復方中藥對急性冠脈綜合征患者雌激素受體基因與基質金屬蛋白酶-9基因甲基化水平的影響*

李楠宮麗鴻程修平

（1.遼寧中醫藥大學，遼寧沈陽110032；2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧沈陽110032）

·研究報告·

復方中藥對急性冠脈綜合征患者雌激素受體基因與基質金屬蛋白酶-9基因甲基化水平的影響*

李楠1宮麗鴻2△程修平1

（1.遼寧中醫藥大學，遼寧沈陽110032；2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧沈陽110032）

目的探討雌激素受體（ER）基因和基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）基因甲基化水平與急性冠脈綜合征（ACS）的關系，觀察經中西醫結合治療后的ACS患者（痰濁血瘀證）ER基因和MMP-9基因甲基化水平。方法將ACS（痰濁血瘀證）患者180例設為ACS組，另選健康正常人40例設為正常組。將ACS組患者隨機分為對照組90例和治療組90例，對照組給予PCI及西醫常規治療，治療組于PCI術后在西醫常規治療的基礎上給予中藥湯劑口服，療程為1個月，采用甲基化特異性聚合酶鏈反應（PCR）檢測ACS患者治療前后及健康人外周血細胞ER基因和MMP-9基因甲基化狀態，比較正常組與ACS組、對照組治療前后、治療組治療前后及治療組與對照組治療后ER基因和MMP-9基因甲基化水平。結果1）ACS組ER基因甲基化率明顯高于正常組（P＜0.01），MMP-9基因甲基化率明顯低于正常組（P＜0.05）；對照組與治療組經治療后其ER基因甲基化率均明顯低于治療前（P＜0.05），對照組與治療組經治療后其MMP-9基因基化率均明顯高于治療前（P＜0.05）；治療后治療組ER基因甲基化率低于對照組（P＜0.05）。結論ACS的發生可能與ER基因的高甲基化狀態和MMP-9基因的低甲基化狀態有關，復方中藥對ACS（痰濁血瘀證）患者MMP-9基因與ER基因甲基化水平的雙向調節可能是其發揮臨床效用的機制之一。

復方中藥痰濁血瘀急性冠脈綜合征ERMMP-9甲基化

急性冠脈綜合征（ACS）指急性心肌缺血引起的一組臨床癥候群，主要包括不穩定型心絞痛、急性心肌梗死。急性心肌梗死結合心電圖表現進一步分為ST段抬高型心肌梗死、非ST段抬高型心肌梗死。目前認為該病的發病是由多種因素所決定的。隨著分子生物學知識的飛躍進展，人們越來越認識到個體自身的遺傳因素對冠心病的易感性起著決定性的作用［1］。DNA甲基化這一基因表遺傳學修飾現象作為調節基因表達的重要機制逐漸被人們認識，修飾導致了動脈粥樣硬化相關基因表達異常，在動脈粥樣硬化發生發展中有重要作用。有研究報道在其發生過程中出現整體基因組的低甲基化和特殊基因的高甲基化共存現象［2］。

近年來，動脈粥樣硬化的中醫藥實驗研究主要集中于保護血管內皮、抑制血小板功能、抑制平滑肌細胞增殖、改善脂質代謝紊亂和脂質過氧化等方面。而中醫藥干預動脈粥樣硬化基因組甲基化水平的研究尚屬國內外研究空白。本實驗目的有二：一是明確DNA甲基化異常與ACS發病的關系；二是探索搜風祛痰方對冠心病動脈粥樣硬化相關基因甲基化水平的影響。現報告如下。

1　資料與方法

1.1病例選擇診斷標準：不穩定性心絞痛、非ST段抬高型心肌梗死、ST段抬高型心肌梗死診斷按照2007年美國心臟學會及美國心臟病協會（ACC/AHA）制定的診斷標準。中醫胸痹病名及證候診斷標準參照衛生部2002年制定發布的《中藥新藥臨床研究指導原則》及《中醫內科學》第6版教材相關證候診斷標準并做適當合并，辨證為痰濁血瘀證。納入標準：符合西醫急性冠脈綜合征的診斷標準；愿意接受本研究者；符合急性冠脈綜合征中醫痰濁血瘀、痰風內動證診斷標準。排除標準：不符合診斷標準者；合并有較嚴重的肝腎等器質性病變者；各種實體瘤及血液系統腫瘤患者（因腫瘤患者亦可能存在基因組甲基化水平的異常）；納入研究前使用過去甲基化藥物者；風濕性心臟病、甲亢性心臟病、心肌炎、心肌病等非冠狀動脈硬化性心臟病者；依從性差或因各種原因終止研究可能性大、不能完成研究流程者；病情危重，難以對本次實驗的有效性作出確切評價者。

1.2臨床資料收集曾就診于本院心內科西醫診斷為ACS、中醫診斷為胸痹心痛（痰濁血瘀證）的患者180例，經冠脈造影證實，結果冠脈狹窄≥50%為陽性，體檢中心正常人40例，做為本實驗的研究對象。

1.3主要試劑及實驗材料中藥湯劑的制備：將搜風祛痰方（全蝎10 g，蜈蚣2條，地龍15 g，陳皮15 g，法半夏15 g，白術15 g，水蛭15 g，金銀花10 g）按2000年版藥典中藥注射劑要求制成滅菌制劑，相當于生藥含量5 g/mL，由遼寧中醫藥大學附屬醫院制劑室提供。基因組DNA提取：全血基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶生產，貨號D1800，規格50 T/100 T）。基因組DNA甲基化修飾：甲基化DNA檢測試劑盒（Cat. No.CW2140，北京康為世紀提供）。甲基化特異性PCR：PCR引物合成由上海生工合成。

1.4方法1）基因組DNA提取。所有受試者空腹8 h后（急性心肌梗死患者在行急診冠脈介入治療前）留取肘靜脈血5 mL，按照全血基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶生產，貨號為D1800，規格為50T/100T）說明書進行操作：取200 μL血液樣本加入3倍體積的紅細胞裂解液中，充分顛倒混勻，12000 rpm離心1 min，吸去上清，沉淀應為白色或淡紅色，向沉淀中加入試劑充分混勻，反復離心、漂洗，得到高質量的基因組DNA樣品。將180例ACS患者隨機分為治療組與對照組。對照組在行PCI明確診斷后，給予西醫標準化治療（血小板抑制劑、ACEI及他汀類藥物等）；治療組在行PCI明確診斷后，在西醫標準化治療的基礎上，加用中藥水煎劑搜風祛痰方，日1劑，分3次口服。治療1個月后治療組與對照組再次留取肘靜脈血5 mL進行基因甲基化水平的檢測。2）基因組DNA修飾。取每份樣品約20 μL按照甲基化DNA檢測試劑盒（Cat.No.CW 2140，北京康為世紀）進行修飾。經DNA亞硫酸氫鹽轉變，回收得到大量DNA溶液，通過結合-洗滌-洗脫步驟，從甲基化修飾后的溶液中回收純化DNA，回收的純化DNA置于-20℃保存DNA溶液，用于后續PCR實驗。3）甲基化特異性PCR。首先從人類基因組數據庫（genebank）中查找ER和MMP-9啟動子及其上游全序列。根據文獻和數據庫分析其啟動子活性位點，應用專用工具軟件（Methyl Primer Express v1.0，Applied Biosystem公司）分析該序列的CpG島位點后，分析亞硫酸氫鈉修飾后的理論序列并設計如下引物，使其擴增區域包含其啟動子活性區域和5個CpG位點（見表1）。

表1　甲基化特異性PCR反應的引物序列

1.5統計學處理使用SPSS17.0統計軟件處理。率的比較運用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組ER基因甲基化水平比較ACS組外周血細胞中ER基因的甲基化率為65.5%，高于正常組的22.5%（P＜0.01）。治療組與對照組治療后ER基因的甲基化率分別為37.1%、51.7%，均低于治療前的66.7%、63.3%（P＜0.05），治療后組間差異有統計學意義（P＜0.05）。樣本中含有甲基化ER基因序列時，M擴增出產物，U未擴增出；反之，樣本上含有非甲基化ER基因序列時，U擴增出產物，M未擴增出，見圖1。

圖1　ER基因甲基化電泳圖

2.2各組MMP-9基因甲基化水平比較與正常組比較，ACS組外周血細胞中MMP-9基因的甲基化率為26.1%，明顯低于正常組的45.0%（P＜0.05）。治療組與對照組治療后MMP-9基因的甲基化率分別為42.2%、40.0%，均明顯高于治療前的26.7%、25.8%（P＜0.05），與對照組治療后比較，治療組治療后MMP-9基因的甲基化率略有升高，差異無統計學意義（P＞0.05）。樣本中含有甲基化MMP-9基因序列時，M擴增出產物，U未擴增出；反之，樣本上含有非甲基化MMP-9基因序列時，U擴增出產物，M未擴增出（見圖2）。

3　討論

大量的研究證明ER介導的血管保護作用包括直接保護作用與間接保護作用。直接保護作用于心血管系統上的ER，可促進一氧化氮合酶的合成，促進內皮細胞的生長，抑制血管平滑肌的增生，抑制血管的損傷，抑制巨噬細胞向動脈粥樣硬化病變處的聚集［3-8］。間接保護作用又分為作用于肝臟與肝外：作用于肝臟的RE調節載體蛋白A、B、D、E和脂蛋白（a）基因的表達，從而升高高密度脂蛋白，降低低密度脂蛋白，并且調節某些凝血因子和纖溶蛋白基因的表達，從而減低纖維蛋白原、抗凝血酶Ⅲ的濃度等；作用于肝臟外的ER調節腎素、血管緊張素轉化酶基因的表達，從而降低血中腎素和血管緊張素轉化酶的濃度［9］。根據大量的研究證據，人們認為MMP-9在動脈粥樣硬化發生發展中具有多重作用：促進平滑肌細胞遷移到內膜下形成粥樣斑塊，導致粥樣硬化斑塊的進展；降解細胞外基質和膠原，導致斑塊的不穩定和斑塊破裂；通過調節細胞外基質的代謝和降解參與了脂質儲留、鈣質沉著、內皮細胞和平滑肌細胞的生物學行為改變等［10］。在基因水平的調節機制研究中，DNA甲基化是近年該研究領域的重大進展之一，其在動脈粥樣硬化中的作用值得關注。DNA甲基化是指DNA復制后在CpG島序列內的5′胞嘧啶被甲基修飾，導致DNA結合蛋白與DNA主螺旋溝的結合能力降低，從而在不改變基因結構的基礎上抑制基因的轉錄，導致基因“沉默”［11］。其主要機制為：1）基因啟動子區域高度甲基化，使得基因轉錄因子不能結合到該區域；2）高甲基化區域的組蛋白乙酰化酶活性升高，改變了染色體結構，使其不易轉錄；3）甲基化的CpG島序列能募集結合有轉錄抑制作用的蛋白因子［2］。

圖2　MMP-9基因甲基化電泳圖

ACS屬于中醫學“胸痹”“真心痛”范疇。中醫學認為該病為本虛標實之證，本虛為心陽氣虛，標實為血瘀、痰濁。根據對ACS長期的臨床觀察及治療經驗，認為臨床中ACS主要以痰濁血瘀證為主要證型，其發病多與風、痰、瘀、虛密切相關，胸痹總屬陽微陰弦，因虛致痰，痰瘀交阻，郁而化熱生風，風挾痰瘀痹阻胸脈，發為胸痹。搜風祛痰方由全蝎、蜈蚣、地龍、陳皮、法半夏、白術、水蛭、金銀花組成，功善搜風祛痰，祛瘀通絡，用于治療ACS（痰濁血瘀證）。方中全蝎、蜈蚣息風止痙，活血化瘀，通絡止痛；地龍既可清熱息風，又能通絡止痙，共為君藥；陳皮、法半夏、白術燥濕化痰，理氣寬胸，消痞散結，共為臣藥；水蛭作為蟲類化瘀藥，破血力強而不傷新血，金銀花疏風清熱解毒，共為佐藥。

現代藥理研究表明，全蝎含蝎毒，一種類似蛇毒神經毒的蛋白質，蝎毒對血小板聚集功能的影響有助于減少斑塊形成，延緩動脈粥樣硬化進程［12］，另外全蝎提取液可通過促進纖溶、抑制血小板聚集而抑制血栓形成［13］；蜈蚣具有增強心肌抗氧化能力、降低血脂、改善血液流變學指標、調節脂代謝及保護心肌免受脂質過氧化損傷的作用，可保護血管內皮細胞免受損傷，有效防治動脈粥樣硬化的形成；地龍具有降血脂、抗菌、抗氧化、降壓、抗心律失常、抗凝血、溶血栓的作用，還具有解熱、抗炎、鎮痛、鎮靜、抗驚厥、止咳平喘、抗腫瘤、免疫調節、促進傷口愈合的作用［14］；水蛭具有抗凝、抗血栓、抗炎、抗腫瘤、抗癌和抗纖維化作用［15］；陳皮中黃酮類化合物具有抗動脈粥樣硬化、降低血清膽固醇、抑制血小板聚集、抗癌和抗氧化作用［16］；法半夏可阻止或延緩食餌性高脂血癥的形成，對高脂血癥有一定的治療作用，其中對降低總膽固醇和低密度脂蛋白的作用較顯著［17］；白術具有抑制脂肪形成、抑瘤，抗炎作用和芳香化酶抑制作用［18］；金銀花具有強大的降血脂作用，尤其針對血清膽固醇水平，并有弱的降糖作用。

實驗中ACS組ER基因甲基化率較正常組有明顯升高，治療后治療組與對照組ER基因的甲基化率較治療前均明顯降低，其中治療組ER基因甲基化率明顯低于對照組；ACS組MMP-9基因甲基化的率較正常組明顯降低，治療后治療組與對照組MMP-9基因的甲基化率較治療前均明顯升高，其中治療組與對照組的MMP-9基因甲基化率雖不具有統計學差異，但治療組甲基化率稍高于對照組。實驗結果表明ACS的發病可能與ER基因的高甲基化狀態和MMP-9基因的低甲基化狀態有關。搜風祛痰方可降低ACS患者的ER基因的甲基化率并且升高MMP-9基因的甲基化率，即對基因甲基化具有雙向調節作用，為中西醫結合治療ACS提供了新的作用靶點與科學依據。

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The Effect of Compound Chinese Medicine on Gene Methylation Level of ER Gene and MMP-9 Gene with ACS

LI Nan，GONG Lihong，CHENG Xiuping.
Liaoning University of TCM，Liaoning，Shenyang 110032，China

Objective：To study the relationship between the gene methylation level of estrogen receptor（ER），matrix metalloproteinase-9（MMP-9）and ACS，and observe the improvement of symptoms and the gene methylation level of ER and MMP-9 of combined treatment of traditional chinese and western medicine in treating ACS（phlegm and blood stasis type）.Methods：180 ACS patients diagnosed as phlegm and blood stasis type were selected as ACS group，40 normal people as the normal group.The 180 cases of ACS group were randomly divided into the control group（90 patients）and the treatment group（90 patients）.The control group took PCI and the routine western medicine（Platelet inhibitors，ACEI and Statins，ect.）.The treatment group were treated with Traditional Chinese Medicine.Treatment lasted for 1 months.MMP-9 and ER DNA methylation were detected before and after treatment in ACS patients and the normal group with methylation-specific PCR.The demethylation levels were compared among the normal group and ACS group，the control group before and after treatment，the treatment group before and after treatment，the treatment group and the control group after treatment.Results：Comparing with ACS group and the control group，there was the higher level of methylation rate of ER and the lower level of methylation rate of MMP-9 gene in the ACS patients，with statistical significance（P＜0.01）.The level of methylation rate of ER gene in both the control group and the treatment group after treatment were significantly lower than pre-treatment，with statistical significance（P＜0.05）.The levels of methylation rate of MMP-9 gene in both the control group and the treatment group after treatment were significantly higher than pre-treat-ment，with statistical significance（P＜0.05）.The methylation rate of ER gene of the treatment group after treatment was lower than that of the control group after treatment，with statistical significance（P＜0.05）.Conclusion：The incidence of ACS may be associated with its high methylation status of ER gene and low methylation status of MMP-9 gene.Its regulating effect of the combination of traditional Chinese and Western medicine on the gene methylation level of ACS patients（Phlegm and blood stasis type）may be one of the mechanism of clinical effect.

Compound Chinese medicine；Phlegm and Blood stasis；Acute coronary syndrome；ER；MMP-9；Methylation

R541.4

A

1004-745X（2015）10-1746-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.10.018

2015-06-19）

遼寧省沈陽市科技創新專項資金（F13-220-9-06）

（電子郵箱：linda1795@sina.com）