固定化共生發酵紅茶菌飲料工藝的研究

任二芳，牛德寶，郭海蓉，劉功德

（1.廣西壯族自治區亞熱帶作物研究所，廣西南寧530001；2.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧530004）

固定化共生發酵紅茶菌飲料工藝的研究

任二芳1，牛德寶1，郭海蓉2，*，劉功德1

（1.廣西壯族自治區亞熱帶作物研究所，廣西南寧530001；2.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧530004）

采用固定化細胞技術實現紅茶菌飲料的固定化共生發酵，對其工業化生產具有重要意義。本實驗以發酵液中的總酸含量、總糖利用率以及對發酵液的感官評價分值為考查指標，探討了蔗糖添加量、接種量、菌種比例以及發酵時間等因素對固定化細胞共生發酵紅茶菌飲料的影響，并通過正交實驗優化了固定化共生發酵紅茶菌飲料的最佳工藝條件。結果表明：當蔗糖添加量為70g/L，接種量為7.5%，菌種比例（酵母菌J∶醋酸菌C）為6∶4，發酵時間為6d時，制得的紅茶菌飲料色澤均勻，香味怡人，酸甜可口，具有紅茶菌發酵液特有的風味。

固定化，共生發酵，紅茶菌飲料

紅茶菌是一種傳統的酸性保健飲料，它是由酵母菌、醋酸菌和乳酸菌等多種微生物共同對糖茶水進行發酵而成。紅茶菌在我國民間有“海寶”、“胃寶”之稱。紅茶菌含有多種有益成分，例如茶多酚、氨基酸、生物堿、茶多糖、乙酸、乳酸、葡萄糖醛酸、D-葡萄糖二酸-1，4-內酯、乙醇、蛋白質、維生素、微量元素等。紅茶菌的保健作用主要包括：提高人體免疫力，清理腸胃，促進消化，降低血壓、血糖，防治心血管疾病和糖尿病，減少各種結石的發生，消毒解毒，防癌、抗癌等［1-5］。

近些年來，除了一些東南亞國家，紅茶菌飲料在歐洲中部和東部各國，以及在德國、美國和加拿大等西方國家頗受歡迎。目前，在國內，紅茶菌都是采用游離菌混合靜置的傳統方式培養，然而這種傳統的方式存在多種弊端：易受到雜菌污染，受季節影響大，菌種不宜保藏等。固定化技術是采用物理或化學手段將酶或細胞束縛于一定的范圍內，使它們既保持原有的活性，又可以在連續反應后回收并實現重復利用的一項技術［6］。同游離細胞相比，細胞經固定化后在單位體積內細胞濃度大幅度增加，提高發酵速率；其次，固定化細胞發酵性能穩定；再者，細胞固定后可以重復利用，對于生產胞外產品的發酵簡化了細胞分離的步驟，這些優點節約了發酵過程的生產成本［7］。近幾十年來對固定化細胞的研究越來越多，目前該技術已經較為成熟，其應用涉及到醫療保健、食品發酵工業、環境保護、能源開發以及生物傳感器等各個領域［8-11］。

固定化細胞技術共生發酵紅茶菌飲料，不僅可有效解決游離菌混合靜置發酵生產紅茶菌時存在的弊端，而且這種發酵方式有助于控制產品的質量，對紅茶菌飲料的開發和利用有一定的指導意義。因此本文通過單因素實驗和正交實驗確定固定化共生發酵紅茶菌飲料的最佳工藝，從而為紅茶菌飲料實現工業生產提供一定的參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌種山東農業大學生命科學學院實驗室純化保存的紅茶菌中的酵母菌菌株和醋酸菌菌株；鐵觀音原香綠茶由福建省安溪新美茶業有限公司生產；白砂糖為市購；海藻酸鈉、明膠均為化學純，購自上海國藥集團化學試劑公司；其他試劑均為分析純，購自上海國藥集團化學試劑公司。

手提式壓力蒸汽滅菌器貴州省開陽醫療器械廠；SP-752紫外可見分光光度計上海光譜儀器有限公司；LRH-250-Z全溫振蕩培養箱廣東省醫療器械廠；L550低速自動平衡離心機長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1工藝流程

1.2.2操作要點

1.2.2.1培養基的配制酵母菌活化培養基：馬鈴薯200g，蔗糖（或葡萄糖）20g，瓊脂15～20g，蒸餾水1000mL，自然pH，121℃滅菌20min；醋酸菌活化培養基：酵母浸膏10g，葡萄糖10g，碳酸鈣15g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH6.8，121℃滅菌20min，培養基冷卻至50℃左右，加入4%的無水乙醇；紅茶菌發酵培養基：將7g綠茶添加到1000mL沸水中，浸提20min，再將一定量的蔗糖加入到茶液中，混勻溶解后進行分裝，250mL三角瓶的裝液量為120mL，用八層紗布封口，并用牛皮紙包扎，進行巴氏滅菌，冷卻至室溫后備用。

1.2.2.2固定化細胞的制備將5.5%的海藻酸鈉和1.5%的明膠充分溶解，滅菌后待其溫度降至室溫時，將細胞濃度均約為3×107cell/mL的酵母菌菌懸液和醋酸菌菌懸液分別與等體積的固定化載體溶液充分混勻，混勻后的酵母菌混合液和醋酸菌混合液再分別用注射器滴入到0.51%的氯化鈣溶液中，固定1h后用無菌水沖洗，重新加入0.51%的氯化鈣溶液，4℃平衡過夜，即可制得固定化酵母菌顆粒、固定化醋酸菌顆粒［12］。

1.2.3單因素實驗紅茶菌固定化后轉入紅茶菌發酵培養基，在30℃、150r/min的恒溫搖床中培養，發酵結束后，測定發酵液中的總酸含量、總糖利用率并對發酵液進行感官評價，以此為參考指標，探討蔗糖添加量、接種量、菌種比例以及發酵時間等因素對固定化細胞共生發酵紅茶菌飲料的影響，每個實驗重復3次。

1.2.3.1蔗糖添加量固定接種量7.5%，菌種比例5∶5，發酵時間6d，考察不同蔗糖添加量50、60、70、80、90、100g/L對固定化細胞共生發酵紅茶菌飲料的影響。

1.2.3.2接種量固定蔗糖添加量80g/L，菌種比例5∶5，發酵時間6d，考察不同接種量2.5%、5.0%、7.5%、10%、12.5%、15%對固定化細胞共生發酵紅茶菌飲料的影響。

1.2.3.3菌種比例固定蔗糖添加量80g/L，接種量7.5%，發酵時間為6d，考察不同菌種比例3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2（酵母菌J∶醋酸菌C，v/v）對固定化細胞共生發酵紅茶菌飲料的影響。

1.2.3.4發酵時間固定蔗糖添加量80g/L，接種量7.5%，菌種比例5∶5，考察不同發酵時間2、4、6、8、10d對固定化細胞共生發酵紅茶菌飲料的影響。

1.2.4正交優化實驗在單因素實驗的基礎上，進行正交實驗，研究影響固定化細胞共生發酵紅茶菌飲料的四個因素：蔗糖添加量（A）、接種量（B）、菌種比例（C）和發酵時間（D），每個因素選取三個水平，按L9（34）正交表設計實驗，每個實驗重復3次，因素水平表如表1所示。

表1　正交實驗因素與水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal design experiment

1.3分析方法

1.3.1總酸的測定采用GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法。

1.3.2總糖利用率的測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定蔗糖含量［13］。

1.3.3感官評價指標組織8人為感官評價小組，根據表2的標準，對不同產品的色澤、香味、滋味、組織狀態進行鑒定并打分，多人感官評價打分的平均值作為最終的感官評價結果［14］。

1.3.4數據處理采用Excel 2010進行數據預處理并繪制圖表，利用SPSS 17.0軟件進行數據分析。

2　結果與分析

2.1單因素條件對固定化共生發酵工藝條件的優化

2.1.1蔗糖添加量對發酵液的影響從圖1可以看出，隨著蔗糖添加量的增加，發酵液的總糖利用率總體呈現下降的趨勢，當蔗糖添加量為50g/L時，發酵液的總糖利用率最大，蔗糖添加量為100g/L時，發酵液的總糖利用率最小，而隨著蔗糖添加量的增加，發酵液中的總酸含量呈現先升后降的趨勢，當蔗糖添加量為60～80g/L時，發酵液的總酸含量和總糖利用率變化均很微小。由此可見蔗糖濃度越大，對微生物的抑制作用越強，總糖利用率越低，由于發酵液中總酸含量和總糖含量在一定程度上反映了發酵液的品質，因此，初步確定蔗糖添加量為60～80g/L。

表2　感官評價標準Table 2　Sensory evaluation standard

圖1　蔗糖添加量對發酵液總酸含量和總糖利用率的影響Fig.1　The effect of the amount of sucrose added on the total acid content and total sugar utilization of the fermentation broth

由表3可知，隨著蔗糖添加量的增加，感官評價分值呈現先升后降的趨勢，這是因為蔗糖添加量過低或過高，會導致發酵液偏酸或偏甜，而當蔗糖添加量為80g/L時，發酵液酸甜可口，品質最佳，感官評價分值最高。

表3　感官評價結果Table 3　Sensory evaluation results

所以，綜合考慮蔗糖添加量對固定化共生發酵效果的影響，確定蔗糖添加量為80g/L。

2.1.2接種量對發酵液的影響發酵液中總酸含量是判斷紅茶菌成熟的主要指標之一，當總酸含量達到6～10g/L時即認為發酵成熟［15］。由圖2分析可得，隨著接種量的增加，發酵液的總酸含量和總糖利用率均不斷增加，但接種量在10%～15%時發酵液的總酸含量差別不大，這是由于接種量過大時，酵母菌J和醋酸菌C會大量消耗發酵液中的營養物質用于它們自身的繁殖，同時伴隨著大量代謝廢物的產生，從而不利于獲得所需的發酵產物［16］。同時，接種量大于10%時，發酵液中總酸含量過大，影響發酵液品質；而接種量為2.5%時，發酵不徹底，發酵液的總酸含量僅為4.73g/L，達不到紅茶菌成熟時要求的標準，這說明接種量過高或過低，都不利于紅茶菌的發酵，因此，初步確定接種量為5%～7.5%。

圖2　接種量對發酵液總酸含量和總糖利用率的影響Fig.2　The effect of the inoculum rate on the total acid content and total sugar utilization of the fermentation broth

由表4可知，在實驗范圍內，隨著接種量的增加，感官評價分值呈現先升后降的趨勢，當接種量為7.5%時，感官評價分值最高，這說明采用7.5%的接種量制得的紅茶菌液品質最好。

表4　感官評價結果Table 4　Sensory evaluation results

因此，綜合考慮接種量對固定化共生發酵效果的影響，確定接種量為7.5%。

2.1.3菌種比例對發酵液的影響從圖3可以看出，隨著醋酸菌C的比例不斷減小，發酵液的總酸含量呈遞減趨勢，這是因為醋酸菌C的作用是氧化乙醇產生乙酸，乙酸又是構成發酵液中總酸的主要組成成分。菌種比例為8∶2時發酵液的總糖利用率較低，其他五種菌種比例的發酵液的總糖利用率變化不大。當酵母菌J與醋酸菌C比例大于6∶4時，發酵液的總酸含量低于6g/L，達不到紅茶菌成熟標準，而當酵母菌J與醋酸菌C比例為4∶6、3∶7時，總酸含量過大，發酵液過酸。因此，初步確定菌種比例為5∶5、6∶4。

由表5可知，在實驗范圍內，隨著醋酸菌C的比例不斷下降，發酵液的感官評價分值，呈現先升后降的趨勢，當酵母菌J∶醋酸菌C為5∶5時，感官評價分值最高。

所以，綜合考慮菌種比例對固定化共生發酵效果的影響，確定酵母菌與醋酸菌比例為5∶5。

2.1.4發酵時間對發酵液的影響從圖4可以看出，發酵時間從2～10d時，發酵液中總酸含量和總糖利用率隨發酵時間的延長均呈增長趨勢，總糖利用率的增長趨勢快于總酸含量，這是因為紅茶菌中的酵母菌和醋酸菌生長繁殖不僅需要消耗糖類物質，而且乙酸、乙醇等產物的生成也需要通過糖類物質的轉化。而發酵時間為6d時，發酵液中總酸含量為10.45g/L，可達到紅茶菌發酵成熟的標準。

表5　感官評價結果Table 5　Sensory evaluation results

表6　感官評價結果Table 6　Sensory evaluation results

圖3　菌種比例對發酵液總酸含量和總糖利用率的影響Fig.3　The effect of the ratio of strain inoculum on the total acid content and total sugar utilization of the fermentation broth

圖4　發酵時間對發酵液總酸含量和總糖利用率的影響Fig.4　The effect of fermentation time on the total acid content and total sugar utilization of the fermentation broth

由表6可知，發酵時間過短或過長時，感官評價分值偏低，發酵液品質不佳，當發酵時間為6d時，感官評價分值最高，發酵液品質較好。

因此，綜合考慮發酵時間對固定化共生發酵效果的影響，確定發酵時間為6d。

2.2正交實驗

為確定固定化共生發酵紅茶菌飲料的最優工藝，在單因素實驗結果的基礎上，設計正交實驗進行優化，正交實驗結果以及方差分析分別如表7、表8所示。

表7　正交實驗設計與結果Table 7　Orthogonal experiment design and its result

表8　實驗結果方差分析Table 8　Experimental results and analysis of variance

由表7得知，選擇的四個因素對固定化菌發酵的影響程度由大到小依次為B＞D＞A＞C，即接種量＞發酵時間＞蔗糖添加量＞菌種比例。直接比較表7中的9組實驗結果可以看出，A1B2C2D2組合發酵所得紅茶菌飲料的評分最高，而比較各因素的k值可得，最優工藝組合為A1B2C3D2。另外，從表8可知，各因素對紅茶菌飲料感官評價的影響均不顯著。

所以，將組合A1B2C2D2和組合A1B2C3D2再次分別進行多次重復實驗，得到發酵液的感官評價分值的均值分別為84.50、87.00分，從而確定固定化共生發酵紅茶菌飲料的最優工藝為A1B2C3D2，即蔗糖添加量為70g/L，接種量為7.5%，菌種比例為6∶4，發酵時間為6d。在此條件下，制得的紅茶菌飲料色澤均勻，香味怡人，酸甜可口，具有紅茶菌發酵液特有的風味。

3　結論

利用固定化細胞技術實現了紅茶菌飲料的固定化共生發酵，通過單因素和正交實驗最終得出固定化菌發酵紅茶菌飲料的最佳工藝條件為：蔗糖添加量為70g/L，接種量為7.5%，菌種比例（酵母菌J∶醋酸菌C）為6∶4，發酵時間為6d；四個因素對固定化菌發酵效果的影響程度由大到小依次為接種量＞發酵時間＞蔗糖添加量＞菌種比例。在此條件下進行紅茶菌飲料的發酵，得到的紅茶菌飲料色澤均勻，香味怡人，酸甜可口。

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Study on the preparation process of Kombucha beverage of symbiosis fermentation by immobilized cell technology

REN Er-fang1，NIU De-bao1，GUO Hai-rong2，*，LIU Gong-de1
（1.Guangxi Subtropical Crops Research Institute，Nanning 530001，China；2.Light Industry and Food Engineering Institute，Guangxi University，Nanning 530004，China）

Kombucha beverage of symbiosis fermentation by immobilized cell technology had an important significance for its industrial production.In this experiment，the total acid content，total sugar utilization and sensory evaluation results of the fermentation broth was used as index.In the first，the study discussed the effects of fermentation conditions including the amount of sucrose added，the inoculum rate，the ratio of strain inoculum and the fermentation time on symbiosis fermentation of Kombucha beverage by immobilized cell technology.And then orthogonal experiment was used to optimize the preparation process of Kombucha beverage of symbiosis fermentation by immobilized cell technology.The results showed that the optimal condition of symbiosis fermentation of Kombucha beverage by immobilized cell technology for：the amount of sucrose added was 70g/L，the inoculum rate was 7.5%，the ratio of strain inoculum was 6∶4，fermentation lasted 6 days. The Kombucha beverage produced according to this preparation technology remained uniform color，pleasant aroma，the distinctive flavor of mellow sweet and sour.

immobilization；mixed culture fermentation；Kombucha beverage

TS275.4

A

1002-0306（2015）12-0193-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.032

2014－08－29

任二芳（1986-），女，碩士研究生，研究方向：功能食品開發與生物發酵制品研究。

郭海蓉（1962-），女，教授，研究方向：糖料資源功能與綜合利用研究。

廣西壯族自治區亞熱帶作物研究所專項資金項目（桂熱研201409）。