油菜蜂花粉黃酮體外降糖活性研究

孫　　巖，郭慶興，童群義，*

（1.江南大學食品學院，江蘇無錫214122；2.百威英博（佛山）啤酒有限公司，廣東佛山528100）

油菜蜂花粉黃酮體外降糖活性研究

孫巖1，郭慶興2，童群義1，*

（1.江南大學食品學院，江蘇無錫214122；2.百威英博（佛山）啤酒有限公司，廣東佛山528100）

以總黃酮含量為考察指標，利用溶劑萃取和大孔樹脂對油菜蜂花粉乙醇提取物進行分離純化，富集黃酮，然后對不同極性組分進行抑制α-葡萄糖苷酶實驗，并利用紅外光譜（IR）和液-質聯用（LC-MS）對體外降糖活性最高的組分進行化學成分分析。結果表明，黃酮類物質在抑制α-葡萄糖苷酶活性中起主要作用；AB-8大孔樹脂純化得到的PEFS-3組分總黃酮含量為68.77%，IC50為72.16μg/mL，遠小于阿卡波糖的IC50（1124.86μg/mL），表明其抑制效果強于阿卡波糖；PEFS-3組分中共鑒定出5種主要物質，其中4種為槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-（1→2）-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山奈酚-3，4’-雙-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷，第5種推斷為亥茅酚苷或黃烷醇，具體結果還需進一步研究。

油菜蜂花粉，α-葡萄糖苷酶，黃酮，液-質聯用

α-葡萄糖苷酶是影響飲食中碳水化合物消化和吸收的關鍵酶，抑制其活性可以延緩人體對碳水化合物的降解及葡萄糖的吸收，從而抑制餐后血糖的快速升高。因此，α-葡萄糖苷酶抑制劑常被用于治療Ⅱ型糖尿病，可有效降低餐后血糖水平和減少糖尿病并發癥的發生。糖尿病尚無理想的治療方法，傳統磺酰脲類和雙胍類降糖藥，長期食用會產生依賴性和毒副作用［1］。所以，從天然產物中尋找高效的α-葡萄糖苷酶抑制劑成為近年的研究熱點，且已報道天然產物如柑橘皮、甘草、桑葉、地榆、胡柚、降香、普洱茶、苦瓜、銀杏等大多富含黃酮、多酚、多糖等成分［2-9］。

油菜蜂花粉素有“完全營養庫”之稱，富含豐富的黃酮、多酚、多糖、多肽、核酸等活性成分，有多種藥用價值，能夠增強免疫力、抗氧化、抗輻射、降血糖等［10-11］。但鮮有關于油菜蜂花粉黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制作用的報道。本文以油菜蜂花粉乙醇提取物不同極性組分進行抑制α-葡萄糖苷酶實驗，旨在研究其體外降糖作用，并應用IR和LC-MS對體外降糖活性最高的組分進行鑒定，明確油菜蜂花粉黃酮中體外降糖的主要化學成分，為尋找更好的α-葡萄糖苷酶抑制劑提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

油菜蜂花粉烘干粉碎，過100目篩，低溫保藏，江蘇省慶緣康生物科技有限公司提供；蘆丁標準品，≥98%，阿拉丁試劑有限公司；無水乙醇、石油醚（30～60℃）、Al（NO3）3、NaNO2、NaOH、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、Na2CO3分析純，國藥試劑有限公司；α-葡萄糖苷酶G-5003 100UN，4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG） Sigma公司；阿卡波糖（“拜糖平”批號H19990205） 德國拜耳公司。

CW-2000型超聲-微波協同萃取儀超聲波固定頻率40kHz，功率50W，上海新拓分析儀器科技有限公司；UV-2100型紫外可見分光光度計尤尼柯（上海）儀器有限公司；AB104-N型電子天平Mettler-ToledoInstr（ShangHai）Ltd；FA1004型電子天平上海天平儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）型循環水式真空泵鞏義市予華儀器有限責任公司；FW-80-I型高速萬能粉碎機天津泰斯特儀器有限公司；101-2-BS型電熱恒溫鼓風干燥箱上海躍進醫療器械廠；HHS型電熱恒溫水浴鍋上海博訊實業有限公司醫療設備廠；ES-2030型冷凍干燥儀日立公司。

1.2實驗方法

1.2.1蘆丁標準曲線的繪制參照中國藥典［12］描述的方法并加以改進測定總黃酮含量。準確稱取蘆丁標準品30.00mg，用無水乙醇溶解，50W條件下超聲10min使其完全溶解，然后轉移入100mL容量瓶，用無水乙醇定容至刻度線，配制成0.3000mg/mL的蘆丁標準溶液。分別取0、1、2、3、4、5mL蘆丁標準溶液，依次加入0～5號25mL容量瓶中，并用蒸餾水補足體積到6mL；加入1mL 5.0%NaNO2，搖勻，靜置6min；然后加入1mL 10%Al（NO3）3，搖勻，靜置6min；再加入10mL 4.0%NaOH，用50%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置10min；于510nm下測定吸光值。

1.2.2黃酮的制備及純化稱取2kg過篩的油菜蜂花粉，用超聲-微波協同萃取法［13］提取黃酮類物質，過濾提取液，減壓濃縮得浸膏，加適量蒸餾水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶液萃取，直至有機溶劑層無色，收集有機溶劑層溶液，分別減壓濃縮得浸膏，然后加適量水配制成適宜濃度，用AB-8大孔吸附樹脂進行純化，先用去離子水洗脫至流出液無色，再依次用20%、35%、55%、75%、95%的乙醇進行洗脫，分別收集每個梯度的洗脫液，減壓濃縮，然后再反復上樣，梯度洗脫，最終得20%、35%、55%、75%、95%乙醇洗脫層，減壓濃縮得浸膏，分別命名為PEFS-1組分、PEFS-2組分、PEFS-3組分、PEFS-4組分和PEFS-5組分，冷藏備用。

1.2.3黃酮含量的測定按1.2.1方法分別測定石油醚萃余層、乙酸乙酯層、正丁醇層、剩余水層、PEFS-1組分、PEFS-2組分、PEFS-3組分、PEFS-4和PEFS-5組分總黃酮濃度，并取適量溶液依照GB 5009.3-2010［14］測定固體物質干重，并按下式計算提取得到的總黃酮含量。

式中：C—測得提取液濃度，mg/mL；V—干燥提取液體積，mL；M—干燥后樣品質量，g。

1.2.4黃酮對α-葡萄糖苷酶活性的影響在蘇堯堯［15］的基礎上稍做修改，具體方法如下：在一定量0.1mol/L pH6.8的磷酸鉀緩沖液中，加入100μL待測樣品溶液和100μL的0.5U/mL的α-葡萄糖苷酶（溶解于0.1mol/L pH6.8的磷酸鉀緩沖液），混勻后在37℃預熱5min，然后加入100μL 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（20mmol/L，溶解于0.1mol/L pH6.8的磷酸鉀緩沖液），混勻后在37℃反應10min，加入0.1mol/L Na2CO3溶液5mL終止反應，用分光光度計測定反應液在410nm處的吸光值。用等量的0.1mol/L pH6.8的磷酸鉀緩沖液代替α-葡萄糖苷酶溶液作為背景組。同時以阿卡波糖作陽性參照物。每個樣品做3個平行，取平均值，計算抑制率。

式中：A空白為不加待測樣品反應后的吸收值；A樣品為加入待測樣品反應后的吸收值；A背景為只加待測樣品的吸收值。

1.2.5黃酮類物質的IR檢測將以上制備PEFS-3組分，經冷凍干燥后取少量于瑪瑙研缽中，加入適量溴化鉀，研磨至細后壓片。把壓好的透明薄片放入紅外光譜儀中，在400～4000cm-1范圍內掃描，記錄PEFS-3組分的紅外吸收光譜。

1.2.6黃酮類物質的LC-MS檢測取適量經冷凍干燥的PEFS-3組分，用色譜純甲醇溶解，再用0.45μm微孔濾膜過濾，制成澄清透明的液體，用于LC-MS分析。

色譜條件：流速0.3mL/min；進樣體積：0.3μL；檢測波長：200～400nm；色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH Shield RP C18柱（100mm×2.1mm，1.7μm）；柱溫：45℃；樣品溫度20℃；流動相：乙腈/0.1%甲酸；梯度洗脫：0～8min，乙腈10%～60%；8～15min，60%～100%。

質譜條件：離子源：ESI電離源；電噴霧離子化負離子采集模式（ESI-）；m/z范圍：50～1000；毛細管電壓：3.0kV；錐孔電壓：20.0V；碰撞能量：4.0eV，離子源溫度：100℃；脫溶劑溫度：400℃。

2　結果與討論

2.1蘆丁標準曲線的繪制

以蘆丁溶液濃度為橫坐標x，吸光值為縱坐標y，繪制標準曲線。標準曲線為：y=11.4572x-0.0023，R2= 0.9995。

2.2黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

通過實驗結果表1可知，使用不同極性的溶劑分級萃取提取液，隨著萃取溶劑極性變大，黃酮類化合物的含量逐漸升高，但對α-葡萄糖苷酶的抑制作用無明顯規律，可能是因為樣品中總黃酮含量較低，其中富含的多糖、皂苷等也起到了一定的作用。其中，正丁醇層的總黃酮含量最高，可知使用正丁醇能充分地富集油菜蜂花粉中的黃酮類化合物。

樣品經AB-8大孔吸附樹脂進行純化后，得到的PEFS-1組分、PEFS-2組分、PEFS-3組分總黃酮含量明顯提高，并且對α-葡萄糖苷酶的抑制程度與各組分總黃酮含量呈正相關，因此，可認為當油菜蜂花粉提取分離物中總黃酮含量達到一定程度后，對α-葡萄糖苷酶起到主要抑制作用的活性因子為黃酮類物質。PEFS-3組分含量為68.77%，IC50為72.16μg/mL，遠小于阿卡波糖的IC50（1124.84μg/mL），表明其抑制效果強于阿卡波糖。

表1　不同含量的黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Table 1　The inhibitory effect of flavonoids in different purity on α-glucosidase

2.3黃酮類物質的IR檢測

圖1　黃酮的紅外光譜圖Fig.1　IR Spectrum of flavonoids

由圖1可知，3422.83cm-1處寬而強的吸收峰是黃酮類物質中酚羥基或者雜質糖中的羥基的伸縮振動峰，信號值較強說明羥基數目較多；2927.80cm-1處的弱吸收峰是芳環上碳氫鍵的伸縮振動峰，信號值較弱表明飽和碳上的氫較少；1646.65cm-1處出現羰基的特征吸收峰，這是由于其伸縮振動引起的，信號值強說明伸縮振動較強；1384.36、1155.99、1080.68、1021.51cm-1是碳氧鍵的伸縮振動峰，信號值較強；1000～600cm-1之間的峰是苯環上取代基位置引起的特征吸收峰［16-18］。

2.4黃酮類物質的LC-MS檢測

黃酮類化合物是具有兩個苯環（A-環與B-環）通過中央三碳相互連接而成的C6-C3-C6基本結構的天然產物。由于它們的結構特點使得多數黃酮類化合物在紫外區300～350nm和240～285nm有兩個特征吸收峰［17-18］。如圖2和圖3所示，經AB-8純化的提取液主要含有5種化合物，前4種化合物在284nm和350nm處都有特征吸收峰，可能為黃酮類物質，第5種化合物僅在284nm處有特征吸收峰，可能是異黃酮或二氫黃酮（醇）。

圖2　PEFS-3組分的液相圖Fig.2　HPLC diagram of PEFS-3

圖3　PEFS-3組分在284nm（a）和350nm（b）處的液相圖Fig.3　HPLC diagram PEFS-3 at 284nm（a）and 350nm（b）

實驗利用飛行時間質譜對液相色譜圖中出峰的5種主要物質進行了研究，分別得到其1、2級質譜圖（圖4～圖8）。其化合物1～4的MS圖中分子離子峰及特征峰明顯，主要是分子離子丟失1個和2個葡萄糖的碎片離子峰，根據阿布拉江·克依木［19］、郭娟麗［20］及本課題組之前的研究報告［13］，分析結果如表2所示。

對于化合物5，1級質譜給出準分子離子峰［M-2H］－436.1814，可知該化合物的分子量為438；2級質譜給出［M-2H］－丟失1個葡萄糖的碎片離子峰［（M-3H）-162］－273.1564，推斷可能為亥茅酚苷［21-23］或黃烷醇［17］。楊潔［24］、邢建軍等［25］也曾從油菜蜂花粉中提取得到該物質，推斷為黃酮苷類，并未做出具體判斷。目前也鮮有關于從油菜蜂花粉中分離得到亥茅酚苷的報道，具體結果有待進一步研究。

表2　樣品的質譜分析結果Table 2　Analysis results of the sample obtained by MS

圖4　化合物1的質譜圖及結構式Fig.4　The mass spectrum and structural formula of compound 1

圖5　化合物2的質譜圖及結構式Fig.5　The mass spectrum and structural formula of compound 2

圖6　化合物3的質譜圖及結構式Fig.6　The mass spectrum and structural formula of compound 3

圖7　化合物4的質譜圖及結構式Fig.7　The mass spectrum and structural formula of compound 4

圖8　化合物5的質譜圖及結構式Fig.8　The mass spectrum and structural formula of compound 5

3　結論

結果表明，正丁醇對油菜蜂花粉黃酮有很好的富集作用；當油菜蜂花粉總黃酮含量達到一定值后，黃酮類物質在抑制α-葡萄糖苷酶活性中起主要作用；AB-8大孔樹脂純化得到的PEFS-3組分總黃酮含量為68.77%，IC50為72.16μg/mL，遠小于阿卡波糖的IC50，表明其抑制效果強于阿卡波糖。

利用IR和LC-MS對PEFS-3組分的化學成分進行分析，共推斷出5種主要物質，其中4種為槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-（1→2）-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山奈酚-3，4’-雙-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷，第5種推斷為亥茅酚苷或黃烷醇，因目前還未見關于從油菜蜂花粉中分離得到亥茅酚苷或符合該質譜裂解規律的黃烷醇的報道，具體結果還有待進一步研究。

［1］肖更生，萬利秀，徐玉娟，等.柑橘皮黃酮降血糖作用的研究［J］.現代食品科技，2013，29（4）：698-799.

［2］孫佳明，宗穎，雷岱虹，等.甘草乙醇提取物的體外抑制α-葡萄糖、抗氧化活性及HPLC-MS分析［J］.中成藥，2013，35（9）：1943-1946.

［3］羅明琽.桑葉有效部位降血糖作用與JNK信號通路的關系［D］.廣州：廣州中醫藥大學，2013.

［4］陳麗華，潘自紅，曹云麗，等.地榆中α-葡萄糖苷酶抑制活性因子的篩選［J］.食品研究與開發，2013，34（9）：30-36.

［5］張俊，何靜，周錦云，等.胡柚中抑制α-葡萄糖苷酶活性組分的研究［J］.中國食品學報，2013，13（2）：79-82.

［6］崔秀月.降香乙酸乙酯部分黃酮化學成分及抑制α-葡萄糖苷酶活性研究［D］.長春：吉林大學，2013.

［7］陳浩.普洱茶多糖降血糖及抗氧化作用研究［D］.杭州：浙江大學，2013.

［8］常怡.苦瓜功能成分制備及降糖效果研究［D］.長沙：湖南農業大學，2012.

［9］劉洋，周慧，劉舒，等.銀杏葉中α-葡萄糖苷酶抑制劑的超濾質譜篩選［J］.高等學校化學學報，2013，34（4）：813-818.

［10］郭雪微，盧梃，鮑艷江，等.油菜蜂花粉黃酮類化合物抗氧化等作用的臨床觀察［J］.北京中醫藥，2011，30（7）：488-509.

［11］楊開.蜂花粉成分分析、功能物質提取和體外活性研究［D］.杭州：浙江大學，2011.

［12］中國藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2010.

［13］孫巖，郭慶興，童群義.油菜花粉的化學成分研究［J］.食品與發酵工業，2014，40（10）：238-244.

［14］中華人民共和國衛生部.GB5009.3-2010食品安全國家標準食品中水分的測定［S］.北京：中國標準出版社，2010.

［15］蘇堯堯，童群義.超聲微波協同萃取垂柳葉中α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究［J］.食品工業科技，2014，35（2）：235-238.

［16］侯留鑫，王華清，鄭鐵松，等.一種新型茶葉籽黃酮單體的分離鑒定及其抗氧化活性［J］.食品科學，2013，34（21）：115-120.

［17］楊梅芳.柚子黃酮類物質提取、分離及生物特性研究［D］.廣州：華南理工大學，2013.

［18］宋佳.蘆筍廢棄物中黃酮化合物的純化及其性質研究［D］.無錫：江南大學，2012.

［19］阿布拉江·克依木.黃酮苷類天然產物的質譜分析方法研究［D］.北京：中國協和醫科大學，2003.

［20］郭娟麗，張培成，張智武.油菜花粉的化學成分研究［J］.中國中藥雜志，2009，34（10）：1235-1237.

［21］Zhao-Guang Zheng，Ru-Shang Wang，Hui-Quan Cheng，et al.Isolated perfused lung extraction and HPLC-ESI-MSn analysis for predicting bioactive components of Saposhnikoviae Radix［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2011，54：614-618.

［22］Yu-Ge Gui，Rong Tsao，Li Li，et al.Preparative separation of chromones in plant extract of Saposhnikovia divaricata by high-performance counter-current chromatography［J］.Journal of Separation Science，2011，34（5）：520-526.

［23］Li Li，Yu-Ge Gui，Jiang Wang，et al.Preparative separation of chromones in plant extract of saposhnikovia divaricata by reverse-phase medium-pressure liquid chromatography and high performance counter-current chromatography［J］.Journal of Liquid Chromatography&Related Technologies，2013，36（8）：1043-1053.

［24］楊潔，陳純，邢建軍，等.油菜蜂花粉中黃酮類化合物的提取與鑒［J］.食品科學，2010，33（22）：273-278.

［25］邢建軍，楊潔，鄭國偉，等.XAD-2樹脂對油菜蜂蜜中黃酮類物質分離條件的優化［J］.中國蜂業，2010，61（12）：9-12.

Study on hypoglycemic activities of flavonoids of Brassica napus L.bee pollen in vitro

SUN Yan1，GUO Qing-xing2，TONG Qun-yi1，*
（1.College of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Anheuser-Busch InBev（Foshan）Brewery Co.，Ltd.，Foshan 528100，China）

The crude alcoholic extract of Brassica napus L.bee pollen was treated by solvent extraction and macroporous resin，and α-glucosidase inhibition test on the depurated flavonoids in vitro was carried out.The components which had the strongest inhibitory effect on α-glucosidase were analyzed by IR and LC-MS. Results showed that the flavonoids played a vital role in inhibiting α-glycosidase enzymes.The purity of PEFS-3 which was made by AB-8 macroporous resin was 68.77%，and its IC50was 72.16μg/mL，far less than the IC50of acarbose（1124.86μg/mL）.Based on IR and LC-MS，five main components were identified in PEFS-3，and four kinds among them were flavonoid aglycones：Quercetin-3-O-β-D-pyranoid glucose base-（1→2）-β-D-pyranoid glycosidase，Kaempferol-3，4’-double-O-β-D-pyranoid glycosidase，Isohtamnetin-3-O-β-D-pyranoid glucose base-（1→2）-β-D-pyranoid glycosidase，Kaempferol-3-O-β-D-pyranoid glucose base-（1→2）-β-D-pyranoid glycosidase，and the fifth one was inferred to be sec-O-glucosylhamaudol or flavanol，its specific structure still need further confirmation.

Brassica napus L.bee pollen；α-glucosidase；flavonoids；LC-MS

TS201.1

A

1002-0306（2015）12-0122-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.017

2014－09－15

孫巖（1989-），女，碩士研究生，研究方向：碳水化合物科學與工程。

童群義（1963-），男，博士，教授，研究方向：碳水化合物科學與工程。