楓香葉正丁醇提取物抑菌效果及其抗氧化活性研究

劉宏丁，劉亞敏，劉玉民，閻　聰，尚艷雙

（西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，西南大學(xué)三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715）

楓香葉正丁醇提取物抑菌效果及其抗氧化活性研究

劉宏丁，劉亞敏*，劉玉民，閻聰，尚艷雙

（西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，西南大學(xué)三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715）

采用打孔法測(cè)定抑菌圈大小和試管連續(xù)稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（MIC），研究了楓香葉正丁醇提取物抑菌效果，并測(cè)定其對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基的清除活性。結(jié)果表明：楓香葉正丁醇提取物對(duì)7種實(shí)驗(yàn)菌均有抑制作用，不同濃度間、不同菌種間存在極顯著（p＜0.01）差異；且對(duì)細(xì)菌的抑制作用強(qiáng)于真菌，對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌效果比革蘭氏陽性菌好；對(duì)大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、四聯(lián)球菌、黃曲霉、黑曲霉、青霉的MIC分別為3.1、12.5、12.5、6.25、12.5、25、12.5mg/mL。楓香葉正丁醇提取物具有較強(qiáng)的的抗氧化活性，可作為功能性食品資源開發(fā)利用。

楓香，提取物，抑菌活性，抗氧化活性

近來頻發(fā)的食品安全事件，使得食品安全問題日益凸顯，備受關(guān)注。化學(xué)食品添加劑存在的安全隱患，也讓人們對(duì)天然植物活性成分越來越重視［1］。使用安全、高效的天然食品添加劑，是人們的迫切需求。植物提取物是采用適當(dāng)?shù)姆椒ǎ灾参餅樵咸崛』蚣庸さ奈镔|(zhì)，具有抑菌、殺菌［2-5］、抗氧化及抗腫瘤［6-7］功效，目前已應(yīng)用于果蔬保鮮［8］、化妝品、飼料添加劑、獸藥和植物農(nóng)藥領(lǐng)域［9］。

楓香（Liquidambar formosana Hance）是金縷梅科（Hamamelidaceae）楓香屬（Liquidambar L）代表植物，產(chǎn)于秦嶺、淮河以南，至海南、西南、臺(tái)灣［10］。具有藥用［11］和觀賞價(jià)值，也是建筑、家具和膠合板等的理想材料，因此也被廣泛用作工業(yè)用材［12］。然而調(diào)查發(fā)現(xiàn)，用于工業(yè)木材的楓香主要是利用其主干和粗大側(cè)枝，而剩余細(xì)枝和葉則沒有得到合理利用。這不僅影響人們的生活環(huán)境，從資源的高效利用和經(jīng)濟(jì)的角度來看都是極不科學(xué)的。如何提高楓香的綜合利用，是亟待解決的問題。當(dāng)前也有研究表明楓香含有抑菌及抗氧化活性成分［13］。因此，本文選擇7種常見的對(duì)食品衛(wèi)生、臨床醫(yī)學(xué)和生物材料有較大影響的菌種，研究楓香葉正丁醇提取物對(duì)7種菌的抑菌作用及抗氧化效果，旨在為楓香的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為楓香的綜合開發(fā)利用開闊思路。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

楓香葉于2012年9月采自北碚茅庵林場(chǎng)幼年樹，經(jīng)西南大學(xué)林學(xué)教研室鑒定為楓香（Liquidambar formosana Hance）的葉；G-：大腸桿菌（Escherichia coli），G+：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草桿菌（Bacillus subtilis）、四聯(lián)球菌（Micrococcus tetragenus），真菌：青霉（Penicillium oxalicum.）、黃曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus niger）均由西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（培養(yǎng)細(xì)菌） 牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl 5g，蒸餾水500mL，瓊脂15～20g，調(diào)節(jié)pH至7.4～7.6（用NaOH調(diào)節(jié)），然后121℃蒸汽滅菌30min；馬鈴薯培養(yǎng)基（培養(yǎng)真菌）取去皮馬鈴薯20g，切成小塊，在鍋中加水500mL煮沸30min，用雙層紗布過濾，取其濾液，加入蔗糖（或葡萄糖）2g，加瓊脂15g，用蒸餾水定容到500mL，pH自然，121℃蒸汽滅菌30min；VC、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、鐵氰化鉀、鄰二氮菲、三氯化鐵分析純。

超凈工作臺(tái)吳江市凈化設(shè)備廠；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱上海將任實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HY-B大容振蕩器金壇市國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠；DHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱北京恒泰豐科實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；WFH-204紫外分析儀上海精密儀器儀表有限公司；T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TGL-16G恰菲爾高速離心機(jī)上海恰菲爾分析儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1提取物的制備新鮮葉子經(jīng)殺青后烘干粉碎備用，精確稱取楓香葉粉末1kg，以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇超聲波提取50min，提取三次合并濾液，提取液依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓濃縮蒸干溶劑，得到正丁醇相浸膏。

1.2.2菌懸液的制備將供試菌株于斜面培養(yǎng)基上活化，采用試管連續(xù)稀釋法，用無菌水將菌和孢子稀釋為107～108cfu/mL的菌懸液，在臺(tái)式振蕩器中振蕩10min后備用。

1.2.3藥液制備取楓香葉正丁醇提取物浸膏0.01、0.03、0.05g，分別溶于1mL二甲基甲酰胺（DMF）中制備成不同濃度的藥液。用于抑菌圈的測(cè)定。

總而言之，GPS系統(tǒng)具有數(shù)據(jù)測(cè)量的高效性、準(zhǔn)確性和科學(xué)性，減少了工作流程中浪費(fèi)的大量人力、財(cái)力、物力。現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)了GPS技術(shù)和地理信息系統(tǒng)的結(jié)合，二者的應(yīng)用也為人們的工作和生活帶來了極大的便利。在未來的日子里，研究人員還要不斷完善GPS技術(shù)，為各行業(yè)提供準(zhǔn)確有效的數(shù)據(jù)支持。

取正丁醇提取物浸膏各0.1g，溶于1mL DMF中，作為原液，以牛肉膏液體培養(yǎng)基（真菌用馬鈴薯液體培養(yǎng)基）倍比稀釋成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128各7個(gè)濃度，即含原液濃度分別為50、25、12.5、6.25、3.1、1.5、0.75mg/mL，用于測(cè)定最低抑菌濃度（MIC）。

1.2.4含菌平板制備將新鮮配制的培養(yǎng)基在121℃條件下滅菌30min，當(dāng)培養(yǎng)基冷至50～60℃時(shí)，于超凈工作臺(tái)上將培養(yǎng)基倒入經(jīng)過干熱滅菌的培養(yǎng)皿中，每皿15～20mL的培養(yǎng)基，待平板冷卻后，每皿中加入0.3mL菌懸液，用三角玻璃棒均勻涂成薄板備用。

1.2.5抑菌圈的測(cè)定［14］打孔器法：將滅菌后冷卻至50～60℃的牛肉膏培養(yǎng)基（細(xì)菌）和馬鈴薯培養(yǎng)基（霉菌）倒平板，待培養(yǎng)基凝固后，將各菌種配制的菌懸液加入到平板中制成含菌平板，然后在各平板內(nèi)打孔，每個(gè)平板打四個(gè)孔（三個(gè)為藥物平行，一個(gè)為DMF空白對(duì)照），按照編號(hào)加入樣品。細(xì)菌37℃培養(yǎng)24h，霉菌28℃培養(yǎng)48h后，測(cè)定抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈直徑大小確定抑菌效果。

1.2.6最低抑菌濃度的測(cè)定［14］采用試管稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度，向各管制備好的藥液中加入事先制備好的菌懸液40μL，混勻后放于37℃（霉菌28℃）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。然后分別從每一試管取一接種環(huán)液體點(diǎn)于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中，培養(yǎng)24h（霉菌培養(yǎng)48h）后確定是否有菌生長(zhǎng)。以確定藥物抑制待測(cè)菌生長(zhǎng)的MIC值。每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)平行管，并分別設(shè)不含萃取液的牛肉膏液體培養(yǎng)基（霉菌用馬鈴薯液體培養(yǎng)基）為對(duì)照管。

1.2.7清除DPPH自由基的測(cè)定方法［15］將楓香葉正丁醇提取物稀釋成（0.001～0.4mg/mL）的濃度梯度，分別取2mL上述濃度梯度的提取物溶液于試管中，再向其加入4.0mL濃度為0.004mg/mL的DPPH乙醇溶液（1mg的DPPH粉末乙醇定容于250mL棕色容量瓶中），搖勻，于28℃水浴鍋中水浴恒溫30min，然后在517nm下迅速測(cè)其吸光度記為A1，同時(shí)測(cè)定不含提取物的空白樣品記為A0。

DPPH清除率E計(jì)算公式為：

式中：A1為試樣的吸光度；A0為空白樣品的吸光度。

式中：A1為黃酮吸光度；A0為空白吸光度。

1.2.9清除羥自由基（·OH）的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)［17-18］方法，楓香葉正丁醇提取物質(zhì)量濃度為0.3～1.5mg/mL，以二次蒸餾水定容至刻度后，在37℃水浴中恒溫60min，于536nm處測(cè)定吸光度，以上每加1次試劑均需搖勻，同時(shí)測(cè)定不含提取物的空白樣品，作自由基清除率-濃度圖。

·OH清除率E計(jì)算公式為：

E（%）=（A樣－A損）/（A未損－A損）×100

式中：A樣為加樣液的吸光度；A損為樣液用溶劑代替的吸光度；A未損為不加樣液和H2O2的吸光度（三者均以蒸餾水空白為參比）。

1.3數(shù)據(jù)處理

提取物抑菌圈直徑采用十字交叉法測(cè)定。所有指標(biāo)測(cè)定均重復(fù)三次，數(shù)據(jù)均采用Excel做統(tǒng)計(jì)分析，采用SPSS 17.0做方差分析和多重比較。

2　結(jié)果與分析

2.1楓香葉正丁醇提取物抑菌活性

采用打孔法測(cè)定楓香葉正丁醇提取物抑菌活性，結(jié)果見表1所示：楓香葉正丁醇提取物三個(gè)濃度對(duì)各菌種均有抑制效果，且與抑菌效果存在量效關(guān)系，其中以0.05g/mL濃度對(duì)大腸桿菌的抑制效果最好，抑菌圈達(dá)到了22.5mm，而0.01g/mL濃度對(duì)黑曲霉的抑制效果最差，只有1.2mm。整體而言，對(duì)細(xì)菌的抑制作用要明顯強(qiáng)于真菌，這與侯美珍等［19］對(duì)紫草正丁醇提取物的研究結(jié)果一致。在細(xì)菌中，對(duì)革蘭氏陰性菌中的大腸桿菌抑制效果要優(yōu)于三種革蘭氏陽性菌，與侯美珍等［19］的研究結(jié)果相反，這可能是因?yàn)椴煌参锾崛〉幕钚猿煞植煌?duì)革蘭氏陰性菌與陽性菌抑制效果的差異可能是二者的細(xì)胞壁在結(jié)構(gòu)和化學(xué)組分上的差異而導(dǎo)致，其具體的原因還有待進(jìn)一步研究。經(jīng)方差分析（表2）可知，楓香葉正丁醇提取物對(duì)不同菌種抑菌效果及不同濃度提取物的抑菌活性都存在極顯著差異（p＜0.01），菌種與正丁醇提取物濃度的交互影響差異顯著（p＜0.05）。

2.2楓香葉正丁醇提取物的最小抑菌濃度

采用試管連續(xù)稀釋法測(cè)定楓香葉正丁醇提取物最小抑菌濃度（表3），其結(jié)果與抑菌活性測(cè)定結(jié)果相符。由表3可知，提取物的濃度對(duì)大腸桿菌的影響較小，僅3.1mg/mL就能夠抑制其生長(zhǎng)，而對(duì)于真菌中的黑曲霉，提取物濃度對(duì)其影響較大，其MIC為25mg/mL，其余菌種MIC均低于12.5mg/mL。對(duì)照對(duì)各菌皆無抑制作用，排除了溶劑的干擾。其中，枯草桿菌、金黃色葡萄球菌測(cè)定結(jié)果與侯美珍等［19］的研究有較大差異，而與趙愛云等［16］的研究結(jié)果接近，這可能是因?yàn)橹参镏谢钚猿煞值牟町愐鸬摹?/p>

表1　楓香葉正丁醇提取物抑菌活性測(cè)定結(jié)果Table 1　Antimicrobial activity of the N-butanol extract of Liquidambar formosana Hance leaves

表2　對(duì)楓香葉正丁醇提取物抑菌效果的方差分析表Table 2　Variance analysis about antimicrobial activity of the N-butanol extract of Liquidambar formosana Hance leaves

表3　楓香葉正丁醇提取物最小抑菌濃度測(cè)定結(jié)果Table 3　The results of MIC of the N-butanol extract of Liquidambar formosana Hance leaves

圖1　楓香葉正丁醇提取物對(duì)DPPH·的清除率Fig.1　DPPH·scavenging rate of the N-butanol extract of Liquidambar formosana Hance leaves

2.3楓香葉正丁醇提物對(duì)DPPH·的清除活性

采用DPPH法用于評(píng)價(jià)楓香葉正丁醇提取物清除自由基的能力，結(jié)果見圖1，楓香葉正丁醇提取物與VC均對(duì)DPPH·表現(xiàn)出很好的清除效果，正丁醇提取物的質(zhì)量濃度與DPPH·的清除活性呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。在質(zhì)量濃度小于0.3mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·的清除活性明顯增強(qiáng)，此后隨著質(zhì)量濃度的增加，DPPH·的清除活性增強(qiáng)變緩慢。在質(zhì)量濃度小于0.3mg/mL時(shí)，正丁醇與VC的DPPH·的清除活性差異明顯，而當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.4mg/mL時(shí)，正丁醇提取物的清除率達(dá)到92.07%，與VC清除率差異不明顯。說明楓香葉正丁醇提取物達(dá)到一定質(zhì)量濃度后，其對(duì)DPPH·的清除效果與VC相似。

2.4楓香葉正丁醇提物對(duì)O2-·的清除活性

結(jié)果如圖2所示，楓香葉正丁醇提取物與VC均對(duì)O2-·表現(xiàn)出一定的清除活性，二者的清除率隨質(zhì)量濃度增加而遞增的趨勢(shì)基本一致。當(dāng)質(zhì)量濃度小于0.1mg/mL時(shí)，二者對(duì)O2-·的清除率大小十分接近，清除效果明顯增強(qiáng)。而當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.1mg/mL時(shí)，正丁醇提取物的清除率要高于VC，但清除效果增強(qiáng)緩慢。說明楓香葉正丁醇提取物中可能含有與VC相似的活性成分。通過圖2可以發(fā)現(xiàn)，正丁醇提取物具有較強(qiáng)的O2-·清除活性，對(duì)O2-·清除活性的最佳質(zhì)量濃度在0.2～0.3mg/mL之間。

圖2　楓香葉正丁醇提取物對(duì)O2-·的清除率Fig.2　O2-·scavenging rate of the N-butanol extract of Liquidambar formosana Hance leaves

2.5楓香葉正丁醇提物對(duì)·OH的清除活性

結(jié)果如圖3所示，楓香葉正丁醇提取物表現(xiàn)出一定程度的清除·OH的能力，并且存在明顯的量效關(guān)系。其清除率隨質(zhì)量濃度遞增的趨勢(shì)與VC基本一致，在各個(gè)濃度下清除率都稍低于VC，但差異并不大，說明楓香葉正丁醇提取物對(duì)·OH的清除率要比VC稍弱。

圖3　楓香葉正丁醇提取物對(duì)·OH的清除率Fig.3·OH scavenging rate of the N-butanol extract of Liquidambar formosana Hance leaves

3　結(jié)論

通過對(duì)楓香葉正丁醇提取物抑菌活性的研究，發(fā)現(xiàn)其各個(gè)濃度梯度對(duì)7種受試菌均有一定的抑制作用，且存在顯著性差異。其中，對(duì)細(xì)菌的抑制作用要明顯強(qiáng)于真菌，對(duì)革蘭氏陰性菌中的大腸桿菌抑制效果要優(yōu)于三種革蘭氏陽性菌。楓香葉正丁醇提取物對(duì)大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、四聯(lián)球菌、黃曲霉、黑曲霉、青霉的MIC分別為3.1、12.5、12.5、6.25、12.5、25、12.5mg/mL。但關(guān)于楓香葉正丁醇提取物對(duì)各菌的抑制機(jī)理還不清楚，后期將做進(jìn)一步的研究。

本研究結(jié)果表明，楓香葉正丁醇提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其清除自由基能力與VC相似。但由于提取物中活性成分較多，具體是何種成分起到抗氧化作用，還有待進(jìn)一步的研究。

楓香葉來源便利，但當(dāng)前利用率不高，其正丁醇提取物對(duì)食品中常見微生物都具有較好的抑制效果，同時(shí)也具有較強(qiáng)的抗氧化活性，在食品安全、醫(yī)藥衛(wèi)生方面具有較大的開發(fā)潛力，可以作為新的抗菌、抗氧化藥源。本研究可為楓香的進(jìn)一步開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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In vitro antioxidant and antimicrobial activity of N-butanol extract from Liquidambar formosana Hance leaves

LIU Hong-ding，LIU Ya-min*，LIU Yu-min，YAN Cong，SHANG Yan-shuang
（Key Laboratory of the Three Gorges Reservoir Region’s Eco-environments，Ministry of Education，College of Resources and Environment，Southwest University，Chongqing 400715，China）

To explore antioxidant activity and inhibitory effect of N-butanol extract from Liquidambar formosana Hance leaves，in this test determine the size of the inhibition zone using drilling method and the minimum inhibitory concentrations（MIC）with tubes serial dilution method，then detect and evaluate its antioxidation activities by scavenging activity to DPPH·，superoxide anion（O2-·）and hydroxyl（·OH）free radicals.Results showed that N-butanol extract from Liquidambar formosana Hance leaves had inhibition to seven kinds of tested bacterias and significant differences among different concentrations and different strains.In addition，the inhibition of bacterial was stronger than fungal as well as the antibacterial effect on Gram-negative bacteria was better than Gram-positive bacteria.The MIC of Escherichia coli，Bacillus subtilis，Staphylococcus aureus，Micrococcus tetragenus，Aspergillus flavus，Aspergillus niger，Penicillium oxalicum were 3.1，12.5，12.5，6.25，12.5，25，12.5mg/mL，respectively.The results also showed that the extract from Liquidambar formosana Hance leaves，which had strong antioxidant activities，could be developed as a functional food resource.

Liquidambar formosana Hance；extracts；antimicrobial activity；antioxidant activity

TS201.3

A

1002-0306（2015）12-0087-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.010

2014－07－21

劉宏丁（1989-），男，碩士研究生，研究方向：植物資源開發(fā)利用。

劉亞敏（1976-），女，碩士，副教授，研究方向：植物資源開發(fā)利用。

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31170546）。