武漢地區(qū)黃瓜靶斑病病原鑒定及生物學(xué)特性研究

楊紹麗，吳仁鋒，馬曉龍，楊德枝

（武漢市蔬菜科學(xué)研究所，430065）

武漢地區(qū)黃瓜靶斑病病原鑒定及生物學(xué)特性研究

楊紹麗，吳仁鋒，馬曉龍，楊德枝

（武漢市蔬菜科學(xué)研究所，430065）

2011年7月在武漢黃陂發(fā)現(xiàn)黃瓜靶斑病，對(duì)病樣進(jìn)行分離、致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)鑒定，并對(duì)病原進(jìn)行了生物學(xué)特性研究。結(jié)果表明，引起武漢地區(qū)黃瓜靶斑病的病原菌為多主棒孢霉（）。這是多主棒孢霉在武漢引起黃瓜靶斑病的首次報(bào)道。生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，光照有利于病原菌菌絲生長(zhǎng)；病原菌菌絲生長(zhǎng)的適宜溫度范圍為25～30℃；最適宜pH值為6～9；病原菌能夠利用多種碳源和氮源，碳源以麥芽糖利用效果最好，氮源以硝酸鉀利用效果最好。

黃瓜；靶斑病；多主棒孢霉；生物學(xué)特性

1　材料與方法

1.1病樣采集及癥狀觀察

2011-2014年在武漢黃陂、蔡甸等蔬菜基地黃瓜上發(fā)現(xiàn)有疑似靶斑病癥狀，觀察記錄癥狀并拍照。

1.2病樣的分離

采用常規(guī)組織分離法［11］：取病斑典型的新鮮葉片，用無(wú)菌水沖洗干凈，切取病健交界處的組織，先用0.1%升汞消毒1～2 min，再用75%酒精消毒1 min左右，最后用無(wú)菌水沖洗3次，每次1 min。消毒完成后，吸干組織表面水分，再將可能被殺死的組織剪去，剪成小塊，每皿3～5塊，接在PDA平板上，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)。菌落形成后，選典型菌落轉(zhuǎn)接3次，進(jìn)行純化，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3致病性測(cè)定

1.4病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

通過(guò)柯赫氏法則驗(yàn)證，確定引起黃瓜靶斑病的病原。將供試菌株接種到PDA平板上，25℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)，測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑，描述菌落顏色、形態(tài)，挑取培養(yǎng)物，用顯微鏡觀察分生孢子器、分生孢子形態(tài)，測(cè)量其大小。

1.5病原菌生物學(xué)特性

①光照對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響在活化培養(yǎng)7 d的菌落邊緣，打取直徑6 mm的菌餅，接種于PDA平板中央。將接菌后培養(yǎng)皿置于 25℃HP250GS智能型人工氣候培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)。設(shè)置連續(xù)黑暗、12 h光暗交替、連續(xù)光照3個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

②不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響在活化培養(yǎng)7 d的菌落邊緣，打取直徑6 mm的菌餅，接種于PDA平板中央，將接菌后的培養(yǎng)皿分別置于5、10、15、20、25、30、35、40℃恒溫箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

③不同pH值對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響將PDA培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)節(jié)為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，制成不同pH值的平板，在平板中央接種6 mm的新鮮菌餅，3個(gè)重復(fù)，25℃恒溫暗培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

④不同碳、氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響以查氏培養(yǎng)基［11］為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。用含碳量相同的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、木糖、果糖、可溶性淀粉代替其中的蔗糖。用含氮量相同的尿素、硝酸鈉、硝酸銨、氯化銨、精氨酸代替其中的硝酸鉀。在活化培養(yǎng)7 d的菌落邊緣，打取直徑為6 mm的菌餅，接種在不同碳、氮源平板中央，3個(gè)重復(fù)，置于25℃恒溫箱培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

2　結(jié)果與分析

2.1黃瓜靶斑病田間癥狀及病原菌的分離培養(yǎng)

2011年7月在武漢黃陂武湖黃瓜展示田，發(fā)現(xiàn)黃瓜中下部葉片出現(xiàn)疑似靶斑病的癥狀。葉片發(fā)病初期為黃色水浸狀斑點(diǎn)、稍凹陷。發(fā)病中期病斑擴(kuò)大為近圓形、圓形或不規(guī)則形，灰白色，在圓形或近圓形病斑中央常會(huì)有淡黃色的小斑點(diǎn)（圖1A）。中后期多個(gè)病斑常連成片。該病常與霜霉病、細(xì)菌性角斑病混合發(fā)生，易與細(xì)菌性角斑病混淆。

陸九淵，字子靜，南宋初年人，生于公元1139年，逝于公元1193年。他曾講學(xué)于江西象山書(shū)院，世人稱(chēng)之為象山先生。陸九淵以其心學(xué)思想傳名于世，這種思想曾在南宋與朱熹的理學(xué)思想分庭抗禮，并在明代被王陽(yáng)明發(fā)揚(yáng)光大，成為中國(guó)傳統(tǒng)精神世界中不可忽視的一股力量。陸九淵的心學(xué)理論在今天的中國(guó)社會(huì)中仍然發(fā)揮著一定的作用。

圖1　黃瓜葉片接種15 d后發(fā)病癥狀

2011-2014年每年從發(fā)病嚴(yán)重的田塊，采集疑似靶斑病病樣標(biāo)本，對(duì)8份樣品進(jìn)行分離，均能分離出棒孢霉屬（sp.）真菌且形態(tài)一致。以2011年分離菌株HPbb為典型菌株進(jìn)行鑒定，本文中涉及到病原菌的所有試驗(yàn)，使用的均為該菌株。

2.2致病性測(cè)定

配制103～104個(gè)/mL的分生孢子懸浮液噴霧接種于20株2片真葉期黃瓜幼苗，結(jié)果表明，植株的發(fā)病率為100%。接種3 d后，零星有葉片出現(xiàn)水浸狀病斑，7 d后出現(xiàn)典型病斑，同田間發(fā)病癥狀（圖1A）一致，對(duì)照無(wú)癥狀（圖1B）。從發(fā)病葉片再次分離，獲得培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征與接種菌一致的分離物。

2.3病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

分離物在PDA培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)，菌落平、致密，呈輻射狀展開(kāi)，邊緣規(guī)則，氣生菌絲絨毛狀，顏色為灰色、褐色至灰黑色，5 d后菌落平均直徑46.7 mm（圖2A）。菌絲淡褐色，有隔膜，分枝。分生孢子梗淡褐色、直或彎曲、不分枝、具隔膜，分生孢子梗有層出現(xiàn)象，大小多為（90～210）μm×（3～5）μm。分生孢子淺褐色，壁平滑，倒棍棒形，頂端鈍圓，直或彎曲，具有假隔膜2～9個(gè)，大小（20～195.5）μm×（5～10）μm（圖2B），孢子幼時(shí)單生或串生（圖2C）。

通過(guò)對(duì)PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)形態(tài)、菌絲、分生孢子、分生孢子梗等形態(tài)的描述，這些特征與其他文獻(xiàn)［5，9，10，12～15］報(bào)道的關(guān)于黃瓜靶斑病多主棒孢菌的描述基本一致，確定引起武漢地區(qū)黃瓜靶斑病的病原為多主棒孢霉（）。

2.4病原菌生物學(xué)特性研究

①光照條件對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響由圖3可以看出，在連續(xù)黑暗、12 h光暗交替、連續(xù)光照3種條件下，病原菌在PDA平板上培養(yǎng)5 d后，連續(xù)光照條件下菌落平均直徑最大，達(dá)50.67 mm，說(shuō)明光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

②溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響由圖4結(jié)果可以看出，不同溫度下生長(zhǎng)5 d，病原菌菌落直徑差異顯著，說(shuō)明溫度對(duì)病菌的生長(zhǎng)影響很大。病原菌在10～35℃均能生長(zhǎng)，菌絲生長(zhǎng)最適溫度為25～30℃；30℃時(shí)，5 d菌落直徑最大，達(dá)51.0 mm；5℃以下及溫度達(dá)到40℃時(shí)，菌絲停止生長(zhǎng)。

圖2　病原菌的形態(tài)特征

圖3　光照對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響（5 d）

圖4　不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響（5 d）

圖5　不同pH值對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響（5 d）

③pH值對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響由圖5可以看出，PDA平板上，病原菌菌絲在pH值3～12時(shí)均可生長(zhǎng)，適宜生長(zhǎng)的pH值為6～9；其中pH值為8時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，5 d后菌落平均直徑51.83 mm。說(shuō)明該菌最適合在中性偏堿條件下生長(zhǎng)。

④碳、氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響由表1可以看出，病原菌能夠利用多種碳源和氮源，其中以麥芽糖作碳源最有利于菌絲生長(zhǎng)，5 d后菌落直徑達(dá)到47.17 mm，其次是乳糖，可溶性淀粉最差；以硝酸鉀作氮源最利于菌絲生長(zhǎng)，5 d后菌落直徑達(dá)到39.83 mm，氯化銨利用效果最差。

表1　不同碳、氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響（5 d）

3　討論與結(jié)論

經(jīng)病原菌的分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)鑒定以及致病性測(cè)定，引起武漢地區(qū)黃瓜靶斑病的病原為，為半知菌亞門(mén)多主棒孢霉，該病原形態(tài)與前人研究［3～5，9，14，15］描述的黃瓜靶斑病（褐斑病）病原形態(tài)基本一致。對(duì)病原菌生物學(xué)特性研究表明，黃瓜靶斑病菌在10～35℃下均能生長(zhǎng)，最適溫度為30℃，與前人研究［2，5，15，16］報(bào)道的基本一致；光照能促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，與劉鳴韜等［16］的報(bào)道一致；本研究中最適宜病原菌菌絲生長(zhǎng)的pH值為6～9，與鄒慶道等［15］的研究結(jié)果基本一致，而李長(zhǎng)松等［5］的研究結(jié)果中菌絲生長(zhǎng)最適宜pH值為5～8，說(shuō)明黃瓜靶斑病菌菌絲生長(zhǎng)在不同地區(qū)對(duì)pH值的要求不同。本研究中病原菌能夠利用多種碳、氮源，碳源以麥芽糖和乳糖效果最好，與劉鳴韜等［16］研究結(jié)果基本一致；在氮源利用上，以硝酸鉀作氮源最有利于菌絲生長(zhǎng)。以上研究結(jié)果表明，引起武漢地區(qū)黃瓜靶斑病的病原多主棒孢霉是一種耐高溫、最適宜中性弱堿環(huán)境生長(zhǎng)并能夠利用多種碳氮源的病原真菌。本研究結(jié)果為今后了解多主棒孢霉的侵染和靶斑病病害流行奠定了基礎(chǔ)，對(duì)其他因子以及分生孢子的生物學(xué)特性有待進(jìn)一步研究。

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Identification and Biological Characteristics of Pathogen of Cucumber Target Spot Caused by Corynespora cassiicola

YANG Shaoli，WU Renfeng，MA Xiaolong，YANG Dezhi

Cucumber target spot disease was observed in Huangpi of Wuhan in July 2011，then we studied the morphological characteristics，pathogenicity and biological characteristics of the isolated pathogen.The results showed that，the cucumber target spot was caused by，and the paper was the first report of the disease caused byin Wuhan.The biological characteristics of the pathogen showed that，illumination promoted the mycelial growth，and the optimum temperature and pH value were 25-30℃ and 6-9 for the mycelial growth.The pathogen could make use of various carbon and nitrogen sources，and maltose and potassium nitrate were best carbon source and nitrogen source for mycelial growth respectively.

Cucumber；Target spot；；Bio1ogical characteristics

S436.421

A

1001-3547（2015）04-0058-04

10.3865/j.issn.1001-3547.2015.04.021

武漢市農(nóng)科院科技創(chuàng)新項(xiàng)目［武農(nóng)科政（2014）5號(hào)］

楊紹麗，女，農(nóng)藝師，研究方向蔬菜病害診斷及綜合防控，E-mail：yangshaoli0123@163.com

吳仁鋒，男，通信作者，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事蔬菜病害診斷及綜合防控方面的研究，E-mail：wuhanwurenfeng@126.com

2014-12-23