不同提取方法對鮮食大豆莢膳食纖維抗氧化特性的影響

趙　麗，宋一茉，朱丹實，惠麗娟，王　勃，何余堂，馬　濤，劉　賀（渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州121013）

不同提取方法對鮮食大豆莢膳食纖維抗氧化特性的影響

趙麗，宋一茉，朱丹實，惠麗娟，王勃，何余堂，馬濤，劉賀*
（渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州121013）

以鮮食大豆莢為原料，通過堿法、酶法、超聲輔助酶法及微波輔助酶法提取水溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維，測定其總黃酮含量、還原能力、DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力以研究其抗氧化特性，并與市售大豆膳食纖維作比較。結(jié)果表明，各種方法提取的鮮食大豆莢膳食纖維的總黃酮含量及抗氧化特性均高于市售大豆膳食纖維，鮮食大豆莢水溶性膳食纖維的抗氧化特性高于不溶性膳食纖維，酶法、超聲和微波處理能提高鮮食大豆莢膳食纖維的抗氧化特性。

鮮食大豆莢，膳食纖維，抗氧化

鮮食大豆也稱毛豆或菜用大豆，是指在大豆鼓粒中后期，莢色呈鮮綠時采收食用或加工用的大豆總稱［1］。鮮食大豆中富含優(yōu)質(zhì)蛋白，多種不飽和脂肪酸及卵磷脂，可預(yù)防高血壓、腦中風(fēng)、心臟病等［2］。此外維生素、礦物質(zhì)含量也很豐富，是兼具營養(yǎng)與保健雙重功能的食品，深受消費者喜愛［3］。鮮食大豆莢是鮮食大豆子實脫殼后的副產(chǎn)物，不僅含有大量膳食纖維，還含有天然抗氧化物質(zhì)，如類黃酮化合物等［4］。目前鮮食大豆莢常常被當(dāng)作飼料或廢料丟棄，不僅經(jīng)濟(jì)效益低，浪費資源，也造成了環(huán)境污染。

膳食纖維（dietary fiber，DF）是指在人體內(nèi)難以被小腸內(nèi)源酶消化的碳水化合物或其類似物，可分為水溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）。膳食纖維可有效降低人體罹患癌癥、糖尿病、心血管疾病、胃腸道疾病以及肥胖病的風(fēng)險；同時膳食纖維還具有改善食品品質(zhì)，延長食品貨架期，增強(qiáng)食品生理功能等作用［5］。

近幾年來，圍繞膳食纖維抗氧化活性研究逐漸成為熱點，其清除自由基作用越來越受到研究者的關(guān)注。因為合成的抗氧化劑如丁基羥基茴香醚（BHA）或多或少具有一些安全性問題，所以抗氧化膳食纖維作為一種有潛力的抗氧化劑，在許多食品中已有應(yīng)用，能夠部分取代合成抗氧化劑的作用［6］。歐仕益通過實驗證明，SDF和IDF都有清除自由基的功效，起作用的主要是DF中含有的多酚類物質(zhì)［7］。目前尚未見到鮮食大豆莢膳食纖維抗氧化特性的研究報道。本文以鮮食大豆莢為原料，用不同方法提取鮮食大豆莢膳食纖維，并研究了其對體外抗氧化特性的影響，以期為鮮食大豆莢膳食纖維功能性食品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

東北有機(jī)大豆朝陽本色有機(jī)食品有限公司提供；市售大豆膳食纖維陜西慈緣生物技術(shù)有限公司；1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH） 美國Sigma公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品阿拉丁試劑有限公司；α-淀粉酶（3000 U/g）、中性蛋白酶（70000 U/g）北京鴻潤寶順科技有限公司；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、水楊酸、硫酸亞鐵等均為分析純。

UV-2550紫外分光光度計日本島津公司；SL-250A高速多功能粉碎機(jī)浙江省永康市松青五金廠；L-535R離心機(jī)長沙湘儀離心機(jī)有限公司；RE3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；SK6210HP超聲波清洗器上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；格蘭仕WD800G型微波爐順德市格蘭仕微波爐電器有限公司；DHG-9055A電熱鼓風(fēng)干燥箱、DK-8D電熱恒溫水槽上海一恒科技有限公司；AR224CN電子天平奧豪斯儀器（上海）有限公司；PHS-3C精密pH計上海雷磁儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1鮮食大豆莢膳食纖維的制備

1.2.1.1堿法鮮食大豆莢20 g→干燥粉碎→加入25倍體積水→用NaOH調(diào)pH12.0，堿解1 h→3000 r/min離心20 min→過濾→濾液→真空濃縮→4倍乙醇沉淀24 h→干燥→SDF［8］。↓

濾渣→干燥→IDF

1.2.1.2酶法鮮食大豆莢20 g→干燥粉碎→加入25倍體積水→調(diào)pH6.0→1%α-淀粉酶50℃酶解30 min→調(diào)pH7.0→1%中性蛋白酶50℃酶解30 min→滅酶→3000 r/min離心20 min→過濾→濾液→真空濃縮→4倍乙醇沉淀24 h→干燥→SDF［9］。↓

濾渣→干燥→IDF

1.2.1.3超聲輔助酶法鮮食大豆莢20 g→干燥粉碎→加入25倍體積水→調(diào)pH6.0→加1%α-淀粉酶→超聲波處理100W，50℃，30min→調(diào)pH7.0→1%中性蛋白酶50℃酶解30min→滅酶→3000 r/min離心20 min→過濾→濾液→真空濃縮→4倍乙醇沉淀24 h→干燥→SDF［10］。 ↓

濾渣→干燥→IDF

1.2.1.4微波輔助酶法鮮食大豆莢20 g→干燥粉碎→加入25倍體積水→調(diào)pH6.0→加1%α-淀粉酶→微波處理320 W，50℃，30 min→調(diào)pH7.0→1%中性蛋白酶50℃酶解30 min→滅酶→3000 r/min離心20 min→過濾→濾液→真空濃縮→4倍乙醇沉淀24 h→干燥→SDF［11］。 ↓

濾渣→干燥→IDF

1.2.2抗氧化活性成分的提取與測定

1.2.2.1抗氧化活性成分的提取取2 g鮮食大豆莢膳食纖維及大豆膳食纖維樣品，用70%乙醇溶液，料液比1∶50（g/mL），于70℃恒溫水浴鍋中浸提6 h［12］，抽濾后取濾液定容至100 mL。

1.2.2.2總黃酮含量的測定采用Al（NO3）3法測定［13］，稍作改動。分別取0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇補(bǔ)足體積至10 mL，加50 g/L亞硝酸鈉溶液1.0 mL，混勻，放置6 min；加100 g/L硝酸鋁溶液1.0 mL，混勻，放置6 min；加200 g/L氫氧化鈉溶液4.0 mL，再加70%乙醇至25 mL，搖勻，放置15 min。以試劑空白調(diào)節(jié)零點，在波長510 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或計算回歸方程。以樣品提取液的吸光度通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其總黃酮含量。

1.2.3抗氧化活性的測定

1.2.3.1還原能力的測定采用Oyaizu［14］的方法，略加改動，取0.2 mL樣品溶液，加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.6）和2.5 mL 1%鐵氰化鉀，于50℃水浴20 min后快速冷卻，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，取2.5 mL此溶液加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1% FeCl3，靜置10 min后于波長700 nm處測定吸光度，以市售大豆膳食纖維為參照。吸光度越高，抗氧化性越好，表明還原能力越強(qiáng)。

1.2.3.2DPPH自由基清除能力的測定按照Shimada等［15］的方法進(jìn)行。取2 mL提取液置于反應(yīng)管中，加入0.1 mmol/L DPPH無水乙醇溶液2 mL，混勻后室溫避光反應(yīng)30 min，以2 mL 70%的乙醇與2 mL無水乙醇混合物為空白，在517 nm處測定其吸光度，以市售大豆膳食纖維為參照。按照下式計算清除率，清除率越大，抗氧化能力越強(qiáng)。

式中：A1—樣品組；A2—樣品對照組（無水乙醇代替DPPH）；A0—模型對照組（70%的乙醇代替樣品液）。

1.2.3.3羥自由基清除能力的測定采用Fenton反應(yīng)體系模型［16］，試管中按順序加入2 mL 6 mmol/L水楊酸－無水乙醇、2 mL 6 mmol/L FeSO4、1 mL稀釋50倍的樣品液、0.1 mL 6 mmol/L H2O2溶液，37℃水浴30 min，以蒸餾水作為空白，于波長510 nm處測定吸光度，以市售大豆膳食纖維為參照。按照下式計算清除率，清除率越大，抗氧化能力越強(qiáng)。

式中：A1—樣品組；A2—樣品對照組（蒸餾水代替H2O2）；A0—模型對照組（70%的乙醇代替樣品液）。1.2.4統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)平行測定3次，結(jié)果以表示，采用Origin（OriginPro 8.6.0 SR1）軟件作圖，應(yīng)用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，差異顯著性水平為p＜0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1總黃酮含量

總黃酮含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.4666x－0.0096，R2=0.9981。式中：y為吸光度，x為蘆丁的質(zhì)量/（mg）。黃酮類是通過酚羥基與自由基R·反應(yīng)，形成共振穩(wěn)定半醌式自由基結(jié)構(gòu)，從而終止自由基反應(yīng)，實現(xiàn)抗氧化作用［17］。一些研究表明樣品的抗氧化性大多隨著總黃酮、異黃酮等含量增加而增加［18］。因此，它可初步評價樣品是否具有抗氧化性。鮮食大豆莢膳食纖維及市售大豆膳食纖維中總黃酮含量見圖1。

圖1　總黃酮含量測定結(jié)果Fig.1　Total flavonoid content in different samples

由圖1可知，各種方法提取的鮮食大豆莢膳食纖維中總黃酮含量均高于市售大豆膳食纖維，鮮食大豆莢水溶性膳食纖維中總黃酮含量比不溶性膳食纖維高。經(jīng)酶法提取、超聲處理、微波處理后的膳食纖維中總黃酮含量均較堿法有所提高，其中酶法提取SDF和IDF總黃酮含量的總量最高，兩者之和達(dá)到5.27 mg/g，因為酶法能有效去除原料中淀粉、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，提高膳食纖維中黃酮類物質(zhì)含量［12］。

2.2還原能力

還原能力的測定是以樣品是否為良好的電子供體為指標(biāo)，還原能力大的樣品是良好的電子供體，其供應(yīng)的電子不僅能使Fe3+還原成Fe2+，同時能與自由基反應(yīng)，使自由基成為較為穩(wěn)定的物質(zhì)，從而中斷自由基連鎖反應(yīng)［19］。鮮食大豆莢膳食纖維及市售大豆膳食纖維的還原能力見圖2。

圖2　還原能力的測定結(jié)果Fig.2　Reducing power of different samples

由圖2可知，還原能力與總黃酮含量呈正相關(guān)（r=0.946），酶法能顯著地提高水溶性膳食纖維的還原能力（p＜0.05），達(dá)到0.407，其還原能力較市售大豆膳食纖維提高了89.3%，微波輔助酶法提取SDF還原能力（0.394）次之。對于不溶性膳食纖維，微波輔助酶法提取IDF還原能力最高，達(dá)到0.323，與超聲輔助酶法IDF沒有顯著性差異（p＞0.05）。微波萃取的機(jī)制是細(xì)胞內(nèi)極性成分如水吸收了微波能后壓力迅速增加導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞［20］，最終影響其還原能力，但是，需要進(jìn)一步研究確定抗氧化機(jī)制。

2.3DPPH自由基清除能力

DPPH在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，被廣泛用于測定待測樣品對自由基的清除能力。待測樣品向DPPH自由基轉(zhuǎn)移電子或氫原子，使其轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的分子1，1-二苯基-2-苦味酰肼。其乙醇溶液由紫色變成黃色，顏色變淺的程度代表清除DPPH自由基能力的大小［21-23］。鮮食大豆莢膳食纖維及市售大豆膳食纖維清除DPPH自由基的能力見圖3。

圖3　DPPH自由基清除能力測定結(jié)果Fig.3　DPPH radical scavenging ability of different samples

由圖3可知，清除DPPH自由基能力與總黃酮含量呈正相關(guān)（r=0.801），各種方法提取的鮮食大豆莢膳食纖維清除DPPH自由基的能力較市售大豆膳食纖維都有很大提高，其中超聲輔助酶法提取SDF清除能力最高，達(dá)到87.37%，是市售大豆膳食纖維的3倍多，酶法提取SDF清除能力（86.49%）次之，兩者無顯著性差異（p＞0.05）。對于不溶性膳食纖維，超聲輔助酶法提取IDF清除能力最高，達(dá)到78.16%，微波輔助酶法提取IDF（74.47%）次之。超聲提取的膳食纖維中含有較多的C-H鍵和游離羥基［24］，導(dǎo)致膳食纖維供氫能力增加，清除DPPH自由基的能力增大。由此可見，鮮食大豆莢膳食纖維是一種良好的DPPH自由基清除劑。

2.4羥自由基清除能力

·OH是毒性最強(qiáng)的活性氧，可直接損壞生物膜，導(dǎo)致一系列疾病的產(chǎn)生和輻射損傷。它可與活細(xì)胞中的任何分子發(fā)生反應(yīng)而造成損傷，特別是嘧啶和嘌呤［22］。它的大量產(chǎn)生是中毒的重要特征，因此清除羥自由基是預(yù)防各種疾病的有效途徑［25］。鮮食大豆莢膳食纖維及市售大豆膳食纖維清除羥自由基的能力見圖4。

圖4　羥自由基清除能力測定結(jié)果Fig.4　Hydroxyl radial scavenging ability of different samples

由圖4可知，清除·OH能力與總黃酮含量呈正相關(guān)（r=0.919），酶法提取SDF對·OH的清除率最高（p＜0.05），為34.04%，較堿法SDF提高了62.48%；超聲輔助酶法提取SDF對·OH的清除作用也很大，達(dá)到了26.46%。對于不溶性膳食纖維，酶法提取IDF清除能力最高，達(dá)到22.76%，較堿法IDF提高了38.27%；超聲輔助酶法提取IDF（21.90%）次之，兩者無顯著性差異（p＞0.05）。說明超聲法和酶法都能有效地清除·OH，其糖基上特別是糖醛酸分子中的活躍羥基能夠與·OH結(jié)合生成水從而清除自由基，而堿法能中和膳食纖維分子中的糖醛酸分子生成鹽，從而降低其抗氧化活性［24］。

3　結(jié)論

3.1各種方法提取的鮮食大豆莢膳食纖維的總黃酮含量及抗氧化特性均高于市售大豆膳食纖維，鮮食大豆莢水溶性膳食纖維的抗氧化特性高于不溶性膳食纖維，酶法、超聲處理、微波處理的鮮食大豆莢膳食纖維中總黃酮含量較堿法均有不同程度的增加，并且均提高了還原能力、DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力等抗氧化能力。

3.2鮮食大豆莢膳食纖維具有一定的抗氧化活性，有可能作為功能性食品基料添加到面包、餅干、糕點等食品中，既可增加食品中膳食纖維的含量，又可以起到抗氧化的作用。但是，鮮食大豆莢膳食纖維中起到抗氧化作用的成分，以及各種成分的種類和含量差異，還有待進(jìn)一步的研究。

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Effect of different extraction methods on antioxidant properties of dietary fiber from vegetable soybean pods

ZHAO Li，SONG Yi-mo，ZHU Dan-shi，HUI Li-juan，WANG Bo，HE Yu-tang，MA Tao，LIU He*
（College of Food Science and Technology，Bohai University，F(xiàn)ood Safety Key Lab of Liaoning Province，National&Local Joint Engineering Research Center of Storage，Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products，Jinzhou 121013，China）

The antioxidant properties of soluble and insoluble dietary fiber from vegetable soybean pods extracted with alkali，enzymes，ultrasonic-assisted-enzymes and microwave-assisted-enzymes were studied in this paper.For the antioxidant properties，the total flavonoid content，reducing power，the scavenging ability to DPPH radical and the scavenging ability to hydroxyl radical were determined，compared with commercial soybean dietary fiber.The results showed that the total flavonoid content and the antioxidant properties of dietary fiber from vegetable soybean pods were higher than dietary fiber from commercial soybean.The antioxidant properties of soluble dietary fiber from vegetable soybean pods were higher than insoluble dietary fiber.Enzymes，ultrasonic treatment and microwave treatment could improve the antioxidant properties of dietary fiber from vegetable soybean pods.

vegetable soybean pods；dietary fiber；antioxidant properties

TS209

A

1002-0306（2015）20-0155-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.024

2015－01－20

趙麗（1990－），女，在讀碩士研究生，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程，E-mail：xiaoni900509@163.com。

劉賀（1979－），男，博士，教授，研究方向：食品大分子的結(jié)構(gòu)與功能及其修飾，E-mail：liuhe2069@163.com。

國家自然科學(xué)基金面上項目（31471621）；國家自然科學(xué)基金青年基金項目（31201385）；遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計劃（LR2014034）。