玉米直、支鏈淀粉回生對含羥基紅曲紅色素護色機理探討

董世瑞，劉立增，居　陽，林旭輝，連喜軍，*

（1.天津商業大學，天津市食品生物技術重點實驗室，生物技術與食品科學學院，天津300134；2.天津商業大學理學院化學系，天津300134；3.天津商業大學體育衛生部，天津300134）

玉米直、支鏈淀粉回生對含羥基紅曲紅色素護色機理探討

董世瑞1，劉立增2，居陽3，林旭輝1，連喜軍1，*

（1.天津商業大學，天津市食品生物技術重點實驗室，生物技術與食品科學學院，天津300134；2.天津商業大學理學院化學系，天津300134；3.天津商業大學體育衛生部，天津300134）

以測定殘留紅曲紅色素方法研究了玉米直鏈淀粉、支鏈淀粉的回生和色素添加方式對含羥基紅曲紅色素護色的效果，并利用紅外光譜、核磁共振和X-射線衍射分析了淀粉護色機理。結果表明，玉米直鏈和支鏈淀粉的回生對紅曲紅色素具有明顯的護色作用，15h紫外光照可使紅曲紅色素的保留率由38.3%提高到70%以上。在淀粉回生的糊化、高壓和老化三個階段中，高壓后添加色素所得回生淀粉護色效果最好。核磁、紅外和X-射線結果表明，回生淀粉與色素在C1、C6上發生了結合；直鏈淀粉結合色素更多，所以護色效果更好。

回生玉米淀粉，紅曲紅色素，護色，機理

紅曲色素在我國食用已經有上百年歷史，主要分紅、橙、黃三種色素，其中起呈色作用的主要是紅曲紅色素。紅曲紅色素具有對pH穩定，耐熱性強，蛋白質著色性好等特點，在我國廣泛用于酒、飲料、香腸、火腿等食品中［1-5］。與所有天然色素一樣，紅曲紅色素最大的缺點是在各種光輻射條件下會發生光褪色反應［6-9］。淀粉中含有大量羥基，在回生過程羥基之間形成氫鍵并進一步生成回生淀粉晶體。晶體可使光線發生折射從而減少紅曲紅色素吸收光能，進而延長其光褪色時間。本文以測定殘留紅曲紅色素方法研究了玉米直鏈淀粉、支鏈淀粉的回生和色素添加方式對含羥基紅曲紅色素護色的效果，并利用紅外光譜、核共振磁和X-射線衍射分析了其護色機理。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

玉米淀粉市售；紅曲紅山東中惠食品有限公司；薄層層析硅膠板GF254（20cm×20cm） 青島海洋化工有限公司；柱層析硅膠（200～300目） 青島海洋化工有限公司；甲醇、無水乙醇、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氯化碳（分析純） 天津市風船化學試劑科技有限公司。

RE-52AA型旋轉蒸發器上海亞榮生化儀器廠；Lambda25紫外分光光度計美國PerkinElmer公司；KER3100-08S型精密恒溫工作臺南京凱爾儀器有限公司；FES135型紅外分光光度計美國Bio-Rad公司；D-500型X-射線衍射掃描儀Siemens，Madison，WI，USA。

1.2實驗方法

1.2.1紅曲紅色素提純稱取市售紅曲紅色素30g裝入紙包，放置于索氏提取器中。分別用200mL正己烷、乙酸乙酯、甲醇作為索氏提取溶劑，按先后順序分別進行3次索氏提取。將正己烷和乙酸乙酯提取液棄掉，將所得甲醇提取液旋轉蒸發濃縮（50℃、55r/min）、干燥（65℃）至恒重。將0.5g色素溶解于5mL甲醇中，吸取0.05mL滴于薄層色譜板（20cm×20cm），用乙醇/石油醚（3∶7）做展開劑展開10cm后，層析板轉90°后用甲醇/二氯甲烷（1∶1）做展開劑繼續展開10cm。使用刮刀將紅色色帶刮下，甲醇溶解、過濾，自然干燥得純紅曲紅色素。

1.2.2玉米直鏈和支鏈淀粉的制備取10g淀粉溶于100mL蒸餾水中，90℃糊化20min，放入高壓鍋中120℃高壓（0.1磅/cm2）30min，取出冷卻后放冰箱4℃老化48h。取出老化后淀粉添加0.6mL高溫淀粉酶（200000U/mL）在95℃水解20min后離心（3050×g）得到沉淀為回生淀粉。用4mol/L KOH溶解回生淀粉至飽和溶液，再用6mol/L HCl調節pH至中性。之后添加3倍體積正丁醇攪拌、離心（3050×g）后得到玉米直鏈淀粉。上清液中添加5倍體積無水乙醇攪拌、離心（3050×g）后得到玉米支鏈淀粉［10-11］。

1.2.3含紅曲紅色素玉米回生淀粉制備加9mg左右色素于10mL水中，使整個溶液中色素的吸光度為1.0。色素液分別在淀粉糊化前、糊化后、高壓后三個階段添加。所得含紅曲紅色素的回生淀粉于60℃干燥至恒重后經研磨過120目篩子。

1.2.4紫外光輻射樣品將樣品置于平皿中攤平后，在距離紫外燈（45W）15cm處分別照射0、3、6、9、12、15h，取樣添加甲醇溶出其中色素，加水定容至10mL，測定490nm下吸光度，計算色素殘留率：

色素殘留率（%）=（溶出色素吸光度/1.0）×100

1.2.5紅外光譜分析將5mg淀粉用研缽研成細粉，在120℃干燥箱干燥30min，與200mg KBr混合后壓片，在27℃下采用Bio-Rad FES135紅外分光光度計掃描［10-11］。

1.2.6核磁氫譜分析干淀粉樣品用氘代水于60℃振蕩下溶解至澄清，用Mercury Vx-300 MHz（Varian，USA）核磁共振儀進行分析，氫譜分析頻率300.07MHz，碳譜分析頻率75.45MHz，旋轉角45°，豫延遲時間1s，化學位移以tetramethylsilane（TMS）的化學位移（0）為參考［10-11］。

1.2.7X-射線衍射用銅箔和鎳箔包裹淀粉采用X-射線衍射儀掃描（D-500 Siemens，Madison，WI，USA）。掃描電流和電壓分別為27mA和50kV。掃描衍射角（2θ）從4°到40°，步長為0.05°，間隔時間為2s。

表1　不同輻照時間色素殘留率（%）的變化Table 1　The variation of residual pigment（%）at different radiation time

2　結果與討論

2.1紅曲紅色素添加方式對回生玉米直鏈、支鏈淀粉護色效果的影響

表1為紅曲紅色素以不同方式添加于玉米直、支鏈回生淀粉前后淀粉對色素的光護色效果。由表1可知，經15h輻照，對照組的色素殘留率降低為38.3%，而其他實驗組都在46%以上，最高為糊化前色素加入玉米支鏈淀粉中所得回生淀粉，殘留率達到79.0%。輻照6h高壓后添加色素組中直鏈淀粉組的殘留率最高達到91.8%，輻照12h該組色素殘留率仍能達到81.6%，顯示該組具有很強的護色作用。這是因為所得直、支鏈淀粉均是從回生淀粉中分離出，鏈長分布范圍較窄，鏈長更短，所形成的淀粉雙螺旋結構更不穩定，這樣有利于淀粉鏈游離出來與色素結合。二者結合后，當紫外光照射時，色素吸附的光能部分通過淀粉分散，從而降低了紅曲紅色素光降解的比率。對照組中色素主要以物理方式吸附于大豆蛋白、多肽等物質上，不能轉換色素吸附的光能，因而光照后色素分解比較快。

2.2玉米直、支鏈淀粉與紅曲紅色素混合回生及紫外光輻射的紅外圖譜

圖1為玉米直、支鏈淀粉與紅曲紅色素混合回生及紫外光輻射的紅外光譜。

由圖1a可知，紅曲紅色素在波數為3309cm-1處有明顯紅外吸收，此處吸收為羥基伸縮振動，說明色素結構中確實含有羥基。波數1541cm-1處吸收峰為C-N伸縮振動，可能來源于色素結合的氨基酸。當色素與淀粉混合回生時，如圖1c和圖1f所示，此處吸收消失。說明回生過程淀粉和氨基酸競爭色素的結合部位已將氨基酸替換。波數2930cm-1為亞甲基的C-H伸縮振動，由圖1可知，紅曲紅色素和淀粉均有亞甲基存在，二者混合回生后該處吸收發生微小變化，說明二者之間發生了結合。

由圖1b和圖1e可知，玉米回生淀粉中的直鏈和支鏈淀粉再次回生時，二者的紅外吸收基本沒有差異，這與文獻不同［12］。這主要與本次實驗所用直、支鏈淀粉鏈長和分子量分布范圍比較窄有關，根據文獻［12］，只有聚合度（DP）為10～60的淀粉才能參與回生，這次所用直、支鏈淀粉來自回生玉米淀粉，所以當二者分子量差異減小到一定程度，回生過程淀粉鏈聚合方式就會接近。當淀粉與色素混合回生時（圖1c和f），所得回生淀粉紅外圖譜中明顯具有色素的結構吸收。對比圖1b、e和c、f可知，含色素回生淀粉在3340cm-1附近處的吸收由平滑變尖銳，說明色素添加使回生淀粉中氫鍵形成量減小［13］。這樣的回生淀粉在堿液中更容易分散和溶解。圖1中1618～1636cm-1處吸收峰是水的O-H彎曲振動［14-15］，含色素回生淀粉中這些峰強度更大，說明色素使回生淀粉中含水量增大。這可能是色素羥基與淀粉C6形成氫鍵時，阻礙了淀粉其他部位羥基間形成氫鍵，這些羥基可以和水形成氫鍵，這部分水在干燥過程不會被除去。

對比圖1d、g和c、f可知，紫外光輻射含色素回生直鏈和支鏈淀粉前后，淀粉的紅外吸收沒有發生變化。光照使淀粉在1401cm-1處的吸收增強，該處吸收是淀粉羥基相連碳原子上C-H彎曲振動，該結構中的氫原子可能是色素羥基形成氫鍵的一部分，當色素吸收紫外光能量增大時，氫鍵振動增強引起C-H彎曲振動也增強了。

圖1　玉米直、支鏈淀粉與紅曲紅色素混合回生及其紫外光輻照的紅外光譜Fig.1　IR spectra of retrograded maize amylose/amylopectin mixed with or without monascus red pigments and those samples radiated by ultraviolet light

2.3玉米直、支鏈淀粉與紅曲紅色素混合回生的核磁氫譜

圖2為玉米直、支鏈淀粉與紅曲紅色素混合回生的核磁氫譜。由圖2可知，色素的核磁氫譜化學位移范圍為0.7～4.7ppm，玉米直鏈淀粉的為3.3～5.0ppm。其中4.70ppm處的化學位移代表水分子，色素與淀粉混合形成結合物中仍然含有水［16］。色素中含羥基碳原子上氫原子化學位移為3.4～3.7ppm，而淀粉中5.05ppm是C1和C6碳原子上的氫的化學位移，3.69、3.38、3.31ppm分別代表C2、C3、C4、C5上氫的化學位移，其中C3、C2上氫的化學位移可能重疊在一起［16-18］。色素與淀粉結合后，淀粉的核磁氫譜最大的變化是5.05ppm處的化學位移轉移到4.94ppm，說明色素與淀粉可能通過C1和C6碳原子形成氫鍵。

2.4玉米直、支鏈淀粉與紅曲紅色素混合回生的X-射線衍射

圖3為玉米直、支鏈淀粉與紅曲紅色素混合回生的X-射線衍射。由圖3a可知，含羥基紅曲紅色素晶體衍射峰出現在2θ 27°、31°、45°、56°、66°和75°。圖3b、c、d中尖銳峰2θ 28°、40°、50°、58°、66°、73°是KCl面心立方晶格的衍射峰［19］，這些氯化鉀是溶解玉米直、支鏈淀粉所用氫氧化鉀和中和溶液添加鹽酸反應后產生的。對比圖3b和c，色素與玉米直鏈淀粉結合回生后，直鏈淀粉晶體衍射峰（衍射角為19°）衍射強度變弱，沒有色素衍射峰，而氯化鉀衍射峰增強，說明色素與氯化鉀可能競爭玉米直鏈淀粉的羥基，結合色素的淀粉不容易形成淀粉回生晶體規則衍射峰。圖3e中出現了色素的衍射峰，說明色素與玉米支鏈淀粉結合少，吸附色素在淀粉干燥過程重新結晶析出。結合紅外和核磁分析，玉米直、支鏈淀粉與紅曲紅色素結合部位應該在C1、C6原子上。色素與淀粉結合后色素光褪色減慢的原因可能跟回生淀粉阻光、阻自由基產生、穩定色素結構有關。

圖2　玉米直、支鏈淀粉與紅曲紅色素混合回生的核磁氫譜圖Fig.2　1H NMR spectra of retrograded maize amylose mixed with or without monascus red pigments

圖3　玉米直、支鏈淀粉與紅曲紅色素混合回生X射線衍射Fig.3　X-ray diffraction of retrograded maize amylose/amylopectin mixed with or without monascus red pigments

3　結論

含羥基紅曲紅色素可產生類似金屬鹽晶體的X-射線衍射。玉米直、支鏈淀粉在回生過程可以與含羥基的紅曲紅色素發生氫鍵結合，將色素固定在回生淀粉中，直鏈淀粉比支鏈淀粉固定色素量多。固定色素后的玉米直、支鏈淀粉可結合更多的水。紅曲紅色素與玉米直鏈和支鏈淀粉結合后，盡管淀粉沒有形成規則的晶體結構，但色素與淀粉的結合對紅曲紅色素起到了很好的光護色作用。本文研究結果揭示回生淀粉可以被用作所有含羥基天然色素的光護色劑。

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Discussion of mechanism on monascus red pigments with hydroxyls protected by retrograded maize amylose and amylopectin

DONG Shi-rui1，LIU Li-zeng2，JU Yang3，LIN Xu-hui1，LIAN Xi-jun1，*
（1.The Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，Department of Biological technology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China；2.School of Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China；3.School of Sports and Health，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

The effect of the retrogradation of maize amylose，amylopectin and the adding method of monascus red pigment on the color protection were studied by determining the rest monascus red pigment.The protection mechanism of starch was analyzed by IR，NMR and X-ray diffraction.The results showed that the protective effects of retrogradation of maize amylose and amylopectin on the monascus red pigment were obvious and the retention percentage of monascus red pigment was raised from 38.3%to more than 70%under the 15h of the UV irradiation.In three stages of starch retrogradation such as pasting，autoclaving and retrogradation，addition of monascs red pigment after autoclaving got the best results.The results of NMR，IR and X-ray diffractions indicated that the pigment was combined with the retrograded starch at the C1 and C6 during the retrogradation and the retrogradation of amylose got the better protective effects because amylose could combine with more pigments.

retrograded maize starch；monascus red pigment；color-protection；mechanism

TS231

A

1002-0306（2015）12-0302-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.055

2014－12－03

董世瑞（1973-），男，博士，研究方向：食品科學。

連喜軍（1972-），男，博士，主要從事回生淀粉方面的研究。

國家自然科學基金項目（31271935）資助。