巨刺對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織VEGF和Ang-1蛋白表達的影響*

石學慧　張素蘭　曹夏　王凌燕　段霞　劉未艾　張志萍△

（1.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南長沙410005；2.湖南中醫藥大學，湖南長沙410208）

·研究報告·

巨刺對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織VEGF和Ang-1蛋白表達的影響*

石學慧1張素蘭2曹夏2王凌燕2段霞2劉未艾1張志萍1△

（1.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南長沙410005；2.湖南中醫藥大學，湖南長沙410208）

目的觀察巨刺對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織VEGF和Ang-1蛋白表達的影響，探討巨刺治療腦缺血再灌注損傷可能的作用機制。方法雄性SD大鼠按隨機數字表法隨機分為空白組、假手術組、模型組、健側針刺（即巨刺法）組、患側針刺組。各組再分為3 d和14 d兩個亞組。采用改良線栓法制備腦缺血再灌注損傷大鼠模型。于再灌注24 h后，健側針刺組針刺人中、百會及電針健側穴位；患側針刺組針刺人中、百會及電針患側穴位。電針選用疏密波，每次持續刺激30 min，每日1次。分別于3 d和14 d光鏡下觀察大鼠缺血腦組織結構；采用免疫組化法（S-ABC法）測定大腦皮質血管內皮生長因子（VEGF）和血管生成素-1（Ang-1）蛋白表達的變化。結果針刺治療后大鼠缺血區腦組織損傷程度明顯改善，其中健側針刺組較患側針刺組改善明顯；健側針刺組、患側針刺組VEGF及Ang-1的表達均較模型組增多（P＜0.05）；而健側針刺組的表達較患側針刺組顯著增多（P＜0.05）。結論巨刺能夠明顯改善再灌注損傷大鼠缺血區腦組織損傷程度，其機制可能與上調腦組織VEGF和Ang-1表達有關。

巨刺腦缺血再灌注損傷血管內皮生長因子血管生成素-1腦組織

近年來我國缺血性腦血管病發病呈現年輕化的趨勢，且致殘率居高不下。研究表明，缺血缺氧刺激和臨床溶栓藥物的使用在血管再通、血流供應恢復的同時往往帶來再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷是指缺血腦組織恢復血供后，腦組織損傷反而進一步加重。針灸不僅能治療缺血性腦病，而且對防治腦缺血再灌注損傷方面也取得了一定成效［1］。巨刺治療中風偏癱古已有之，現代報道亦療效滿意，并且具有普通針刺所不具備的可配合運動療法、不加重患側痙攣程度等優點。然而相關實驗研究較少，缺乏客觀的指標說明其治療機制。研究發現，腦缺血后微血管新生促進血流恢復和氧供的同時為神經再生和突觸發生創造了條件，影響神經功能恢復，也決定著預后。而血管生成與血管內皮生長因子（VEGF）和血管生成素（Ang）這兩種主要的促血管生成因子密切相關。VEGF作用于血管形成早期，促進原始血管網形成；Ang則作用于隨后的血管改建，促進形成成熟的血管網。因此本實驗觀察巨刺對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織VEGF和血管生成素-1（Ang-1）蛋白表達的影響，探討巨刺治療腦缺血再灌注損傷可能的作用機制。現報告如下。

1　材料與方法

1.1動物清潔級健康SD雄性大鼠140只，體質量（260±20）g，湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，在實驗前與實驗中分批購入，動物合格證號：SCXK（湘）2013-0004，飼養溫度20～25℃，相對濕度50%～70%。

1.2實驗材料電針儀，M6805-Ⅰ型；華佗牌31號0.5寸無菌針灸針；VEGF、Ang-1免疫組化（S-ABC法）試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3模型制備造模方法參照Zea Longa線栓法制備模型［2］，栓塞2 h后拔出魚線再灌注。假手術組不阻塞大腦中動脈，插線深度5 mm左右，其余手術步驟同模型組。造模動物在自然蘇醒后，按照Zea-Longa神經缺損體征評分標準評分［2］。造模后即刻評分，為1～3分者納入實驗，未達標準者剔除。

1.4分組與干預采用隨機數字表法分為空白組、假手術組各20只；造模組60只，造模后再分為模型組、健側針刺組、患側針刺組；各組再分為3 d亞組和14 d亞組，各10只；其余40只備用。空白組、假手術組、模型組正常喂養3 d和14 d。健側針刺組（即巨刺組）針刺人中、百會及健側肢體曲池、合谷、足三里、三陰交行電針治療；患側針刺組針刺人中、百會及患側肢體曲池、合谷、足三里、三陰交行電針治療。取穴定位、針刺深度均參照中國針灸學會實驗針灸研究會華興邦等制定的《常用動物腧穴圖譜》［3］。電針治療波形選用疏密波，電流強度1 mA，以大鼠觸須、耳朵微動為度，每次持續刺激30 min。在缺血再灌注24 h后行第1次電針治療，每日1次。

1.5標本采集與檢測每組大鼠分別于3 d和14 d行最后一次治療后取材，深度麻醉后以預冷的0.9%氯化鈉注射液左心室灌流沖洗，換經預冷的4%多聚甲醛固定，斷頭取腦，制備石蠟切片，取大腦皮質缺血區為觀察部位，以相鄰切片用于HE染色和免疫組化。HE染色后于400倍光鏡下觀測各組皮質區缺血腦組織形態學改變。免疫組化檢測腦組織缺血區及周圍VEGF、Ang-1的表達情況：免疫組化步驟按照試劑盒說明書進行操作。結果判定以胞漿染成棕黃色為陽性細胞。每例大鼠選3張切片，每張切片隨機選3個視野進行攝像（400倍），用IPP6.0圖像處理分析軟件分別對VEGF、Ang-1的陽性細胞的平均光密度進行分析。

1.6統計學處理采用SPSS 17.0統計軟件分析。計量資料以（±s）表示，均進行正態性、方差齊性檢驗，各組組間差異采用單因素方差分析，若方差齊時采用LSD檢驗，不服從正態性和（或）方差不齊時用非參數檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組腦組織常規病理染色結果見圖1。空白組、假手術組大腦皮質：細胞層次整齊，結構完整，具有完整細胞核和豐富的胞漿，染色均勻。模型組大腦皮質：細胞數顯著減少，細胞層次模糊、不完整，排列疏松，細胞形態腫脹不規則，梗死灶邊緣可見壞死細胞。健側針刺組：細胞數多于模型組，層次豐富，排列緊密，部分神經細胞完整，壞死細胞數量較模型組明顯減少。患側針刺組：與健側針刺組比較，組織結構較疏松，間質稍見水腫，壞死細胞數量較健側針刺組稍多。

圖1　光鏡下各組大鼠缺血腦組織結構（400倍）

2.2各組動物VEGF和Ang-1表達水平比較見表1。空白組、假手術組的腦缺血及周圍組織均有少量VEGF和Ang-1表達，兩者差異無統計學意義（P＞0.05）。與空白組、假手術組相比，其他3組的VEGF、Ang-1表達均顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，健側針刺組和患側針刺組VEGF、Ang-1表達較前者上升（P＜0.05）；健側針刺組與患側針刺組相比，前者優于后者（P＜0.05）。

表1　各組大鼠3 d、14 d后大腦皮質VEGF、Ang-1蛋白表達的比較（±s）

表1　各組大鼠3 d、14 d后大腦皮質VEGF、Ang-1蛋白表達的比較（±s）

與空白組、假手術組比較，△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05；與健側針刺組比較，☆P＜0.05。

組別n空白組10假手術組10模型組10健側針刺組10患側針刺組10 3 d亞組0.138±0.035 0.124±0.031 0.260±0.052△0.375±0.064△*0.316±0.066△*☆14 d亞組0.132±0.026 0.141±0.036 0.242±0.052△0.359±0.065△*0.298±0.063△*☆

3　討論

“巨刺”首見于《內經》，屬于九刺法之一。早在元代杜思敬的《濟生拔粹·針經摘英集》就有關于巨刺治療腦卒中的明確記載。中醫學認為缺血性中風是由于氣血瘀滯、腦脈痹阻、竅閉神匿、肌膚筋脈失于濡養，肢體失用所致。而巨刺法是運用全身經絡系統相互溝通、聯系的特點，通過刺激健側經絡，調動正氣，借健側經絡間接達到疏通患側氣血，改善患側肢體經絡阻滯不通、針感較差、不容易得氣的特點。因此，本實驗以針刺健側肢體作為實驗組，以針刺患肢作對照。通過人中、百會醒腦調神導氣；內關調理心神、疏通氣血；曲池疏通肢體經絡；足三里補虛健運、調和氣血；三陰交補三陰、益肝腎、調氣血。根據經絡理論，人體經絡系統是通過臟腑組織和奇經八脈相互溝通，且部分經絡左右交叉。因此，左右側經絡在生理上是互相聯系，在病理上是相互影響。現代解剖學同樣可以為巨刺治療中風偏癱提供理論依據［4］。

缺血性腦血管病的現代醫學治療主要有超早期溶栓治療、保護神經細胞，其目的在于盡快恢復血供和重建神經結構。而神經細胞的增殖并不是單獨發生的，神經前體細胞的增殖與血管的生成密切相關。因此通過對血管再生的研究就可以大致了解和掌握神經元再生的情況。VEGF是已知的促進血管生長作用最強的細胞因子，VEGF/VEGFR系統激活使內皮細胞增生并誘導新生血管形成，增加受累腦組織再灌注及供氧量，從而減輕缺血再灌注損傷。Ang-1可以抑制血管內皮細胞的凋亡，減輕腦缺血后血腦屏障的滲漏從而減少梗死體積，促進血管內皮細胞的出芽與遷移。研究表明，針灸治療缺血性腦病具有促進血管新生的作用［5］。因此，本研究以VEGF、Ang-1為檢測指標。而局灶性腦缺血大鼠缺血腦組織VEGF在缺血第3日達高峰［6］。Ang-1于第14日達高峰［7］。故本實驗分別于3 d和14 d檢測缺血腦組織VEGF、Ang-1的表達水平。實驗觀察到，手術創傷對腦內血管內皮細胞VEGF及Ang-1的表達無明顯影響；模型組VEGF及Ang-1的表達上升，說明腦缺血時，腦組織在一定程度上會自發性地出現血管新生，這與劉媛媛等的研究結果相一致［8］；健側針刺組、患側針刺組VEGF及Ang-1的表達均較模型組明顯增多，而健側針刺組較患側針刺組明顯，說明針刺可以改善腦缺血再灌注損傷大鼠缺血腦組織損傷程度，實現對腦缺血損傷的保護作用，而巨刺的效果更明顯。巨刺可調節促血管生成相關因子，改善腦缺血后病側腦的血液循環，通過促進內皮細胞增生并誘導內皮細胞遷移，新生血管形成，改善腦病灶及周圍腦細胞的營養，從而改善缺血區腦組織的損傷程度。其作用可能是通過上調VEGF、Ang-1來實現的，這可能是巨刺治療腦缺血再灌注損傷的機制之一。本實驗結果與文獻報道相符合［9］。但有文獻報道VEGF也增加血管的通透性，可以導致腦水腫進而加重缺血性腦損害［10］。因此，巨刺的作用機制可能是多層次的，具體是哪些因子在起主導作用，又或是抑制了哪些細胞因子，有待進一步的研究。本研究提示了針刺與VEGF、Ang-1可能存在必然聯系，從血管生成的角度初步探討巨刺治療缺血再灌注損傷的作用機制，為進一步探索巨刺的作用機制提供實驗依據。

［1］汪瑩．針灸防治腦缺血再灌注損傷實驗研究進展［J］.實用中醫藥雜志，2008，24（2）：133-135.

［2］Longa EZ，Weinstein PR，Carson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlus-ion without craniectomy in rats［J］. Stroke，1989，20：84.

［3］華興邦，李辭蓉，周浩良，等.大鼠穴位圖譜的研制［J］.實驗動物與動物實驗，1991，1（1）：1-3.

［4］解秸萍.巨刺法神經解剖學機制探討［J］.上海針灸雜志，1997，16（2）：28-29.

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Effects of Opposing Needling on the Expression of VEGF and Ang-1 in Brain Tissue in Rats with Focal Cerebral Ischemia-reperfusion Injury

SHI Xuehui，ZHANG Sulan，CAO Xia，et al.The Second Affiliated Hospital，Hunan University of TCM，Hunan，Changsha 410005，China

Objective：To observe the effects of opposing needling on the expression of VEGF and Ang-1 in brain tissue in rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury and explore the possible mechanism of the opposing needling for treating rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods：One hundred SD male rats were randomly divided into the blank group，the sham-operated group，the model group，the unaffected-side acupuncture group（opposing needling group）and the affected-side acupuncture group，with twenty rats in each group.And groups were divided into 3d subgroup and 14d subgroup.The model of focal cerebral ischemia-reperfusion was established by inserting nylon thread into the internal carotid artery.Twenty-four hours after reperfusion，Unaffected-side acupuncture group，as well as Affected-side acupuncture group，was treated with"renzhong"，"baihui"and electro-acupuncture.Electro-acupuncture was chosen with constant stimulation of the density wave for thirty minutes every day.The ultrastructure of brain tissue on 3 rd and 14 th day after focal cerebral ischemia reperfusion was observed with the optical microscope.And the expression of VEGF and Ang-1 in cerebral cortex tissue was detected with immunehistochemical method.Results：The degree of ischemic brain tissue damage in rats was improved significantly after acupuncture.But the unaffected-side acupuncture group had an more obvious improvement than that of the affected-side acupuncture group.In comparison with the sham group，the expression of VEGF and Ang-1 in unaffected-side acupuncture group and affected-side acupuncture group increased significantly（P＜0.05）.And the expression of VEGF and Ang-1 in unaffected-side acupuncture group was more than that in the affected-side acupuncture group（P＜0.05）.Conclusion：Opposing needling can greatly improve the injury of ischemia reperfusion of brain tissue in rats，which may be related to its effect in up regulating VEGF an-d Ang-1 after the ischemia-reperfusion injury.

Opposing needling；Ischemia-reperfusion；VEGF；Ang-1；Brain tissue

R285.5

A

1004-745X（2015）09-1525-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.09.007

2015-04-22）

湖南省科技計劃項目（S2014S2033）

（電子郵箱：1617564871@qq.com）