新疆酸駝乳NSLAB的篩選及鑒定

樊哲新，李寶坤，李開雄，朱　敏，蔣琰潔，李王強，寧孔卵

（石河子大學食品學院，新疆石河子832000）

新疆酸駝乳NSLAB的篩選及鑒定

樊哲新，李寶坤*，李開雄*，朱敏，蔣琰潔，李王強，寧孔卵

（石河子大學食品學院，新疆石河子832000）

以新疆牧民家庭自然發酵酸駝乳為原料，采用改良的ROGOSA培養基篩選出20株非發酵劑乳酸菌（Non Starter Lactic Acid Bacteria，NSLAB），以產酸、自溶度、氨肽酶活力、蛋白水解能力為指標復篩性能優良的NSLAB，為新疆特色干酪的現代化改造提供新的菌株資源。結果表明：從酸駝乳中復篩得到六株NSLAB（編號X-4、X-5、X-7、X-12、X-13、X-15）。據多元統計分析六株菌綜合得分X-5＞X-4＞X-15＞X-13＞X-12＞X-7。其中X-5ΔpH（24h）、自溶度、氨肽酶活力、蛋白水解能力分別為1.08%、28.26%、18.88、3.21U/mL，有較好的應用前景。基于菌株生理生化特性，結合16S rDNA基因序列分析，構建菌株系統發育樹明確其分類地位，X-4、X-5、X-13、X-15鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），X-7鑒定為發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum），X-12確定為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。

發酵乳制品，非發酵劑乳酸菌，酸駝乳，菌種篩選

非發酵劑乳酸菌（NSLAB）是干酪微生物中一種獨特的菌群，屬次生菌群。通過添加NSLAB加速干酪成熟已成為研究熱點［1］。干酪發酵過程NSLAB的產酸、凝乳影響很??；在成熟過程中，通過直接代謝或釋放各種酶類到干酪中，從而影響干酪風味及質構［2-3］。有研究發現NSLAB含有檸檬酸鹽代謝系統及脂蛋白酯酶，酯酶將脂肪分解為脂肪酸，脂肪酸轉化成其他的芳香組分，如甲基酮和內酯，另外NSLAB中含有的肽酶、氨基肽酶可將酪蛋白分解為多肽和游離氨基酸，增強干酪的風味［4-7］。但也有研究表明某些菌株會對干酪風味產生消極影響。傳統發酵乳制品的最終質量取決于發酵過程中主發酵劑和非發酵劑乳酸菌及其他菌的相互作用［8］。因此，篩選適宜的NSLAB就顯得非常重要。

近二十幾年來，國內外學者對NSLAB的組成，影響其生長的因素等方面進行了研究，發現原料乳和發酵乳品是篩選NSLAB的主要來源。NSLAB群體主要由嗜溫乳桿菌組成，部分片球菌屬、腸球菌屬及明串珠球菌屬也包括在內［9］。董曉婉等［10］從新疆地區酸乳中分離出5株乳酸菌，但未對NSLAB進行確認。目前，尚未有從新疆傳統發酵乳制品中篩選NSLAB的研究報道。新疆地區傳統發酵乳品如酸奶、酥油、奶酪中微生物資源豐富，從中篩選NSLAB具有可行性。本研究通過改良的ROGOSA固體培養基從伊犁、博州地區采集的12份酸駝乳中篩選NSLAB。由于菌株的生物學特性具有相關性，故以菌株產酸能力、自溶度、氨肽酶活力和蛋白質水解能力為指標，通過多元統計方法復篩出性能優良的NSLAB，為研究NSLAB對干酪成熟過程中風味、質構的影響提供基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

12份酸駝乳樣品采集新疆牧民家庭傳統工藝制造，其中精河小海子1份、闊岱管護站1份、伊犁國營牧場3份、那仁和布克牧場2份、伊克烏圖布拉格牧場2份、巴音傲瓦鄉3份，采集50mL酸駝乳樣品裝于無菌離心管內，封嚴后放入車載冰箱于4℃運回實驗室，立即進行實驗；ROGOSA培養基、MRS培養基、糖發酵培養基等參照相關資料配制［11-12］，其中葡萄糖天津盛奧化學試劑有限公司；乳糖天津興復精細化工研究所；蛋白胨、酵母浸膏北京奧博星生物技術有限責任公司；麥芽糖、甘露糖上海藍季科技發展有限公司；甘油、檸檬酸銨天津致遠化學試劑有限公司；硝酸鈉天津天達凈化材料精細化工廠；無水碳酸鈉天津市北辰方正試劑廠；吐溫80天津市福晨化學試劑廠；硫酸鎂、硫酸錳天津市福晨化學試劑廠；牛肉膏、瓊脂粉北京奧博星生物技術公司；以上試劑均為分析純；細菌基因組總DNA提取試劑盒、PCR產物柱式純化試劑盒北京全式金生物技術有限公司；溶菌酶、瓊脂糖Sigma公司；2×Taq PCR Master Mix廣州東盛生物科技有限公司；Gold View、T載體、DH5α寶生物工程有限公司；L-亮氨酸-對硝基苯胺、酪氨酸、其他常規試劑均購自北京奧博星生物技術有限責任公司。

電熱恒溫培養箱上海精宏實驗設備公司；高速冷凍離心機Eppendorf公司；PCR擴增儀Techne公司；電熱蒸汽滅菌鍋上海申安醫療器械廠；恒溫恒濕培養箱德國BINDER公司；超凈工作臺蘇州蘇潔凈化設備有限公司；凝膠成像儀美國Bio-Rad公司；細胞破碎儀昆山市超聲儀器有限公司；紫外可見光光度計美國GE Amersham Biosciences公司；pH計北京哈納科儀科技有限公司。

1.2NSLAB的初篩

將酸駝乳樣品用無菌的2%檸檬酸三鈉（w/v）乳化，并做10倍遞增稀釋，取10-2、10-3、10-4三個稀釋度，分別吸取200μL于調整的ROGOSA固體培養基（4g/100mL NaCl，pH5.0），30℃培養5d。根據菌落的顏色、大小、光澤、光滑度等，挑取單菌落劃線接種至MRS固體培養基上，30℃培養1～2d，多次劃線分離純化，得到純菌株。進行革蘭氏染色，鏡檢觀察菌體大小、形狀、排列方式，同時進行接觸酶實驗，參照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》將革蘭氏染色陽性、接觸酶陰性的菌株初步定為NSLAB。純菌株斜面保藏，同時用40%甘油保存，置于-20℃保存備用。

1.3NSLAB的復篩

以菌株產酸能力、自溶度、氨肽酶活力和蛋白水解四個特性為指標，采用多元統計法復篩。

1.3.1產酸能力測定將連續活化兩代的菌株按照3%（v/v）的接種量接種到150mL高溫瞬時滅菌的駝乳中，30℃培養24h。分別測定培養0、24h駝乳的pH，以ΔpH（24h）表示菌株的產酸能力。

1.3.2自溶度的測定［13］將連續活化兩代的菌株，低溫離心（10000r/min，5min，4℃），將收集到的菌體懸浮于磷酸鈉緩沖液（0.1mol/L，pH6.8）中，將菌體懸浮液吸光值（OD650）調整到0.4～0.6，30℃培養24h后測定OD650值。

式中，A1—菌體初始懸浮液吸光度值，A2—菌體培養24h吸光度值。

1.3.3氨肽酶活力的測定［14］用細胞破碎儀制備無細胞提取物，測定無細胞提取物氨肽酶活力。氨肽酶活性的測定以L-亮氨酸-對硝基苯胺為底物，參照Deborah和Storey的方法采用LNT法在405nm處測定酶活力，空白對照不放入菌液。在37℃每分鐘生產1μmol對硝基苯胺為一個酶活力單位，用U表示。

1.3.4蛋白水解能力的測定連續活化兩代的菌株以3%接種于12g/mL的脫脂乳中，30℃培養12h，以未接菌的脫脂乳作為空白。參照Frank，Church方法作適當修改［15］，在340nm處測定培養物的吸光度，測定菌株蛋白水解能力。繪制0.1～3mmol/L酪氨酸標準曲線，對應標準曲線得出蛋白水解活性相當于酪氨酸的量。在37℃每分鐘分解牛奶蛋白產生1μmol酪氨酸所需的酶量為一個酶活力單位，用U表示。

式中，K—酶液稀釋倍數；W—為生成酪氨酸量，μmol；V—反應酶液體積，mL；t—反應時間，min。

1.3.5數據分析由于菌株產酸能力、自溶度、氨肽酶活力和蛋白質水解能力有一定的相關性，數據在一定程度上具有重疊性。采用SPSS 19.0統計軟件對此四個指標進行主成分（PCA）分析。

1.4NSLAB種屬的鑒定

1.4.1菌株生理生化特性對純菌株的生理生化特性的測定參照文獻進行［11-12］。

1.4.2分子生物學鑒定

1.4.2.1純菌株DNA的提取按照細菌基因組總DNA提取試劑盒（全式金）說明書的要求操作（略作改動，第二步添加溶菌酶，水浴2h，用來破壞NSLAB的細胞壁）提取NSLAB菌株的DNA。

1.4.2.216S rDNA片段的PCR擴增對NSLAB16S rDNA進行PCR擴增。PCR采用50μL擴增體系：DNA稀釋液2μL，上游、下游引物各2μL，2×PCR Mixture 25μL，ddH2O 19μL；上游引物為U968（5-AACGCGA AGAACCTTAC-3）和L1401（5-CGGTGTGTACAAGA CCC-3）。PCR反應條件：94℃預變性5min，30個循環（94℃預變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s），72℃延伸10min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用全式金純化試劑盒割膠純化回收后，與pMD18-T載體連接，轉化入E.coli DH5α中。經藍白斑初篩，再以T載體通用引物（M13-47和RV-M）進行菌落PCR篩選，將陽性克隆子送到上海捷瑞生物技術有限公司進行測序。利用CHECK-CHIMERA篩除嵌合體，通過NCBI上的Blast程序進行序列同源性分析。

2　結果與分析

2.1NSLAB初篩結果

經改良的ROGOSA選擇培養基分離純化，篩得20株菌株，菌落多呈現圓形、扁平或針尖狀，不透明或者半透明，表面光滑，白色或乳黃色。分離得到的桿菌細胞為短桿狀或長桿狀；球菌細胞為圓形，以單個或成對出現。

圖1　菌株革蘭氏染色熒光顯微鏡圖片（100×）Fig.1　The images of fluorescence microscope from isolates of gram staining（100×）

2.2NSLAB復篩

2.2.1菌株產酸能力分析NSLAB是一種獨特的菌群，在干酪生產過程中，幾乎不產生酸，故篩選產酸能力弱或不產酸的菌株［2］。由圖2可知，X-8產酸能力最弱，ΔpH（24h）為0.66%，X-9、X-17、X-3的產酸能力較弱，ΔpH（24h）分別為0.71%、0.98%、0.98%；65%的菌株ΔpH變化在1.01%～1.08%之間，說明了所分離的NSLAB在發酵過程對產酸貢獻不大。X-15產酸能力最強，ΔpH為1.17%，X-4、X-16的ΔpH（24h）依次為1.16%、1.11%，雖然這三株菌株產酸能力相對較大，但依然符合NSLAB的生物特性。

圖2　20株NSLAB產酸力Fig.2　Change of pH in culture solution for 20 strains NSLAB

2.2.2菌株自溶能力分析干酪成熟過程中，NSLAB細胞死亡自溶，釋放出大量的胞內酶并保持活性，這些酶可將乳中的蛋白質降解為菌體生長所必須的小肽和氨基酸，形成特定風味物質前體或者直接形成干酪的風味［16］。但在發酵過程中菌株自溶又降低了NSLAB的活菌數，這可能會影響乳制品的發酵成熟。NSLAB的自溶特性是由菌株的性質決定的，不同菌株的自溶性強弱有很大的差異。對干酪成熟有促進作用的NSLAB要結合產酸能力來選擇。據圖3知，菌株自溶度在14.58%～32.02%范圍內變化，有較大的差異。X-3自溶度高達32.02%，X-4、X-5、X-13、X-15的自溶度分別是24.31%、28.26%、26.21%、27.57%，自溶度最低的是X-1，僅為14.58%。

圖3　20株NSLAB自溶度Fig.3　The extent of autolysis of 20 strains NSLAB

2.2.3菌株氨肽酶活力分析NSLAB產生的肽酶具有降解疏水性氨基酸和降低苦味的潛力［17］，添加低產酸能力、高肽酶活力的菌株對干酪成熟具有重要作用。氨肽酶活力適當的NSLAB添加到干酪生產過程中，通過對酪蛋白及其降解產物的作用，提高干酪風味和品質。如圖4所示，X-8氨肽酶活力最高，是19.02U/mL，X-5與之活力相當，為18.88U/mL；X-4和X-15氨肽酶活力相差不大，分別為13.63、13.21U/mL，明顯要低于X-8；X-2氨肽酶活力最低，僅為7.90U/mL。

圖4　20株NSLAB氨肽酶活力Fig.4　The aminopeptidase activity of 20 strains NSLAB

2.2.4菌株蛋白水解能力分析蛋白質水解速率在很大程度上決定著干酪成熟期的長短，加快蛋白質水解速率可以縮短成熟時間。游離氨基酸的增加會增強干酪風味的強度，對不同特色干酪形成獨特風味起到積極作用。但如果菌株的蛋白水解能力太強，會使蛋白質水解產生的某些小分子多肽具有苦味，影響了干酪的口味［18-20］。據圖5可看出，X-5蛋白水解活力最高，是3.21U/mL；X-2最低，是1.35U/mL；X-12、X-13蛋白水解能力相近，僅比X-5低0.2U/mL；X-15蛋白水解能力為2.64U/mL。篩選蛋白水解能力適中的菌株（蛋白水解能力在2.3～3.1U/mL之間），使干酪在成熟期產生較少的苦味多肽，使口味柔和，更利于我國消費者接受。

表1　主成分的初始特征值及累積貢獻率Table 1　Initial characteristic values and cumulative contribution of principal components

圖5　20株NSLAB氨肽酶活力Fig.5　The proteolysis ability of 20 strains NSLAB

2.2.5NSLAB生物學特性多元統計篩選通過SPSS 19.0的PCA對四個指標進行降維分析，結果見表1。由表1可知，前兩個主成分的特征值均大于1，其中第一主成分的方差貢獻率為47.467%，第二主成分的方差貢獻率為33.738%，累積方差貢獻率為81.207%。說明這兩個主成分可以反應原始變量的主要信息。

根據主成分載荷矩陣與特征向量之間的關系，計算出前兩個特征向量，得到兩個主成分表達式：F1=0.679X1+0.249X2+0.917X3+0.729X4；F2=0.408X1-0.889X2+0.044X3+0.629X4，其中X1～X4分別表示各原始變量經標準化處理后的數值。以各主成分的特征值占所提取主份特征值之和的比例作為權重系數，建立主成分綜合得分模型：F=0.584F1+0.416F2。根據主成分綜合得分模型，計算綜合得分值，并對其進行排序（見表2）。篩選出六株優良性狀的NSLAB，即X-4、X-5、X-7、X-12、X-13、X-15。

表2　20株NSLAB的主成分得分及排序Table 2　Principal component scores and ranking of 20 strains NSLAB

表3　NSLAB生理生化項目與糖發酵實驗Table 3　Biochemical characteristics and fermentation of sugar of NSLAB

2.3NSLAB種屬的鑒定

2.3.1NSLAB菌株生理生化特性實驗分別以干酪乳桿菌，乳酸乳球菌作為對照菌株，篩選得到的6株NSLAB進行生理生化特性測定與糖發酵實驗，結果見表3，表明X-4、X-5、X-13、X-15不可利用鼠李糖，但可發酵乳糖、麥芽糖、甘露糖和葡萄糖等，與Lb.plantarum（植物乳桿菌）性質相近，故鑒定為Lb.plantarum（植物乳桿菌）。X-12不可利用乳糖、麥芽糖、蔗糖產酸，但可以利用鼠李糖，與P.acidilactici（乳酸片球菌）性質相似。X-7可發酵利用阿拉伯糖、甘露糖，但不發酵甘露醇、山梨醇，與Lb.fermentum（發酵乳桿菌）性質一致。

2.3.2菌株的16S rDNA基因序列通過對NSLAB 16S rDNA序列的PCR擴增，得到清晰的特異性條帶，片段大小為450bp左右，電泳圖譜結果如圖6所示。

圖6　菌株16S rDNA的PCR擴增電泳圖Fig.6　PCR amplification pattern of isolates 16S rDNA

復篩得到的6株NSLAB的16S rDNA基因序列與NCBI數據庫中已知序列進行比對，選擇與其相似性最高且有效發表的典型菌株的16S rDNA基因序列，結合常規生理生化鑒定，確定與實驗菌株親緣關系最近的菌屬，使用Mega5.0的鄰接法（Neighbor-joinig）構建系統進化樹（圖7），自展值（bootstrap）為1000。由系統發育樹可以看出X-7與Lactobacillus fermentum親緣性最近，序列同源性為100%，該菌可鑒定為Lactobacillus fermentum；X-4、X-5、X-13和X-15與Lactobacillus plantarum親緣性最近，序列相似性為100%，確定為Lactobacillusplantarum；X-12與Pediococcus acidilactici親緣關系為99%，可將該菌定為Pediococcus acidilactici。

圖7　基于16S rDNA序列的6株菌的系統發育樹Fig.7　Phylogenetic tree of the 6 strains based on Partial16S rDNA sequences

3　結論

從新疆不同地區酸駝乳中篩選出6株具有優良性狀的NSLAB（X-4、X-5、X-7、X-12、X-13、X-15），其中X-5的ΔpH（24h）、自溶度、氨肽酶活力、蛋白水解能力分別為1.08%、28.26%、18.88、3.21U/mL，是性能最優良的NSLAB。16S rDNA基因序列比對結果與生理生化特性鑒定結果相吻合，X-4、X-5、X-13、X-15菌株鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），X-7菌株確定為發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum），X-12菌株認定為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。由于NSLAB的不可預測性及本身的動力學變化特性，今后應綜合考慮干酪成熟期雜菌生長、營養物質匱乏和菌株自身特性等因素對NSLAB促進干酪成熟的影響，并嘗試從基因角度分析NSLAB影響干酪風味的機理。

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Screening and identification of NSLAB in Xinjiang acid camel milk

FAN Zhe-xin，LI Bao-kun*，LI Kai-xiong*，ZHU Min，JIANG Yan-jie，LI Wang-qiang，NING Kong-luan
（College of Food Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832000，China）

A total of 20 strains Non Starter Lactic Acid Bacteria（NSLAB）were isolated from home-made fermented camel milk samples of Xinjiang through improved ROGOSA medium.Comprehensive 4 physiological indices including the ability of acidity and the proteolysis，extent of autolysis，the aminopeptidase activity，of NSLAB were used to evaluate the composite score and select evaluation indices in tested high properties NSLAB.By multivariate statistical analysis and composite scores（X-5＞X-4＞X-15＞X-13＞X-12＞X-7）.The results showed that ΔpH（24h），the extent of autolysis，the aminopeptidase activity，the proteolysis ability of X-5 were 1.08%，28.26%，18.88，3.21U/mL，respectively.The isolates were identified by physiology-biochemistry characteristics and the molecular method of 16S rDNA and a phylogenetic tree was contructed.X-4，X-5，X-13，X-15 were identified as Lactobacillus plantarum，X-7，X-12 were identified as Lactobacillus fermentum，Pediococcus acidilactici，respectively.

fermented milks；Non Starter Lactic Acid Bacteria（NSLAB）；fermented camel milk；screening

TS261.1

A

1002-0306（2015）12-0170-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.027

2014－09－15

樊哲新（1987-），女，在讀碩士研究生，研究方向：畜產品加工與安全。

李寶坤（1979-），男，博士，副教授，研究方向：畜產品加工與質量安全。李開雄（1956-），男，教授，研究方向：畜產品加工與質量安全。

國家自然基金青年項目（31201395）；新疆生產建設兵團博士資金專項（2014BB005）；石河子大學高層次人才啟動項目（RCZX201223）；國家自然基金地區項目（31460007）；國家自然基金地區項目（30960001）。