綜合指標正交設計優選杭白菊揮發油萃取工藝

楊　　劍，邵　榮，王志祥，*，陳然然

（1.中國藥科大學制藥工程教研室，江蘇南京210009；2.鹽城工學院化學與生物工程學院，江蘇鹽城224051）

綜合指標正交設計優選杭白菊揮發油萃取工藝

楊劍1，邵榮2，王志祥1，*，陳然然1

（1.中國藥科大學制藥工程教研室，江蘇南京210009；2.鹽城工學院化學與生物工程學院，江蘇鹽城224051）

以杭白菊為研究對象，超臨界CO2為溶劑，β-欖香烯得率和揮發油得率為指標，分別考察顆粒粒徑、萃取壓力、萃取溫度、萃取時間對提取過程的影響。在單因素實驗的基礎上，綜合考慮雙指標，利用正交設計，得到優化工藝條件：顆粒粒徑80目，萃取壓力17.24MPa，萃取溫度35℃，萃取時間100min。在此條件下，杭白菊中β-欖香烯得率達到104.57mg/kg，揮發油得率達到3.26%。用綜合指標優化萃取工藝條件，兼顧了杭白菊中重要抗癌活性成分β-欖香烯得率和揮發油得率，使工藝條件更加合理。

杭白菊，β-欖香烯，超臨界，綜合指標，正交設計

杭白菊是藥食兼用的花卉，是浙江省八大名藥材“浙八味”之一，具有很高的藥用價值和保健價值［1］。杭白菊中主要活性成分為黃酮類物質和揮發油等。揮發油中的β-欖香烯具有誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖、抗腫瘤轉移和主動免疫保護等作用，還有抗氧化、抗菌、抗病毒、改善微循環等作用。因其廣譜、安全、有效、價廉等突出優點而具有良好的應用前景。臨床上β-欖香烯可以單獨使用，或與其他化療藥物合用于治療肺癌、消化道腫瘤、乳腺癌等［2］。

菊花揮發油的傳統提取法為水蒸氣蒸餾法，但杭白菊的有效成分中有些低沸點、易氧化物質，在水蒸氣蒸餾提取時會發生變化和損失，使精油的品質下降，且揮發油得率也很低。超臨界流體萃取技術具有低溫提取、效率高、無溶劑殘留和可選擇性分離等特點，尤其適用于熱不穩定的揮發性組分的提取［3］。

菊花揮發油提取工藝的文獻雖有報道［4-7］，但一般均采用揮發油得率作為評價指標。本實驗采用超臨界萃取技術提取杭白菊中的揮發油，通過氣相色譜內標法將萃取工藝過程中重要的抗癌活性成分β-欖香烯得率作為主要指標，揮發油得率作為次要指標進行測定，綜合考慮雙指標，優選工藝條件，進而為杭白菊中高附加值產物的開發提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

杭白菊浙江遠福茶葉有限公司；β-欖香烯標準品中國藥品生物制品檢定所；高純二氧化碳鹽城市廣源氣體有限公司；正十二烷標準品上海晶純生化科技股份有限公司；正己烷色譜純。

SFT-100XW超臨界二氧化碳萃取儀美國超臨界流體技術有限公司；GC-2014氣相色譜儀、AUY220電子天平日本島津公司；720060/720050移液槍蘇州百得實驗室儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1提取揮發油的工藝流程取一定粒徑的杭白菊，稱為w0，裝于茶葉袋中，稱為w1，置于超臨界萃取釜中萃取，收集萃出的揮發油，用正己烷定容供β-欖香烯含量測定備用，并將萃取完成后的含渣茶葉袋稱為w2。則揮發油的得率計算公式為：

1.2.2色譜條件色譜柱：SE-54毛細管色譜柱（30m× 0.32mm，0.25μm）；載氣：氮氣；進樣口溫度為280℃；檢測器溫度：280℃；柱溫：采用程序升溫，起始溫度為50℃，保持2min，再以5℃/min升高到260℃，保持5min。分流比：40；載氣速度：30mL/min，空氣：400mL/min，氫氣：40mL/min；進樣量：1μL［8］。

1.2.3β-欖香烯得率測定稱定β-欖香烯標準品0.0403g于10mL容量瓶中，正己烷定容后精密量取1mL于25mL容量瓶中，并用正己烷定容，得到161.2μg/mL的β-欖香烯標準應用液；稱定正十二烷0.5993g于10mL容量瓶中，正己烷定容后精密量取1mL于100mL容量瓶中，并用正己烷定容，得到599.3μg/mL的內標溶液；分別移取β-欖香烯標準應用液25、50、100、200、400、800μL于1mL量瓶中，并分別加入50μL內標溶液，經氣相色譜制得內標標準曲線，以對照品峰面積與內標溶液峰面積之比為橫坐標X，對照品濃度為縱坐標C；制得內標標準曲線為C=28.852X+0.5949（R2=0.9993，n=6），線性范圍為4.03～128.96μg/mL。依據內標標準曲線可得備用液濃度。超臨界萃取產物用正己烷定容于10mL量瓶中。取250μL于1mL量瓶，加入50μL內標溶液，定容得供試樣品溶液。經內標標準曲線法得樣品溶液中β-欖香烯含量。杭白菊中β-欖香烯含量（mg/kg）按下式計算：

式中，C為樣品溶液中β欖香烯質量濃度（μg/mL）；V為供試樣品溶液的體積，即1mL；M為加入萃取釜的菊花粉末質量（g）。

1.2.4單因素實驗超臨界二氧化碳萃取杭白菊揮發油過程中，影響萃取效果的因素較多，本實驗考察菊花粉末的顆粒粒徑，萃取溫度，萃取壓力和萃取時間這四個影響揮發油萃取效果的主要因素。確定各參數的較優條件。

1.2.4.1顆粒粒徑對提取效果的影響保持CO2流量為15.00mL/min，分別取粒徑為過40、60、80、100、 120目篩的菊花顆粒14.0g，萃取溫度為45℃，萃取壓力為17.24MPa，萃取60min，研究不同顆粒粒徑對β-欖香烯得率和菊花揮發油得率的影響。

1.2.4.2萃取溫度對提取效果的影響保持CO2流量為15.00mL/min，取粒徑為過100目篩的菊花顆粒14.0g，萃取溫度分別采用32、35、40、45、50℃，萃取壓力為17.24MPa，萃取60min，研究不同萃取溫度對β-欖香烯得率和菊花揮發油得率的影響。

1.2.4.3萃取壓力對提取效果的影響保持CO2流量為15.00mL/min，取粒徑為過100目篩的菊花顆粒14.0g，萃取溫度為35℃，萃取壓力分別采用10.34、13.79、17.24、20.68、24.13MPa，萃取60min，研究不同萃取壓力對β-欖香烯得率和菊花揮發油得率的影響。

1.2.4.4萃取時間對提取效果的影響保持CO2流量為15.00mL/min，取粒徑為過100目篩的菊花顆粒14.0g，萃取溫度為35℃，萃取壓力為17.24MPa，分別萃取40、60、80、100、120min，研究不同萃取時間對β-欖香烯得率和菊花揮發油得率的影響。

1.2.5工藝評價指標β-欖香烯是杭白菊揮發油中的一種重要的活性成分，在本實驗中，以β-欖香烯得率和杭白菊揮發油得率作為評價指標。根據兩指標的主次順序，設定β-欖香烯權重系數為0.8，揮發油權重系數為0.2［9］。提取工藝優化過程中，分別測定兩者得率，再通過給出的統計權重算出工藝評價參數，對優化工藝進行評價。評價參數的表達式如下：

1.2.6正交設計在單因素實驗的基礎上，采用超臨界萃取工藝，選擇顆粒粒徑、萃取溫度、萃取壓力、萃取時間四個因素，以β-欖香烯的得率和杭白菊揮發油的得率為考察指標，選用正交設計表L9（34）進行實驗，因素水平表見表1。

表1　L9（34）正交實驗因素水平表Table 1　Factors and levels of L9（34）orthogonal experiments

1.2.7數據處理實驗過程中每個處理均重復三次，取其平均值。單因素實驗與正交實驗采用Origin pro 7.5和Excel 2010處理數據。

2　結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1顆粒粒徑對提取效果的影響由圖1可知，隨著目數增加，β-欖香烯得率先上升后下降。在40～100目，隨著粒徑減小，β-欖香烯得率緩慢升高，這是因為隨著顆粒粒徑的減小，內傳質阻力減小，傳質速率增大。但隨后到120目時，β-欖香烯得率驟降至較低水平，可能是因為菊花顆粒粒徑較小時，超臨界CO2流過萃取器中固體介質床層時沒有與固體介質有效接觸，沒有發揮萃取作用，從而導致整體萃取效率下降。另外，粉碎過程中顆粒過細可能導致揮發性成分的直接流失。杭白菊揮發油得率隨著目數的增加先升高后降低，40～80目提高較快，在80目時達到最高。隨著粒徑進一步減小，揮發油得率急劇下降。在60～100目時，粒徑對β-欖香烯得率影響甚微，但對揮發油得率影響顯著。故選擇粒徑在60～100目比較適宜。

圖1　顆粒粒徑對β-欖香烯和揮發油得率的影響Fig.1　Influence of particle diameter on β-elemene and volatile oil yield

2.1.2萃取溫度對提取效果的影響由圖2可知，隨著萃取溫度的升高，β-欖香烯得率先升高后下降。在32～35℃，隨著溫度的升高，β-欖香烯得率急劇升高，這是因為溫度升高時，β-欖香烯的蒸氣壓增大，在超臨界流體中的溶解度增大。在35～50℃，溫度升高，超臨界流體的密度降低，超臨界流體溶解β-欖香烯的能力下降，至50℃時，β-欖香烯得率下降到較低水平。總體上講，杭白菊揮發油得率隨溫度升高而緩慢升高，在35～45℃基本保持不變。綜合考慮，萃取溫度選擇在35～45℃較為合理。

圖2　萃取溫度對β-欖香烯和揮發油得率的影響Fig.2　Influence of extraction temperature on β-elemeneextraction yield and volatile oil yield

2.1.3萃取壓力對提取效果的影響由圖3可知，β-欖香烯得率隨著壓力增大先升高后降低，在10.34～17.24MPa，壓力越高，超臨界CO2的密度越大，超臨界CO2的溶解能力越高。17.24MPa以后，隨著壓力進一步升高，β-欖香烯的擴散系數也會逐漸減小，同時萃取過程中分離選擇性降低，最終導致β-欖香烯得率降低。杭白菊揮發油得率隨著壓力增加先升高后降低，同樣在17.24MPa達到最高。高壓條件下選擇性差，揮發油品質較低，同時考慮到工業規模設備選型和操作要求，選擇較低壓力為宜。所以萃取壓力選擇在10.34～17.24MPa比較合適。

圖3　萃取壓力對β-欖香烯和揮發油得率的影響Fig.3　Influence of extraction pressure on β-elemene extraction yield and volatile oil yield

2.1.4萃取時間對提取效果的影響由圖4可知，隨著萃取時間的增加，β-欖香烯得率先升高后降低。在40～100min，隨著萃取時間的增加，β-欖香烯得率逐漸提高，這是因為隨著萃取時間的延長，溶質會被萃取的越來越充分。然而100min之后，β-欖香烯得率可能由于逸散損失逐漸下降。同時，萃取時間過長會將其他物質萃取出來，導致選擇性變差，揮發油品質下降。杭白菊揮發油得率隨著萃取時間的延長也是先升高后降低，在100min時達到最大值。同時考慮設備的運行成本和揮發油的品質，萃取時間選擇在60～100min比較合理。

圖4　萃取時間對β-欖香烯和揮發油得率的影響Fig.4　Influence of extraction time on β-elemene extraction yield and volatile oil yield

2.2正交設計優化杭白菊揮發油萃取工藝

在單因素實驗的基礎上，對影響得率的四個因素按照表1進行正交實驗，正交實驗設計與結果見表2，方差分析結果見表3。

極差分析結果為RC＞RD＞RB＞RA，即對杭白菊揮發油提取效果影響的主次順序為：萃取壓力＞萃取時間＞萃取溫度＞顆粒粒徑。表3方差分析結果為FC＞FD＞F0.05＞FB＞FA，表明萃取壓力和萃取時間對杭白菊揮發油萃取效果影響顯著，而萃取溫度和顆粒粒影響不顯著。最佳提取工藝條件為A2B1C3D3，即顆粒粒徑選用80目，萃取溫度為35℃，萃取壓力為17.24MPa，萃取時間為100min。在此工藝條件下進行了三次平行實驗，綜合評價參數為105.79，β-欖香烯的平均得率為104.57mg/kg，杭白菊揮發油的平均得率為3.26%。而利用水蒸氣蒸餾法從杭白菊中獲得的β-欖香烯得率為12.98mg/kg［10］，揮發油得率為0.55%［6］，均遠遠低于超臨界CO2萃取法。

表2　正交實驗設計與結果Table 2　Design and results of orthogonal experiment

表3　正交實驗方差分析結果Table 3　Variance analysis results of orthogonal experiment

3　結論

通過單因素實驗和正交設計對杭白菊中揮發油提取工藝進行優化。最終確定的優選工藝條件為顆粒粒徑80目，萃取溫度35℃，萃取壓力17.24MPa，萃取時間100min，在此實驗條件下，β-欖香烯的平均得率為104.57mg/kg，杭白菊揮發油的平均得率為3.26%。采用超臨界CO2萃取技術對杭白菊中揮發油成分進行了萃取，與傳統的水蒸氣蒸餾法相比，顯著降低了提取溫度，縮短了提取時間，大大減少了β-欖香烯在提取過程的氧化變質的發生。

［1］周麗，張維，王斌.杭白菊的有效成分及深加工研究進展［J］.食品工業，2014，35（6）：199-202.

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Optimization of extraction conditions of volatile oil from Chrysanthemum morifolium Ramat by orthogonal design

YANG Jian1，SHAO Rong2，WANG Zhi-xiang1，*，CHEN Ran-ran1
（1.China Pharmaceutical University，Pharmaceutical Engineering Teaching and Research Section，Nanjing 210009，China；2.Yancheng Institute of Technology，School of Chemical and Biological Engineering，Yancheng 224051，China）

With Chrysanthemum morifolium Ramat as the research object，supercritical CO2as solvent，the βelemene yield and volatile oil yield as measure indicators，the effects of four extraction parameters including particle diameter，extraction pressure，extraction temperature，extraction time on extraction processes were separately studied.Then it was optimized using orthogonal design based on single factor investigations for achieving higher β-elemene extraction yield and volatile oil extraction yield.Under the condition of particle diameter of 80 meshes，extraction pressure of 17.24MPa，extraction temperature of 35℃，extraction time of 100min，the β-elemene yield was 104.57mg/kg and the volatile oil yield was 3.26%.It gave priority to βelemene yield with due consideration to volatile oil yield with comprehensive index orthogonal design.It made process conditions more reasonable.

Chrysanthemum morifolium Ramat；β-elemene；supercritical；comprehensive index；orthogonal design

TS201.1

B

1002-0306（2015）12-0270-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.048

2014－09－23

楊劍（1989-），男，碩士，研究方向：制藥分離工程。

王志祥（1968-），男，教授，研究方向：制藥分離工程。