電針百會、神庭穴對MCAO大鼠學習記憶能力及IL-1β、TNF-α表達的影響*

俞坤強　李曉潔　彭洪衛　卓沛元　張穎錚

林曉敏1　林如輝1　陶靜1　陳立典1，2，3△

（1.福建中醫藥大學，福建福州350122；2.福建康復重點實驗室，福建福州350122；3.國家中醫藥管理局中醫康復研究中心，福建福州350122）

·研究報告·

電針百會、神庭穴對MCAO大鼠學習記憶能力及IL-1β、TNF-α表達的影響*

俞坤強1李曉潔1彭洪衛1卓沛元1張穎錚1

林曉敏1林如輝1陶靜1陳立典1，2，3△

（1.福建中醫藥大學，福建福州350122；2.福建康復重點實驗室，福建福州350122；3.國家中醫藥管理局中醫康復研究中心，福建福州350122）

目的觀察電針神庭、百會穴對局灶性腦缺血再灌注大鼠學習記憶的影響，并探討其可能的機制。方法雄性Sprague-Dawley大鼠45只，采用線栓法制備局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，造模成功后隨機分為假手術組、模型組和電針組，各15只。電針組大鼠取神庭、百會穴，電針治療7 d。各組大鼠在造模后第3天開始采用定位航行實驗和空間探索實驗檢測學習記憶能力；觀察各組大鼠神經行為學的表現；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）檢測腦梗死體積；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察海馬區神經元破壞和水腫情況；蛋白免疫印跡（Western blotting）法檢測大鼠左側海馬白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）炎癥因子的表達。結果同模型組相比，電針組大鼠學習記憶能力改善（P＜0.05），神經行為學評分降低（P＜0.05），腦梗死體積減小（P＜0.001），海馬CA1區神經元破壞情況減輕，IL-1β、TNF-α炎癥因子表達降低（P＜0.05）。結論電針能改善局灶性腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力，其機制可能與減輕腦內神經元的破壞和水腫、抑制IL-1β、TNF-α炎癥因子表達相關。

腦缺血電針學習記憶IL-1βTNF-α

認知障礙作為腦卒中后常見的一種功能障礙，其發病率高達64%［1］，嚴重影響腦卒中患者的功能恢復，并給患者家庭帶來沉重的經濟負擔［2-3］。針刺治療用于腦部的疾病，已具有悠久的歷史［4］。課題組的前期臨床研究也證實，針刺百會、神庭穴，可以有效地改善腦卒中患者的認知功能［5］。認知障礙是一個復雜的病理過程，與海馬區神經元的損傷和凋亡密切相關［6］，研究認為炎癥反應在腦缺血再灌注后，海馬區神經元損傷的病理過程中有重要作用［7］。課題組前期的基礎研究證實，針刺可以通過抑制炎癥反應從而減輕腦缺血所帶來的大腦損傷［8］。故本研究選用百會、神庭穴，觀察電針對局灶性大腦中動脈栓塞模型（MCAO）大鼠的學習記憶能力以及與炎癥因子白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的影響。

1　材料與方法

1.1動物Sprague-Dawley大鼠45只，均由福建中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK2012-003，體質量（260±20）g，每籠5只大鼠，均自由進食及飲水，適應性飼養1周。實驗過程中均嚴格按照國際動物保護及使用指南的規定進行。

1.2試劑與儀器水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司）；蘇木精、伊紅（福建中醫藥大學醫學實驗中心）；Il-1β、TNF-α抗體（Cell Signaling Technology）；β-actin抗體及相應的二抗（北京全式金生物技術有限公司）。Morris水迷宮實驗裝置及動態圖像采集分析系統（中國醫學科學院藥物研究所）；電針儀（蘇州醫療用品廠有限公司）；Bio-Image分析系統（BioRad）；YF-7FB型攤片烤片機（湖北省孝感市亞光醫用電子技術有限公司）。

1.3分組和造模將SD大鼠隨機分成假手術組15只、手術組30只，術前所有大鼠均禁食12 h，經10%的水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉后，參造Longa法［9］建立局灶性大腦中動脈栓塞模型。大鼠頸部消毒、備皮后，沿著正中線剪開頸部的皮膚，而后鈍性分離組織，并將頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈充分暴露，并于近心端結扎頸總動脈，頸內、外動脈分叉處結扎頸外動脈，并用動脈夾夾閉頸內動脈遠心端，而后在離頸總動脈結扎處遠心端約2～3 mm處剪一小口，將備好的栓線經切口插入，至有少許阻力為止，其插入長度為離頸內、外動脈分叉處約18～22 mm，結扎頸內動脈，常規傷口縫合。待缺血2 h后，退出栓線，造成缺血再灌注模型。實驗過程中，密切觀察大鼠的變化，注意動物保溫。假手術組大鼠只給予分離血管，不結扎和插入栓線。待動物完全蘇醒后，參照Zea-Longa法［10］，進行神經行為學評分。0分，無神經缺失的癥狀；1分，不能完全伸展對側前爪；2分，向右側轉圈；3分，向對側傾倒；4分，神經缺失嚴重，不能自發行走。其中，0分、4分的大鼠予以排除。將合格的大鼠隨機分成模型組15只，電針組15只，并分別放回籠中正常飼養。電針組在造模后第2天予電針刺激。取穴百會和神庭，參考《實驗針灸學》，采用疏密波，頻率為1/20 Hz，電壓3～5 V，以大鼠安靜耐受、穴位周邊組織輕輕抖動為度，每天同一時間開始治療，每次30 min，每天1次，持續7 d。假手術組和模型組大鼠，不予任何治療，只給予同等條件的抓取。

1.4標本采集與檢測

1.4.1神經行為學評分模型組和電針組大鼠在電針治療的第1、3、5、7天，參照Zea-Longa法，進行神經行為學評分。

1.4.2水迷宮實驗水迷宮實驗于干預的第3天開始，總共歷時5 d。采用直徑、高度分別為120 cm和50 cm，水深為30 cm的圓形水池，水溫保持在（22±2）℃。水池劃分為4個均等象限，圓形逃逸平臺隱匿于任意象限中心位置，直徑、高度為6 cm和28 cm，低于水面2 cm，照明設備四周對稱。1）定位航行實驗：鼠放入水中自由游泳2 min以熟悉周圍的環境，而后分別從4個象限順時針面向池壁放入水中，測定大鼠在90 s的時間內找到平臺所需時間，記為逃避潛伏期，由計算機記錄各項參數，若大鼠在90 s內未尋找到平臺，則牽引大鼠至平臺，停留10 s，記錄逃避潛伏期為90 s，實驗總共歷時4 d。2）空間探索實驗：電針干預的第7天，撤去平臺，經任何一個象限將大鼠面向池壁放入水中，觀察在90 s的時間內大鼠穿越原平臺所在位置的次數。

1.4.3腦梗死體積檢測采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法。將快速取得的腦組織置于-20℃冰箱冷凍15～20 min，待腦組織變硬后，從大腦半球額極到枕極，做連續的冠狀位切片，切成6片，每片厚約為2 mm。而后將腦片置于1%TTC磷酸緩沖液（pH= 7.4），并放置37℃恒溫箱30 min，過程中用毛筆不時翻動腦片，使腦片均勻染色。TTC可與脫氫酶反應而呈現紅色，而由于缺血組織內脫氫酶活性下降，故不與TTC反應，從而呈現蒼白色。利用Image-Pro Plus 6.0分析軟件，計算梗死面積以及整個大腦面積，然后得出腦梗死體積百分比=（梗死面積和×2 mm）/（全腦面積和× 2 mm）［11］。

1.4.4海馬CA1區細胞形態觀察麻醉大鼠后，迅速開胸暴露心臟，在心尖剪一小口，灌胃針從開口刺入心臟，調整方向后插入主動脈出口，用止血鉗固定灌胃針，而后在右心耳剪一小口，經灌胃針快速注入0.9%氯化鈉溶液300 mL，后灌入4%多聚甲醛400 mL固定。快速取腦后，將大腦置于4%多聚甲醛4℃固定24～48 h，在進行梯度脫水、石蠟包埋后，進行冠狀切片，片厚約5 μm。腦片在二甲苯中脫蠟、梯度酒精脫水后，行蘇木素和伊紅（HE）染色，光鏡下觀察組織的病理變化。

1.4.5海馬組織炎癥因子表達的檢測采用蛋白免疫印跡法。取左側的海馬組織，每100 mg腦組織中加入1 mL的裂解緩沖液和10 μL苯甲基磺酰氟儲存液，機械研磨后，13000 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。待樣品蛋白充分變性后，取樣品蛋白50 μg，10%SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移到PVDF膜，封閉液室溫封閉2 h，分別用Il-1β、TNF-α（1∶1000）、β-actin一抗（1∶5000）孵育，4℃搖床過夜，而后辣根過氧化物標記的二抗（1∶5000）室溫孵育1 h。將PVDF膜放圖像掃描儀上，使顯色液覆蓋PVDF膜，利用Im age-lab圖像分析系統進行成像和分析。

1.5統計學處理采用SPSS18.0統計軟件分析。兩組計量資料符合正態分布，則進行兩獨立樣本T檢驗；不符合正態分布，則進行秩和檢驗；多組計量資料符合正態分布，則進行單因素方差分析，方差齊者用LSD法，方差不齊則用Games-Howell法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組神經行為學評分比較見表1。模型組大鼠神經行為學評分在各個時間節點明顯高于假手術組。MCAO大鼠在經過電針治療后，神經功能缺損癥狀得以減輕，評分下降（P＜0.05），說明電針百會、神庭穴，具有治療作用。

表1　各組大鼠神經行為學評分比較（分，±s）

表1　各組大鼠神經行為學評分比較（分，±s）

與模型組比較，△P＜0.05。

組別n電針組8假手術組8模型組8第1天第3天第5天第7天2.25±0.71 1.87±0.35 1.37±0.52 1.13±0.35△0000 2.37±0.74 2.00±0.53 1.75±0.46 1.63±0.52

2.2各組水迷宮實驗結果比較見表2、表3。定向航行實驗結果表明，隨著時間推移，各組大鼠平均潛伏期逐漸縮短，而電針組大鼠的行為學表現明顯好于模型組（P＜0.01）；空間探索實驗顯示，電針組大鼠穿越原平臺次數明顯多于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），說明電針百會、神庭穴可以改善大鼠的學習記憶能力。

表2　各組大鼠逃避潛伏期比較（s，±s）

表2　各組大鼠逃避潛伏期比較（s，±s）

與假手術組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.001。

組別n電針組8假手術組8模型組8第3天第4天第5天第6天69.84±6.97△52.24±3.72△41.97±9.00△27.28±6.02△32.55±5.1625.47±4.2718.62±4.5714.00±3.93 86.16±3.42*76.69±5.52*68.38±3.20*58.32±7.80*

表3　各組大鼠穿越平臺次數比較（次/90 s，±s）

表3　各組大鼠穿越平臺次數比較（次/90 s，±s）

與假手術組比較，*P＜0.001；與模型組比較，△P＜0.05。

組別n電針組8假手術組8模型組8次數2.88±0.75△4.38±1.06 1.75±1.04*

2.3各組腦梗死體積比較見表4。與模型組相比較，電針組大鼠腦梗死體積占全腦體積的百分比小于模型組，兩組差異有統計學意義（P＜0.001）。

表4　各組大鼠腦梗死體積百分比比較（%，±s）

表4　各組大鼠腦梗死體積百分比比較（%，±s）

與模型組比較，△P＜0.001。

組別n電針組8模型組5腦梗死體積百分比16.38±2.64△34.88±1.98

2.4各組海馬CA1區細胞染色結果見圖1。結果顯示，假手術組大鼠的神經元排列整齊，細胞結構正常，而模型組大鼠神經元溶解，細胞核固縮，少數神經細胞染色加深，損傷和水腫嚴重，而電針組大鼠神經元損傷較輕，結構較完整。

圖1　各組大鼠海馬CA1區細胞形態（HE染色，400倍）

2.5各組海馬組織炎癥因子表達見圖2、表5。與假手術組相比，模型組大鼠IL-1β、TNF-α，表達增加，而電針組大鼠的IL-1β、TNF-α表達較模型組少，表明電針抑制了炎癥因子IL-1β、TNF-α的表達。

圖2　各組大鼠海馬IL-1β、TNF-α表達

表5　各組大鼠海馬IL-1β、TNF-α表達比較（%，±s）

表5　各組大鼠海馬IL-1β、TNF-α表達比較（%，±s）

與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別n電針組5假手術組5模型組5 IL-1β/β-ActinTNF-α/β-Actin 53.16±12.54△43.84±5.84△30.97±13.8528.63±4.40 71.98±12.59*70.93±7.67*

3　討論

認知障礙在中醫學古代文獻中，多散見于“健忘”“善忘”“呆病”“遺忘”等證中［12］，其病機與神明失養、失用相關，而腦為神明之主，對神明有重要的調控作用。督脈為陽脈之海，其行入絡腦，而百會、神庭兩穴皆為督脈的要穴，且皆位于腦，具有開竅、醒神、定志之功，故可用于治療認知障礙［13-14］。郭新榮等［15］在研究針灸治療顱腦疾病腧穴選取規律中發現，在涉及的經脈中，使用頻率最高的為督脈；所涉及的腧穴中，使用頻率最高的為百會（68%）。故本研究選取百會、神庭為主穴觀察電針對MCAO大鼠的學習記憶功能的影響，且取得較為理想的實驗結果。

學習記憶是大腦認知功能的一個重要組成部分，與海馬密切相關，有研究認為在細胞水平上，海馬與其他區域的神經網絡神經元間的突觸強度變化是最可能的學習記憶機制［16］。海馬作為學習記憶的關鍵部位，也是腦缺血的敏感區域［17］，當組織缺血時，則會引起海馬本身及其周圍神經細胞的死亡或者凋亡，導致學習記憶障礙［18］。研究表明，IL-1β、TNF-α等炎癥因子的釋放，會引起炎癥反應，最終導致海馬神經元的損傷［19］。此外，IL-1β、TNF-α被認為是一種“前炎性細胞因子”［7，20］，當其濃度升高時，可以使p38MAPK信號活性增強，而p38MAPK對腦損傷后的神經功能起負性調節作用［21］，最終導致海馬區神經元的破壞［22］。另有研究表明，認知功能障礙的發生還與海馬區神經元與膠質細胞之間的聯系發生障礙相關［23-24］，而由膠質細胞所釋放的炎癥因子IL-1β、TNF-α在這其中也發揮著重要的作用［25-26］，故炎癥因子IL-1β、TNF-α在腦缺血導致的學習記憶障礙的過程中有重要的作用。

本實驗中，電針百會、神庭穴可以改善了MCAO大鼠的神經缺損癥狀和水迷宮實驗的行為學表現，說明電針可以改善MCAO大鼠的學習記憶能力。實驗結果顯示，電針組大鼠腦梗死體積小于模型組，神經破壞和水腫情況好于模型組，且IL-1β、TNF-α等相關的炎癥因子的表達也低于模型組，說明電針改善了腦缺血再灌注后的病理損傷。綜上所述，電針神庭、百會穴可以治療MACO大鼠的學習記憶障礙，且這種治療作用可能與下調IL-1β、TNF-α相關炎癥因子表達，減輕神經元損傷相關。然而實驗中只采用了水迷宮實驗一種行為學評價的方法，存在一定的局限性，在今后的研究中應予以改進。

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Effect of Electro-acupuncture on Learning and Memory Ability and IL-1β，TNF-α Expression in Rats with Cerebral Ischemic/Reperfusion

YU Kunqiang，LI Xiaojie，PENG Hongwei，et al.Kangfu Medicine School of Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fujian，Fuzhou 350122，China

Objective：To observe the efficacy of treatment with electro-acupuncture at Baihui（DU20）and Shenting（DU24）on learning and memory ability in rats after cerebral ischemia/reperfusion（I/R）injury and explore its possible mechanism.Methods：45 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into the sham group（n=15），the ischemia group（n=15）and the electro-acupuncture group（n=15）after surgery.The latter 2 groups were modeled as focal cerebral ischemia/reperfusion（I/R）injury，and the electro-acupuncture group received electro-acupuncture at Baihui（DU20）and Shenting（DU24）for 7 days.The learning and memory ability were tested by Morris water maze；the cerebral infarction volume was measured by TTC staining and image analysis；neurological deficit score was evaluated；the damage and edema of neuron were detected with hematoxylineosin staining，and the protein expression of IL-1β and TNF-α were detected by Western blotting.Results：Compared with the ischemia group，the learning and memory ability improved（P＜0.05）；the neurological deficit score decreased（P＜0.05）；the cerebral infarction volume reduced（P＜0.001）；the neuronal damage reduced，and the expression of IL-1β and TNF-α in hippocampus decreased（P＜0.05）in the electro-acupuncture group.Conclusion：Electro-acupuncture can improve learning and memory ability from cerebral ischemia/reperfusion（I/R）injury in rats，which may be related with reducing the damage and edema of neuron and inhibiting the expression of IL-1β and TNF-α in hippocampus.

Brain ischemia；Electro-acupuncture；Learning and memory；IL-1β；TNF-α

R285.5

A

1004-745X（2015）11-1891-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.11.004

2015-06-21）

·研究報告·

科技部國際科技合作項目（2011DFG33240）；福建省自然科學基金項目（2015J01335）；福建省康復技術協同創新中心資助項目（X2012004－協同）

（電子郵箱：cld@fjtcm.edu.cn）