單環(huán)刺螠糖胺聚糖抗凝血機(jī)制初步研究

崔青曼，劉　萍，王　悅，袁春營(yíng)

（天津市海洋資源與化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，天津300457）

單環(huán)刺螠糖胺聚糖抗凝血機(jī)制初步研究

崔青曼，劉萍，王悅，袁春營(yíng)

（天津市海洋資源與化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，天津300457）

采用人乏AT-Ⅲ血漿、乏HCII血漿及兩種肝素輔因子均缺乏的血漿，探討單環(huán)刺螠糖胺聚糖的抗凝血途徑；通過(guò)糾正乏因子血漿所致的凝固時(shí)間延長(zhǎng)的能力測(cè)定人血漿凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ的活性，凝固法測(cè)定纖維蛋白原濃度；體外復(fù)鈣凝血實(shí)驗(yàn)，研究糖胺聚糖對(duì)復(fù)鈣凝血時(shí)間的影響；甲基百里酚藍(lán)比色法測(cè)定大鼠和小鼠血清中鈣離子濃度。結(jié)果表明：?jiǎn)苇h(huán)刺螠糖胺聚糖的抗凝血酶作用主要呈AT-Ⅲ依賴(lài)性，并能夠鈍化肝素輔因子Ⅱ抑制凝血酶的活性；單環(huán)刺螠糖胺聚糖顯著降低血漿凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ的活性（p＜0.05）；糖胺聚糖可通過(guò)屏蔽血液中Ca2+，延長(zhǎng)大鼠血復(fù)鈣凝血時(shí)間，極顯著降低大鼠和小鼠血液中的鈣離子濃度（p＜0.01），且其降低血液鈣離子濃度的作用極顯著優(yōu)于肝素鈉（p＜0.01）。

單環(huán)刺螠，糖胺聚糖，抗凝血機(jī)制

糖胺聚糖（Glycosaminoglycan，GAG）又稱(chēng)氨基多糖，是由氨基己糖和己糖醛酸交替結(jié)合而形成的長(zhǎng)鏈分子，廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)，是蛋白多糖的糖鏈部分，具有抗氧化、抗凝血、抗腫瘤、降血糖等廣泛的生物學(xué)功能［1-6］。單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus），俗名海腸子，屬于螠蟲(chóng)動(dòng)物門(mén)（Echiurioidea）、螠綱（Echiurida）、無(wú)管螠目（Xenopneusta）、刺螠科（Urchidae），是一種長(zhǎng)圓筒形軟體動(dòng)物，分布于俄羅斯、日本、朝鮮和我國(guó)渤海灣等，是我國(guó)北方沿海泥沙岸潮間帶下區(qū)及潮下帶淺水區(qū)底棲生物的常見(jiàn)種。前期研究表明，單環(huán)刺螠糖胺聚糖具有較好的抗凝血作用［7］，為此，本研究從肝素輔因子、凝血因子和鈣離子等多個(gè)方面，探討該糖胺聚糖的抗凝血作用機(jī)制，為單環(huán)刺螠糖胺聚糖進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供良好的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

單環(huán)刺螠糖胺聚糖天津科技大學(xué)應(yīng)用海洋生物研究室提取純化，相對(duì)分子質(zhì)量450.032ku，硫酸根含量為30.26%，糖醛酸含量為25.25%，氨基糖含量為7.58%［7］；人凝血酶（TT）時(shí)間診斷試劑盒、凝血酶原（PT）時(shí)間診斷試劑盒、活化部分凝血活酶（APTT）時(shí)間診斷試劑盒、纖維蛋白原（FIB）測(cè)定試劑、標(biāo)準(zhǔn)血漿、凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ活性測(cè)定試劑盒（凝固法）、乏抗凝血酶-Ⅲ血漿、乏肝素輔因子II血漿和兩種肝素輔因子均缺乏的血漿德國(guó)Siemens Healthcare Diagnostics Inc.；肝素鈉效價(jià)：≥140U/mg，Cat.No.H8060，北京索萊寶科技有限公司；Wister大鼠

SPF級(jí)，體重（163.88±4.51）g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，批號(hào)SCXK-（軍）2012-0004；Km小鼠SPF級(jí)，體重（23.58±1.43）g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，批號(hào)SCXK-（軍）2012-0004。

Allegra X-15R臺(tái)式冷凍離心機(jī)美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；CA-7000全自動(dòng)凝血分析儀日本希森美康株式會(huì)社；TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1糖胺聚糖對(duì)抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）及肝素輔因子Ⅱ（HC-Ⅱ）抑制凝血酶作用的影響標(biāo)準(zhǔn)血漿、乏AT-Ⅲ、乏HC-Ⅱ及兩種肝素輔因子均缺乏的血漿中分別加入糖胺聚糖（1∶10），對(duì)照組加入等體積生理鹽水，糖胺聚糖濃度4mg/mL，預(yù)溫5min后加入預(yù)溫15min的PT和TT試劑，用凝血因子分析儀測(cè)定凝固時(shí)間。

1.2.2糖胺聚糖對(duì)血漿凝血因子活性的影響糖胺聚糖設(shè)置三個(gè)濃度梯度，即50、100、200μg/mL，陽(yáng)性對(duì)照肝素鈉濃度50μg/mL，空白對(duì)照組為同體積生理鹽水。按照凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定其活性，凝固法測(cè)定纖維蛋白原濃度。

1.2.3糖胺聚糖對(duì)大鼠血體外復(fù)鈣凝血時(shí)間的影響

采用10mg/mL和3mg/mL兩種不同質(zhì)量濃度鈣離子，糖胺聚糖濃度分別為1、2、4mg/mL，生理鹽水作為空白對(duì)照，肝素鈉作為陽(yáng)性對(duì)照。大鼠股動(dòng)脈取血，制備抗凝血（5mL血液中加入0.1mL 5%草酸鉀溶液）。0.9mL血液中加入0.1mL不同濃度糖胺聚糖，空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組分別加入等體積生理鹽水和肝素鈉（1mg/mL），然后加入不同濃度的的氯化鈣溶液0.1mL，37℃恒溫水浴，每隔30s將試管輕輕傾斜一次，當(dāng)血液在離心管中不再流動(dòng)時(shí)，記錄下時(shí)間，以秒表示。

1.2.4糖胺聚糖對(duì)大鼠血液中鈣離子濃度的影響選擇雌雄大鼠36只，隨機(jī)分為6組，正常喂養(yǎng)3d后尾靜脈注射糖胺聚糖（1、4、16mg/kg）、肝素鈉（4mg/kg）和生理鹽水，注射量0.5mL，30min后股動(dòng)脈采血，3000r/min離心15min，取上清液，甲基百里酚藍(lán)比色法測(cè)定血清中的鈣離子濃度［8］。

1.2.5糖胺聚糖對(duì)小鼠眼眶后靜脈叢血液中鈣離子濃度的影響分別用1、2、4mg/mL糖胺聚糖、2mg/mL肝素鈉（陽(yáng)性對(duì)照）和生理鹽水（空白對(duì)照）浸泡毛細(xì)吸管24h，烘干備用。60只小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，用處理過(guò)的毛細(xì)管對(duì)小鼠進(jìn)行眼眶后靜脈叢取血0.12mL，置于塑料離心管中，3000r/min離心10min，測(cè)定方法同1.2.4。

1.3數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析。分析軟件為SPSS 17.0，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以mean±SD表示。

2　結(jié)果與分析

2.1糖胺聚糖抗凝血酶活性對(duì)抗凝血酶（AT）Ⅲ和肝素輔因子（HC）Ⅱ的依賴(lài)關(guān)系

標(biāo)準(zhǔn)血漿、乏AT-Ⅲ、乏HC-Ⅱ及兩種肝素輔因子均缺乏的血漿中糖胺聚糖對(duì)血液PT和TT的作用結(jié)果見(jiàn)表1，從表1看出，標(biāo)準(zhǔn)血漿、乏ATⅢ血漿、乏HC-Ⅱ的血漿、兩種因子均缺乏的血漿中加入糖胺聚糖后，TT均極顯著延長(zhǎng)（p＜0.01），除了標(biāo)準(zhǔn)血漿加入糖胺聚糖后PT顯著延長(zhǎng)（p＜0.05）外，其他PT均極顯著延長(zhǎng)（p＜0.01）。與標(biāo)準(zhǔn)血漿加GAG組比較，乏AT-Ⅲ血漿中加入糖胺聚糖后，TT極顯著縮短（p＜0.01），PT極顯著延長(zhǎng)（p＜0.01），兩種肝素輔因子均缺乏的血漿中加入糖胺聚糖后，TT顯著縮短（p＜0.05），乏HC-Ⅱ的血漿中加入糖胺聚糖后PT極顯著延長(zhǎng)（p＜0.01），明顯延長(zhǎng)TT。推測(cè)存在著不同于肝素的抗凝血途徑。

馬西等［9］報(bào)道剌參酸性粘多糖的抗凝血酶作用主要呈AT-Ⅲ依賴(lài)性，也有資料顯示其抗凝血酶作用主要呈HC-Ⅱ依賴(lài)性［10-11］。本研究發(fā)現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)血漿中加入糖胺聚糖后，TT極顯著延長(zhǎng)（p＜0.01），PT顯著延長(zhǎng)（p＜0.05），乏HC-Ⅱ血漿中加入糖胺聚糖后，TT和PT均極顯著延長(zhǎng)（p＜0.01），與標(biāo)準(zhǔn)血漿加入糖胺聚糖比較，乏AT-Ⅲ血漿中加入糖胺聚糖后TT和PT均極顯著縮短（p＜0.01），推測(cè)單環(huán)刺螠糖胺聚糖的抗凝血酶作用主要呈AT-Ⅲ依賴(lài)性。此外，還發(fā)現(xiàn)糖胺聚糖可能具有鈍化肝素輔因子Ⅱ抑制凝血酶活性的作用，因?yàn)榕c標(biāo)準(zhǔn)血漿加入糖胺聚糖比較，乏HC-Ⅱ血漿中加入糖胺聚糖后TT明顯延長(zhǎng)，PT極顯著延長(zhǎng)（p＜0.01）。

表1　糖胺聚糖抗凝血酶活性對(duì)抗凝血酶Ⅲ和肝素輔因子（HC）Ⅱ的依賴(lài)關(guān)系（n=6）Table 1　Effect of glycosaminoglycan on the function of AT-Ⅲand HC-Ⅱinhibiting thrombin activity（n=6）

2.2糖胺聚糖對(duì)血漿凝血因子活性的影響

通過(guò)糾正乏因子血漿所致的凝固時(shí)間延長(zhǎng)的能力來(lái)測(cè)定凝血因子活性。結(jié)果見(jiàn)表2，從表2看出，肝素鈉組血漿纖維蛋白原（FIB）含量明顯低于對(duì)照組，但未達(dá)顯著水平（p＞0.05），不同濃度的糖胺聚糖組FIB含量與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯差異；肝素鈉、糖胺聚糖能夠極顯著降低凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅻ的活性（p＜0.01），肝素鈉和中高濃度的糖胺聚糖能夠極顯著降低凝血因子Ⅺ的活性（p＜0.01），低濃度的糖胺聚糖能夠顯著降低凝血因子Ⅺ的活性（p＜0.05）；且相同濃度下，糖胺聚糖降低凝血因子Ⅱ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ活性的能力極顯著低于肝素鈉（p＜0.01），降低凝血因子Ⅴ、Ⅶ活性的能力明顯低于肝素鈉，降低凝血因子Ⅹ、Ⅷ活性的能力略微高于肝素鈉。

肝素能夠與AT結(jié)合，催化滅活凝血因子Ⅱa、Ⅹa、Ⅸa、Ⅺa和Ⅻa，肝素激活肝素輔因子Ⅱ而直接滅活凝血因子Ⅱa，這是肝素抗凝作用的主要機(jī)制［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，單環(huán)刺螠糖胺聚糖顯著降低血漿凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ的活性（p＜0.05，p＜0.01），推測(cè)由于糖胺聚糖與抗凝血酶Ⅲ結(jié)合，引起AT-Ⅲ構(gòu)象的改變，使AT-Ⅲ的精氨酸殘基更易與凝血因子Ⅶ、Ⅹ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ的絲氨酸殘基結(jié)合，從而滅活或抑制這些凝血因子的活性。糖胺聚糖顯著降低血漿凝血因子Ⅴ、Ⅷ活性的原因可能是該糖胺聚糖與這兩種大分子糖蛋白中的氨基酸結(jié)合，直接抑制兩種因子的活性。糖胺聚糖降低血漿凝血因子Ⅱ的作用較小，推測(cè)是糖胺聚糖對(duì)肝素輔因子Ⅱ的鈍化作用所致。

2.3糖胺聚糖對(duì)大鼠血體外復(fù)鈣凝血時(shí)間的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。與對(duì)照組相比較，肝素鈉中加入3mg/mL和10mg/mL氯化鈣后，能極顯著延長(zhǎng)凝血時(shí)間（p＜0.01），中高濃度糖胺聚糖中加入3mg/mL氯化鈣后，均能顯著延長(zhǎng)凝血時(shí)間（p＜0.05），糖胺聚糖中加入10mg/mL氯化鈣后，明顯延長(zhǎng)凝血時(shí)間，但未達(dá)顯著性水平（p＞0.05）。10mg/mL氯化鈣組與3mg/mL氯化鈣組相比較，對(duì)照組、肝素鈉和糖胺聚糖均極顯著縮短了凝血時(shí)間（p＜0.01）。

表2　糖胺聚糖對(duì)血漿凝血因子的影響（n=6）Table 2　Effect of glycosaminoglycan on coagulation factor activities in plasma（n=6）

Ca2+是血液中極其重要的活性離子，作為凝血因子Ⅳ在凝血過(guò)程中發(fā)揮極其重要的作用［13］。單環(huán)刺螠糖胺聚糖是一類(lèi)富含硫酸基團(tuán)的聚陰離子多糖，對(duì)K+、Na+、Ca2+、Mg2+等具有較大的親和力［7］。本研究證實(shí)，該糖胺聚糖可通過(guò)屏蔽血液中Ca2+，延長(zhǎng)大鼠血復(fù)鈣凝血時(shí)間。

表3　糖胺聚糖對(duì)大鼠體外復(fù)鈣凝血時(shí)間的影響（s，n=6）Table 3　Effect of glycosaminoglycan on blood recalcification time of rats in vitro（s，n=6）

表4　糖胺聚糖對(duì)大鼠血液中鈣離子濃度影響（n=6）Table 4　Effect of glycosaminoglycan on Ca2+concentration in rats blood（n=6）

2.4糖胺聚糖對(duì)大鼠血液中鈣離子濃度的影響

大鼠血液中鈣離子濃度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4，從表4看出，大鼠尾靜脈注射單環(huán)刺螠糖胺聚糖后，血液中鈣離子濃度極顯著降低（p＜0.01），且存在著濃度依賴(lài)關(guān)系，肝素鈉組大鼠血液中鈣離子濃度明顯低于對(duì)照組，但未達(dá)顯著水平（p＞0.05），中高濃度糖胺聚糖組大鼠血液中鈣離子濃度極顯著低于肝素鈉組（p＜0.01）；此外還發(fā)現(xiàn)，單環(huán)刺螠糖胺聚糖降低血液鈣離子濃度的強(qiáng)度極顯著高于肝素鈉（p＜0.01），可能是由于糖胺聚糖的硫酸根含量較高的緣故［7］。

2.5糖胺聚糖對(duì)小鼠眼眶后靜脈叢取血過(guò)程中血液鈣離子濃度的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，從表5看出，不同濃度單環(huán)刺螠糖胺聚糖和肝素鈉均能極顯著降低小鼠血液中鈣離子濃度（p＜0.01），與朱偉等［13］的研究結(jié)果相一致。Goto等［14］曾給犬股動(dòng)脈灌注肝素，發(fā)現(xiàn)血液鈣離子水平下降，且呈劑量依賴(lài)型。此外，發(fā)現(xiàn)不同濃度糖胺聚糖組小鼠血液中鈣離子濃度極顯著低于肝素鈉組鈣離子濃度（p＜0.01），說(shuō)明單環(huán)刺螠糖胺聚糖對(duì)小鼠血液中鈣離子濃度的影響明顯大于肝素鈉。

表5　糖胺聚糖對(duì)小鼠眼眶后靜脈叢血液中鈣離子濃度的影響（n=10）Table 5　Effect of glycosaminoglycan on Ca2+concentration during blood collectin from posterior orbital venous plexus in mice（n=10）

3　結(jié)論

單環(huán)刺螠糖胺聚糖抗凝血的可能機(jī)制是：糖胺聚糖通過(guò)與抗凝血酶Ⅲ結(jié)合，抑制凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ的活性，直接抑制凝血因子Ⅴ和Ⅷ的活性，降低血漿中鈣離子濃度，抑制內(nèi)源性和外源性凝血系統(tǒng)功能，從而完成抗凝血作用。

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Preliminary study on the anticoagulation mechanism of glycosaminoglycan from Urechis unicinctus

CUI Qing-man，LIU Ping，WANG Yue，YUAN Chun-ying
（Tianjin Key Laboratory of Marine Resource and Chemistry，College of Marine Science&Engineering，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

In this paper，the anticoagulation approaches of glycosaminoglycan was studied with AT-III-deficient plasma，HC-II-deficient plasma and both factor-deficient plasma in human.The activities of coagulation factor II，V，VII，VIII，IX，X，XI，XII and the fibrinogen content in human plasma were measured using the solidification method.The influence of glycosaminogly could on blood recalcification time in rats was studied by using recalcification experiment.The Ca2+concentrations in rats and mice serum were measured through methyl thymol blue colorimetric method.The results showed that the antithrombin role of glycosaminoglycan from Urechis unicinctus mainly presented AT-Ⅲ dependency.Glycosaminoglycan could passivate the thrombin inhibitory activity of heparin cofactor II.Glycosaminoglycan significantly reduced the activities of coagulation factor V，VII，X，VIII，IX，XI，XII in the plasma（p＜0.05）.Besides，glycosaminoglycan could extend prolong recalcification time in rats by shielding Ca2+in plasma，and significantly reduced Ca2+concentration in rats and mice serum（p＜0.01）.Glycosaminoglycan reduced the Ca2+concentration in a more intensive way than that of heparin sodium（p＜0.01）.

Urechis unicinctus；glycosaminoglycan；anticoagulation mechanism

TS254.9

A

1002-0306（2015）12-0337-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.063

2014－10－20

崔青曼（1964-），女，博士，教授，主要從事海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用技術(shù)方面的研究。

天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（13JCZDJC29600）。