的。所以選用此菌株進行下一步研究。

圖4　T-AOC值與多肽含量擬合圖（a）和蛋白酶活力與T-AOC值擬合圖（b）bFig.4　Fitting curves of T-AOC value against polypeptide content （a） and protease activity against T-AOC value （b）

2.2.3NattoD-3發酵產蛋白酶活力、T-AOC及多肽含量之間的關系在復篩的過程中，測定發酵上清液中的蛋白酶活力、多肽含量以及T-AOC值，通過線性擬合分析3 個指數之間的關系。由圖4可知，多肽含量與T-AOC成顯著線性相關（R2=0.964），相關系數為0.982，成正相關（P＜0.05）；蛋白酶活力與T-AOC也成顯著線性相關（R2=0.989），相關系數為0.995，成正相關（P＜0.05）。綜合分析說明，蛋白酶活力、多肽含量和T-AOC之間密切相關。

2.3NattoD-3發酵小米糠產上清液4 種體外抗氧化指標評價及發酵時間的確定

2.3.1不同發酵時間發酵上清液T-AOC能力及多肽含量的變化

圖5　不同發酵時間下發酵上清液T-AOC值及多肽含量Fig.5　T-AOC values and polypeptide contents of fermentation supernatants with different fermentation time

由圖5可知，隨著發酵時間的延長，多肽含量和總還原能力不斷增高，在72 h達到最大值，與其他發酵時間下上清液的多肽含量和T-AOC相比，差異顯著（P＜0.05），其值分別是4.28 mg/mL和38.04 U/mL，之后呈現下降趨勢。原因可能是隨著發酵時間的延長，菌株分泌蛋白酶的量不斷增加，使大的蛋白質水解成有活性的多肽物，但在72 h后一些有活性的多肽繼續被酶水解成游離氨基酸［19］，使多肽含量下降，同時T-AOC值也呈下降趨勢。

2.3.2不同發酵時間發酵上清液DPPH自由基清除能力的變化

圖6　不同發酵時間下發酵上清液DPPH自由基的清除能力Fig.6　DPPH radical scavenging capacity of fermentation supernatants at different fermentation times

由圖6可知，發酵上清液對DPPH自由基的清除能力隨著發酵時間的延長呈現上升的趨勢，當發酵時間達到72 h時，小米糠發酵上清液對DPPH自由基的清除能力為75.37%，達到最高值，之后開始下降。DPPH自由基的清除能力降低的原因可能是多肽類物質包含電子供體和能使自由基鏈式反應終止的氨基酸如Cys、Met、Trp、Tyr和Phe暴露于反應環境中。如含有含硫氨基酸（Cys和Met）殘基的多肽具有親核作用；側鏈基團有Trp、Tyr和Phe的多肽具有供氫能力［20］。發酵時間過長使有活性的多肽物質被水解，所以發酵時間過長或者過短都會降低發酵產物的供氫和供電子能力，影響發酵產物對DPPH自由基的清除效果，進而使發酵上清液的抗氧化活性呈現較低狀態［21］。

2.3.3不同發酵時間發酵上清液總還原能力的變化

圖7　不同發酵時間下發酵上清液總還原力Fig.7　Reducing power of fermentation supernatants at different fermentation times

研究發現生物活性物質的抗氧化性能與它們的還原能力有著直接的關系。還原力的分析通常被用來評價天然抗氧化物提供氫原子或者提供電子的能力［22］。如圖7所示，隨著發酵時間的延長，發酵上清液的總還原力先上升后下降，且在72 h后達到最高（0.18），說明發酵上清液是一種較好的電子供體，通過自身的氧化使氧化物質得到還原，且與DPPH自由基的清除能力趨勢相符。

2.3.4不同發酵時間下發酵上清液Fe2+的螯合能力變化

圖8　不同發酵時間下發酵上清液Fe22++的螯合力Fig.8　Fe2+chelating capacity of fermentation supernatanta at different fermentation times

由圖8可知，在0～120 h范圍內，發酵上清液對Fe2+的螯合能力隨著時間的增加呈現上升趨勢，72 h達到最高（44.34%），之后隨著時間的延長呈下降趨勢。可能由于隨著發酵時間的增加，一些大的蛋白被酶水解，使一些酸性和堿性氨基酸暴露，其在側鏈部位的羧基與氨基能與Fe2+螯合。Saiga等［13］報道酸性和堿性氨基酸對Fe2+和Cu2+的螯合能力有重要作用。酸性氨基酸（Glu和Asp）和堿性氨基酸（Lys和Arg）大量暴露于環境中對Fe2+的螯合能力增加有重要作用。Chen等［23］在研究中分離到含組氨酸殘基的抗氧化活性肽，并指出其抗氧化活性與肽鏈中組氨酸殘基中的咪唑基螯合金屬離子的能力有關。

2.3.5篩選到的納豆芽孢桿菌的纖溶酶活力

納豆芽孢桿菌是可食用菌，此菌種在發酵過程中高產纖溶酶，有溶血栓等作用［24］。由于篩選到的高產蛋白酶菌株是一種納豆菌NattoD-3，應具有產纖溶酶活性。因此，本研究中對所篩選菌株發酵小米糠上清液中的纖溶酶活力進行測定。根據抗氧化實驗結果，最佳發酵時間為72 h，此時發酵上清液中的纖溶酶活力為522.64 IU/mL，與李妍等［24］報道的利用納豆芽孢桿菌產纖溶酶的酶活力（511 IU/mL）相當。

3　結 論

以多個枯草芽孢桿菌為出發菌株，酪蛋白平板蛋白酶圈（HC值）為初篩指標，篩選出10 種具有較高產蛋白酶活力的菌株；以T-AOC、蛋白酶活力及多肽含量為復篩指標，在小米糠基礎培養基上篩選出一種高產蛋白酶活力的菌株NattoD-3；利用NattoD-3對小米糠基礎培養基進行發酵，對其發酵上清液的4 種體外抗氧化能力隨發酵時間的變化進行測定，發現最佳發酵時間為72 h，此時小米糠發酵上清液的T-AOC值、DPPH自由基清除率、總還原力和Fe2+螯合能力分別為38.04 U/mL、75.37%、0.18和44.34%，多肽含量為4.28 mg/mL。纖溶酶活力測定發現發酵上清液中具有較高的纖溶酶活力（522.64 IU/mL）。此研究結果表明，利用本實驗中所篩選的菌株對小米糠進行發酵，不僅可獲得具有抗氧化活性的多肽，還可以獲得具有溶血栓作用的纖溶酶，這對于提高小米糠的附加值具有重要的理論和實際應用價值。

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Effect of Fermentation by Bacillus subtilis on Antioxidant Peptide Content and Antioxidant Activity of Millet Bran

GUO Lina， ZHU Yu， DIAO Mingming， LU Zhaoxin， L? Fengxia， ZHAO Haizhen*
（College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

In order to fi nd the most suitable strain for the production of antioxidant peptides and plasmin from millet bran，initial screening of 27 Bacillus subtilis stains for the ratio of transparent circle diameter to bacterial colony diameter （HC value） was performed on casein agar plates and further screening of the selected strains based on total proteinase activity，peptide conten t and total antioxidant capacity （T-AOC） of fermentation supernatants was conducted using the basal medium containing millet bran. This study also investigated the optimal fermentation time for antioxidant activities of fermentation supernatants using the selected optimal strain. Results showed that NattoD-3 was found to be the optimal strain for the fermentation of millet bran， yielding a protease activity of 90.22 IU/mL. The optimal fermentation time was 72 h， and the resulting T-AOC， DPPH radical scavenging activity， reducing power and Fe2+chelating ability of millet bran fermentation supernatant were 38.04 U/mL， 75.37%， 0.18 and 44.34%， respectively. The peptide content in the fermentation supernatant reached 4.28 mg/mL with plasmin activity of 522.64 IU/mL.

Bacillus subtilis； fermentation； millet bran； antioxidant peptide

TS209

A

1002-6630（2015）13-0196-06

10.7506/spkx1002-6630-201513036

2014-08-08

中央高校基本科研業務費重點項目（kyz201118）

郭利娜（1990—），女，碩士研究生，主要從事食品生物技術研究。E-mail：2012108005@njau.edu.cn

趙海珍（1975—），女，副教授，博士，主要從事食品生物技術研究。E-mail：zhaohz@njau.edu.cn