小麥麩皮抗凍蛋白的純化及理化性質的研究

金周筠，劉寶林（上海理工大學醫療器械與食品學院，生物系統熱科學研究所，上海200093）

小麥麩皮抗凍蛋白的純化及理化性質的研究

金周筠，劉寶林*
（上海理工大學醫療器械與食品學院，生物系統熱科學研究所，上海200093）

本文純化了一種小麥麩皮抗凍蛋白，并對其氨基酸組成、二級結構進行了分析。采用粗分離、飽和硫酸銨沉淀、離子交換色譜（DEAE-cellulose-26）、凝膠過濾色譜（Sephadex G75）四步對其進行純化，純化倍數為449.99倍，產率為4.17%，分子量為11.2 ku，熱滯活性為0.169℃（5 mg/mL）。氨基酸組成結果表明：其甘氨酸含量較高（52.08 mol%），親水性好。將其與幾種常見抗凍糖蛋白進行相關性分析，推斷其是一種與冷誘導相關的蛋白。采用傅里葉紅外光譜檢測，獲得其二級結構為：α-螺旋：25.96%～26.52%，β-折疊：21.69%～23.78%，β-轉角：35.31%～37.61%，無規卷曲：13.69%～15.08%。

抗凍蛋白，純化，熱滯活性，氨基酸組成，二級結構

抗凍蛋白（AFP）是一種能夠抑制冰晶生長和重結晶的蛋白，具有熱滯活性（THA）。熱滯活性是指在結晶過程中，冰點與熔點之間的溫度差異。熱滯活性對確定所提取的蛋白是否為抗凍蛋白有指導意義。1992年，Griffith第一次明確提出獲得植物內源抗凍蛋白，從經低溫鍛煉能夠忍受細胞外結冰的冬黑麥葉片質外體中純化得到了該蛋白［1］。目前，多種植物抗凍蛋白已被分離純化和表征，包括冬黑麥（Secalecereale L.）、胡蘿卜（Daucus carota）、沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）等［2］。

抗凍蛋白在冷凍食品行業內有廣闊的應用前景，在GB 2760-2011中被列為新型食品添加劑，可用于冷凍食品的生產，但高昂的價格［3］，嚴重制約了其在食品工業中的應用。我國作為小麥生產大國，每年僅小麥加工副產物—小麥麩皮的產量即達2000萬噸以上。小麥麩皮因其資源豐富、營養價值高等優點，已廣泛利用于健康食品、副產品開發等多種方面；但其在抗凍蛋白開發方面的報道仍較少。從中提取出高活性、制備兼顧低成本、適合大規模生產且安全性高等優點的抗凍蛋白，是一個很有潛力的項目。

本文采用小麥麩皮為原材料制備粗提wbAFP，采用傳統工藝方法，經四個步驟：粗分離、飽和硫酸銨沉淀、離子交換色譜法、凝膠過濾色譜法，對wbAFP進行純化，分析其氨基酸組成，并與其他常見抗凍蛋白進行比較。為進一步了解該wbAFP的抗凍機理，本文借助傅里葉紅外光譜儀，測定了該小麥麩皮抗凍蛋白的二級結構，確定了其二級結構的范圍，對其二級結構進行了初探。該研究對于小麥麩皮的再利用及抗凍蛋白的生產都具有較好的實踐意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

小麥麩皮產于上海市崇明縣堡鎮小漾村，蛋白質含量14.22%，水分含量11.82%，總灰分4.52%，粉碎過100目篩，常溫下儲藏備用；低分子量標準蛋白Marker碧云天生物技術研究所；透析膜（MWCO 3.5 ku）美國Spectrumlabs公司；DEAE-cellulose-26柱、Sephadex G75柱美國GE公司；牛血清白蛋白、硫酸銨、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、丙烯酰胺、甘油、β-巰基乙醇、溴酚藍、甲醇、冰醋酸、考馬斯亮藍G250等上海國藥集團化學試劑有限公司。

Mini Trans-Blot Cell型垂直電泳儀美國Bio-Rad公司；Pyris Diamond差示掃描量熱儀美國Perkin-Elmer公司；ATKA purifier 100UPC型蛋白純化儀美國GE公司；L-8900型自動氨基酸分析儀日本Hitachi公司；VERTEX 70型傅里葉紅外光譜儀德國Bruker公司；PyrisⅠ型熱重分析儀美國Perkin-Elmer公司。

1.2小麥麩皮抗凍蛋白的分離純化

參考前人方法稍作改動［4］。

1.2.1粗分離稱取100 g小麥麩皮溶于750 mL磷酸鹽緩沖液（PBS 30 mmol/mL、pH7.8）中，攪拌4 h，然后在25℃、5000 r/min條件下離心15 min，獲得上清液。

1.2.2飽和硫酸銨沉淀上清液用100%飽和硫酸銨溶液在室溫下沉淀12 h，然后在25℃、5000 r/min條件下離心15 min。沉淀復溶于蒸餾水中，并用截流相對分子質量3.5 ku的透析膜（MWCO）對純水透析12 h、冷凍干燥得凍干粉。

1.2.3離子交換色譜法純化將經飽和硫酸銨沉淀的凍干粉100 mg復溶于5 mL 10 mmol/mL PBS（pH7.8）中，溶液用DEAE柱（2.6 cm×18 cm）以2 mL/min的速度用0～1.0 mol/L的NaCl梯度洗脫，柱子預先用10 mmol/mL PBS（pH7.8）平衡。檢測波長為280 nm。收集顯示熱滯活性的洗脫峰，用截流相對分子質量3.5 ku的透析膜（MWCO）對純水透析12 h、凍干。

1.2.4凝膠過濾色譜法純化將經離子交換色譜法純化的凍干粉50 mg復溶于3 mL 10 mmol/mL PBS（pH7.8）中，溶液用Sephadex柱（1.5 cm×50 cm）以0.2 mL/min的速度用0.9%NaCl洗脫，柱子預先用0.9%NaCl平衡。檢測波長為280 nm。收集顯示熱滯活性的洗脫峰，用截流相對分子質量3.5 ku的透析膜（MWCO）對純水透析12 h、凍干。凍干后的粉末即為高純度的wbAFP。

1.3純化參數的測定

將產率和純化倍數作為純化過程的主要參數。將粗分離蛋白的質量設為100%，后續純化步驟獲得的抗凍蛋白的質量與其的比值，即為產率。參照酶的比活力定義，將單位質量的wbAFP的熱滯活性定義為特異性熱滯活性（specific THA，THAs）；將粗分離蛋白的THAs設為100%，后續純化步驟獲得的抗凍蛋白的THAs與其的比值，即為純化倍數。

1.4熱滯活性測定

采用DSC法，參照陳廷超等的方法稍作改動［5］。將10 μg樣品（濃度為5 mg/mL）密封于鋁制坩堝中，放置在樣品池中央，降溫至-30℃，然后升溫至25℃，再降溫至-30℃。接著，緩慢升溫至樣品體系為固液混合物狀態，稱為保留溫度（Th），停留2 min，再將溫度從Th降低至-30℃，重復上述過程，在不同的Th下停留2 min。記錄不同Th下，樣品結晶的起始溫度（T0），上述過程中升降溫的速率均為1.0℃/min。熱滯活性參照如下公式計算：

1.5蛋白質分子量的測定

電泳參照LaemmLi的不連續系統［6］，并稍作改進。按照1∶1（體積分數）的比例將樣品與樣品緩沖液充分混合，沸水浴5 min。濃縮膠濃度為4%，分離膠為15%。樣品分別在80 V和120 V的恒壓條件下遷移，總電泳時間約120 min。電泳結束后，凝膠在考馬斯亮藍染色液中染色約1 h，然后脫色至凝膠背景接近無色。

1.6氨基酸組成的測定

將150 mg經四步純化脫鹽后的抗凍蛋白樣品定容至100 mL，用6 mol/L的鹽酸溶液在110℃下真空水解24 h。借助自動氨基酸分析儀測定氨基酸組成，與標準氨基酸的洗脫峰進行一一對比、指認，求得氨基酸的組成。

1.7氨基酸相關性比較

參考Chou等［7］建立的以氨基酸殘基的百分比組成為基礎的統計方法。該方法認為：同一類蛋白質有相似的組成。搜索已在文獻中報道的具有抗凍活性的蛋白，將其編號輸入NCBI數據庫（www.ncbi.nlm. nih.gov），獲得各種抗凍蛋白的氨基酸組成，與小麥麩皮抗凍蛋白的氨基酸數量進行對比。相關系數大于0.05的定義為無相關，小于0.05的定義為弱相關，小于0.01的定義為強相關。

1.8傅里葉紅外光譜檢測

電氣是電能的生產、傳輸、分配、使用和電工裝備制造等學科或工程領域的統稱。電氣工程專業是電能，電氣設施與電氣技術為門徑來建造，保持和完善有限制性范圍與情景的一門課程，包含了電能的轉變，利用與探究三個內容，包含基本理論、運用技能、設施設備等；電氣工程是當今科技區域里的中心科學的一部分，也是如今高新技術區域里不能漏掉的關聯學科。也是電子技術的重大進展才拉動了以計算機網絡為背景的信息時代的來臨，并且轉變了人們的生活和工作方式。電氣工程的發展前景同樣很有潛力，使得當今的學生就業比率一直很高。

將高純度的wbAFP置于干燥器中充分干燥20 min，稱取1 mg樣品與100 mg溴化鉀研磨后充分混合，壓制成1 mm厚的圓形薄片，置于樣品池中進行傅里葉紅外光譜檢測。儀器進行空氣、水蒸氣校正，用純溴化鉀壓片做空白樣品。測定波數為4000～400 cm-1，分辨率為0.4 cm-1，掃描次數16次。

將原始圖譜進行減差，減差原則為使2200～1800 cm-1范圍內呈一條直線。取酰胺Ⅰ帶（1700～1600 cm-1）和酰胺Ⅲ帶（1340～1220 cm-1）為研究對象，采用Peakfit 4.12軟件進行分析。首先對圖譜段進行5點平滑處理，后進行兩點基線校正，做二階導數和傅里葉去卷積，采用高斯函數對圖譜進行多次擬合，使殘差最小，不同譜帶完全分離，根據其積分面積計算各類二級結構的相對百分含量。

1.9數據處理

使用Microsoft Excel 2007進行數據處理及分析。

2　結果與分析

2.1分離純化過程的分析

小麥麩皮抗凍蛋白的純化經四個步驟：粗分離、飽和硫酸銨沉淀、離子交換色譜、凝膠過濾色譜。對各部分產物的各項指標進行測定，結果見表1。結果表明：蛋白純化倍數為449.99倍，產率為4.17%。

表1　小麥麩皮抗凍蛋白純化過程的參數變化Table 1　Parameters changes of purification peocess of wbAFP

在另一篇文章中，作者已考察了飽和硫酸銨濃度對熱滯活性的影響，本文不再贅述。離子交換色譜法易受樣品鹽濃度的影響，鹽濃度過高，會導致各組分提前被洗脫。因此，必須對上樣的樣品進行脫鹽處理。將樣品進行離子交換色譜操作后，共出現7個洗脫峰，依次編號為P1～P7（詳見圖1、表2）。

圖1　小麥麩皮抗凍蛋白的離子交換圖譜Fig.1　Anion-exchange chromatography profile of wbAFP

表2　小麥麩皮抗凍蛋白離子交換色譜步驟的參數變化Table 2　Parameters changes of anion-exchange chromatography of wbAFP

根據圖1所示，P1的頂峰位置所對應的NaCl濃度為0 mol/L，即P1的出峰位置在NaCl梯度洗脫開始之前，有可能是因為蛋白未能吸附在色譜柱上。NaCl洗脫濃度達到0.75 mol/L之后，未洗脫出任何峰，可認為洗脫完全。其中P1、P3顯示出了熱滯活性，其熱滯活性分別為0.097、0.135℃；其他洗脫峰的熱滯活性極低，可認為是未檢出。

圖2　P1峰的凝膠過濾色譜圖譜Fig.2　Size-exclusion chromatography profile of fraction P1

圖3　P3峰的凝膠過濾色譜圖譜Fig.3　Size-exclusion chromatography profile of fraction P3

表3　小麥麩皮抗凍蛋白凝膠過濾色譜步驟的參數變化Table 3　Parameters changes of size-exclusion chromatography of wbAFP

表3顯示，次級峰P12、P32顯示了熱滯活性，而P11和P31未顯示出活性。同時，P32的活性稍大于P12的活性（分別為0.177、0.161℃）。由于其本底存在差異，P1和P3在進行凝膠過濾色譜分離時，在基線位置存在較大差異，但并不影響其洗脫。由圖2、圖3可知，P12、P32的保留時間不同（47.44 min和56.64 min），但由于其洗脫條件完全相同，因此猜測這兩個洗脫產物為同一種蛋白，而隨后的電泳結果（圖4）證明了這一猜測，該蛋白的分子量為11.2 ku。

圖4　小麥麩皮抗凍蛋白的電泳結果Fig.4　SDS-PAGE of purified wbAFPs

該抗凍蛋白的熱滯活性在5 mg/mL時為0.169℃，與植物源抗凍蛋白的活性相近（0.1～0.6℃）［8］。Duman報道，歐白英（Solanum dulcamara）抗凍蛋白的熱滯活性在濃度為10～35 mg/mL時為0.3℃［9］。張超等在研究胡蘿卜（Daucus carota）時發現，其熱滯活性在濃度1 mg/mL時為0.1℃［10］。不同種類的抗凍蛋白在不同濃度處顯示其最高的熱滯活性，這可能與其本身的特性有關。由于抗凍蛋白能非依數性地降低溶液的冰點，因此，溶液的濃度對其活性會產生一定的影響。抗凍蛋白的純度對其活性也有重要影響。表1顯示經硫酸銨沉淀的抗凍蛋白的熱滯活性為0.020℃，而經過離子交換色譜、凝膠過濾色譜步驟后，其熱滯活性達到了0.169℃，這時的純化倍數已達449.99倍。

2.2氨基酸組成分析

氨基酸組成分析結果見表4。由于采用酸水解，天冬酰胺（Asn）被水解，以天冬氨酸（Asp）形式出現，因此，天冬酰胺（Asn）顯示未檢出，含量為0。同理，谷氨酰胺（Gln）也以谷氨酸（Glu）形式出現，含量為0。色氨酸在酸水解過程中，吲哚環被破壞，因此為未檢出，含量為0。為檢測色氨酸含量，又采用堿水解法，在290 nm處檢測色氨酸含量，其含量極低，可以忽略。

表4　小麥麩皮抗凍蛋白的氨基酸組成Table 4　Amino acid composition of wbAFP

假如在該蛋白中，含量最少的氨基酸（Met）僅出現1次，該蛋白應有152個殘基。這些殘基的分子量總和應為14.22 ku，經過脫水縮合反應，該蛋白的分子量理論上應為11.502 ku，與電泳結果相似（11.2 ku）。

在20種天然氨基酸中，有8種是必須氨基酸，分別為：異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、賴氨酸（Lys）、甲硫氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、蘇氨酸（Thr）、色氨酸（Trp）、纈氨酸（Val），這8種必須氨基酸在該小麥麩皮抗凍蛋白中的總含量達14.32 mol%，含量較高，說明該蛋白有很高的利用價值。

根據側鏈基團的極性，氨基酸一般分為非極性氨基酸和極性氨基酸。非極性氨基酸又稱為疏水氨基酸。除丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）、脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、甲硫氨酸（Met）外，其余12種天然氨基酸均為親水氨基酸。根據氨基酸分析結果可知，該小麥麩皮抗凍蛋白富含大量親水氨基酸，尤其是甘氨酸（Gly），含量達52.08 mol%，各類親水氨基酸總量達82.3 mol%，可認為該蛋白具有很好的親水性。有文獻報道，大部分AFP都具有較高的親水性［11］。Graham等也發現，一種來源于昆蟲的抗凍蛋白有較強的親水性［12］。來源胡蘿卜的一種抗凍蛋白也有很高的親水性［13］。

表5　小麥麩皮抗凍蛋白與幾種抗凍蛋白的相關系數Table 5　Character correlation coefficients for wbAFP and other AFPs

2.3氨基酸相關性分析

由表5可知，經比較發現，該小麥麩皮抗凍蛋白與Q75QN9，一種來源于小麥的富甘氨酸冷休克蛋白相關性較高。同時，該蛋白與另一種來源于胡蘿卜（Daucus carota）的富甘氨酸RNA結合蛋白Q03878［10］相關性也較高。這兩種蛋白都與冷誘導相關。

同時，將該抗凍蛋白與幾種常見的抗凍糖蛋白：Q9DFU2（Gymnodraco acuticeps）、Q1AMQ0（Eleginus gracilis）、Q8S5Z3（Oryza sativa）［7］進行比較，基本無相關性。另一方面，該抗凍蛋白與P43650，這種同樣提取自小麥，但非冷誘導蛋白相關性較低。由此可推斷，該抗凍蛋白是一種與冷誘導相關［14］的蛋白。

2.4傅里葉紅外光譜分析

圖5是該抗凍蛋白在4000～400 cm-1范圍內的傅里葉紅外光譜圖。其在酰胺Ⅰ帶（1700～1600 cm-1）和酰胺Ⅲ帶（1340～1220 cm-1）中的圖譜解析結果詳見圖6～圖8。

圖5　小麥麩皮抗凍蛋白的傅里葉紅外光譜圖Fig.5　FT-IR spectra of wbAFP

圖6　酰胺Ⅰ帶的高斯曲線擬合圖譜Fig.6　Gaussian fitting curves in amideⅠregion

圖7　酰胺Ⅲ帶的高斯曲線擬合圖譜Fig.7　Gaussian fitting curves in amideⅢregion

表6　小麥麩皮抗凍蛋白的傅里葉紅外光譜測定二級結構Table 6　Secondary structure of wbAFP determined by FT-IR spectra

根據文獻報道［15-17］，在酰胺Ⅰ帶中，1650～1660 cm-1是α-螺旋的特征吸收峰，1610～1640 cm-1是β-折疊的特征吸收峰，1660～1700 cm-1是β-轉角的特征吸收峰，在酰胺Ⅰ帶中，α-螺旋與無規卷曲特征吸收峰（1640～1650 cm-1）相鄰，易于混淆。同樣地，在酰胺Ⅲ帶中，1330～1290 cm-1是α-螺旋的特征吸收峰，1250～1220 cm-1是β-折疊的特征吸收峰，1295～1265 cm-1是β-轉角的特征吸收峰，1270～1245 cm-1是無規卷曲的特征吸收峰。其中，1245～1250、1265～1270、1290～ 1295 cm-1這3個區域是相鄰二級結構的交蓋區，在其特征峰歸屬方面需注意，視具體情況而定。因此，將酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅲ帶相結合，將更有利于分析蛋白的二級結構。

在酰胺Ⅰ帶的譜帶中，在α-螺旋與無規卷曲特征吸收峰的交界處，對區分其歸屬存在一定困難，在酰胺Ⅲ帶中，由于α-螺旋與無規卷曲的特征吸收峰相距較遠，其歸屬區分相對容易［18］。1649 cm-1處的特征峰恰處于酰胺Ⅰ帶的譜帶的α-螺旋與無規卷曲特征吸收峰的交界處。由酰胺Ⅲ帶的峰歸屬可知，該抗凍蛋白的無規卷曲含量在15%左右，因此，將1649 cm-1處的特征峰劃分為無規卷曲。

在酰胺Ⅲ帶的譜帶中，1296 cm-1處的特征峰在α-螺旋與β-轉角特征吸收峰的交界處，結合酰胺Ⅰ帶的峰歸屬，應將其劃分為β-轉角的峰。

根據峰歸屬情況，在酰胺Ⅰ帶中，α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規卷曲的比例為26.52%、23.78%、35.31%、13.69%；在酰胺Ⅲ帶中，α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規卷曲比例為25.96%、21.69%、37.61%、15.08%。

綜合分析，該抗凍蛋白的二級結構為：α-螺旋：25.96%～26.52%，β-折疊：21.69%～23.78%，β-轉角：35.31%～37.61%，無規卷曲：13.69%～15.08%。

3　結論

本文研究了一種小麥麩皮抗凍蛋白。該抗凍蛋白提取自小麥麩皮，經過離子交換色譜、凝膠過濾色譜步驟后，其熱滯活性在5 mg/mL時為0.169℃，純化倍數為449.99倍，產率為4.17%。該抗凍蛋白的分子量為11.2 ku，甘氨酸含量較高（52.08 mol%），親水性好。將其與幾種常見抗凍糖蛋白進行相關性分析，推斷其是一種與冷誘導相關的蛋白。經過傅里葉紅外光譜檢測，推斷其二級結構為：α-螺旋：25.96%～26.52%，β-折疊：21.69%～23.78%，β-轉角：35.31%～37.61%，無規卷曲：13.69%～15.08%。

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Purification and physical-chemical characteristic of a novel antifreeze protein from wheat bran（wbAFP）

JIN Zhou-yun，LIU Bao-lin*
（Institute of Biothermal Science and Technology，School of Medical Instrument and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China）

A novel antifreeze protein from wheat bran（wbAFP）was purified and the amino acid composition and the secondary structure were studied.This AFP was purified by four steps：crude extracted，ammonium sulfate precipitation，anion-exchange chromatography on a DEAE-cellulose-26 column，and size-exclusion chromatography on a Sephadex G75 column.As a result，wbAFP was purified 449.99 fold，yielding a productivity of 4.17%.The molecular weight was 11.2 ku and the thermal hysteresis activity（THA）was 0.169℃ at a concentration of 5 mg/mL.The result of amino acid composition of wbAFP showed that it was glycine-rich（52.08 mol%）and had a relatively high hydrophilicity.Compared with several common antifreeze glycoproteins（AFGPs）it was inferred that wbAFP was related with cold-inducible protein.The secondary structure was determined by FT-IR spectra.The results were summarized as α-helix of 25.96%～26.52%，β-sheet of 21.69%～23.78%，β-turn of 35.31%～37.61%and random coil of 13.69%～15.08%．

antifreeze protein；purification；thermal hysteresis activity；amino acid composition；secondary structure

TS210.1

A

1002-0306（2015）20-0159-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.025

2015－01－20

金周筠（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品冷凍冷藏，E-mail：frances900703@gmail.com。

劉寶林（1968-），男，博士，教授，主要從事低溫生物醫學技術方面的研究，E-mail：blliuk@163.com。

上海市東方學者跟蹤計劃。