溶藻弧菌生物被膜形成能力及特性分析

賈玲華，寧喜斌，張徐晶（上海海洋大學食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海201306）

溶藻弧菌生物被膜形成能力及特性分析

賈玲華，寧喜斌*，張徐晶
（上海海洋大學食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海201306）

采用改良的微孔板法對114株溶藻弧菌的生物被膜形成能力強弱進行測定，挑選其中1株最強被膜形成能力的菌株進行不同環境因素下的特性分析，并用熒光顯微鏡觀察被膜形成情況。結果表明：測定菌株中有112株具有被膜形成能力（98.25%），其中具有強或中等強度被膜形成能力的有65株（57.02%）。28℃條件下，溶藻弧菌在含3% NaCl、pH為6.00～8.00的TSB中培養16 h時生物被膜的形成量最大；而添加一定濃度的Mn2+、Cu2+、Ca2+、Mg2+后則不同程度地抑制被膜的形成，并且抑制效果依次降低；菌株在接觸親水性表面（不銹鋼和玻璃）時被膜形成量顯著高于疏水性表面（聚苯乙烯）（p＜0.05），且在不銹鋼表面形成量最大；熒光顯微鏡下的觀察結果與微孔板法一致。不同溶藻弧菌菌株生物被膜的形成能力具有很大差異且受不同環境因素的影響。研究結果可以為有效控制溶藻弧菌被膜形成提供理論支持。

溶藻弧菌，生物被膜，環境因素，特性

細菌極易黏附于活性或惰性物體表面，并在代謝過程中分泌胞外基質（如多糖基質、纖維蛋白、脂蛋白等）以特定方式將其自身包裹其中組成結構性細菌群落［1-2］，即形成生物被膜（Biofilm，BF）。被膜的形成會大大增強細菌對不利環境因素（如冷熱、消毒劑等）的抵抗能力［3］，導致食品加工設備及接觸面上的致病菌不能完全殺滅，殘存在膜內的細菌又會游離出來再次大量繁殖，造成食品工業環境中致病菌的持續、反復感染，給食品生產帶來嚴重的安全隱患。

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus，Va）隸屬弧菌科弧菌屬，是一種嗜鹽性、革蘭氏陰性弧菌，其廣泛分布在全球各地的海水以及河口水域［4-5］，是導致人類、水產動物細菌性疾病的重要條件致病菌之一［6］。近年來研究發現其與副溶血性弧菌相似，也是沿海地區食物中常見的引發腹瀉病的致病菌［7-10］，在水產品處理不充分或生食時，溶藻弧菌的食源性感染很有可能以被膜形式存在［11］。目前，生物被膜在醫學領域已經成為熱點，但在食品加工領域還比較少，尤其國內外關于影響溶藻弧菌生物被膜形成因素的研究報道很少。因此，對溶藻弧菌生物被膜形成情況的研究顯得尤為重要。

本文以114株不同來源分離的溶藻弧菌菌株為研究對象，分析了該菌生物被膜的形成能力，并選取1株最強被膜形成能力的菌株進行不同環境因素下對被膜形成影響的初步探討，旨在為控制溶藻弧菌生物被膜的形成提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

114株溶藻弧菌分離菌株（24株中洋養殖池水樣，19株五四農場養殖池水樣，36株東海水樣，17株中洋河豚魚表皮樣，18株中洋河豚魚腸道樣） 實驗室-80℃保存；硫檸膽蔗瓊脂培養基（TCBS）、胰蛋白胨大豆肉湯培養基（TSB） 上海市浦東新區疾病預防控制中心；甲醇、結晶紫、NaCl、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸銅、硫酸錳國藥集團化學試劑有限公司，分析純；SYBR GreenⅠ上海索萊寶生物科技有限公司。

corning24孔板、96孔板國藥集團化學試劑有限公司；臺式pH精密測試儀德國WTW；熒光顯微鏡卡爾蔡司有限公司；CORONASH-1000型酶標儀廣州濟恒醫藥科技有限公司；不銹鋼圓片（直徑14 mm）、玻璃圓片（直徑14 mm） 江蘇海門三和實驗器材總廠。

1.2實驗方法

1.2.1菌液的準備溶藻弧菌菌株在3%NaCl的TSB中37℃120 r/min搖床振蕩培養7～8 h后，用無菌生理鹽水調節菌液濃度為0.5麥氏濃度（約108cfu/mL），備用。

1.2.2生物被膜的培養及測定在參考Srdjan等［12］微孔板法基礎上進行適當改良：無菌條件下，于96孔板中每孔加入198 μL 3%NaCl TSB培養液后轉接2 μL備用菌液，用排槍吹打進行混勻，每組重復8孔，平行3次，并以無菌TSB培養液作陰性對照。37℃靜置培養16 h后移除孔中培養液，加入250 μL生理鹽水清洗3次，加入200 μL 99%甲醇固定15 min，清空，自然晾干后加入200 μL 1%的結晶紫染液染色10～15 min，用無菌水緩緩沖洗掉未結合染液，待室溫干燥后加入250 μL 95%乙醇，等到結晶紫完全溶解后用酶標儀測定OD590nm，比較不同溶藻弧菌菌株的成膜情況。

參照Christensen等［13］的標準可將各菌株被膜形成強弱程度按其OD值進行分類：將陰性對照的平均值加上其3倍標準差定義為界定值（ODC），其中OD≤ODC為無粘附（－），ODC＜OD≤2ODC為弱粘附（+），2ODC＜OD≤4ODC為中等粘附（++），OD＞4ODC為強粘附（+++）。

1.2.3不同環境因素對生物被膜形成的影響在所有的114株溶藻弧菌分離菌中，挑取被膜形成能力最強的菌株VaP40進行不同環境因素下生物被膜形成情況的探索。

1.2.3.1不同培養溫度對被膜形成趨勢的影響選擇不同的培養時間（4、8、12、16、20、24、36、48、72 h），按照1.2.2的方法分別在不同溫度下（4、28、37、42℃）測定生物被膜形成趨勢的變化。

1.2.3.2NaCl濃度對被膜形成的影響分別將不同含量（0.00%、1.00%、2.00%、2.50%、3.00%、3.50%、4.00%、4.50%、5.00%、6.00%、7.00%、8.00%）的NaCl加入TSB培養液，按照方法1.2.2進行實驗，比較不同NaCl濃度下生物被膜的形成情況。

1.2.3.3金屬陽離子對被膜形成的影響分別配制不同濃度Ca2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+（0.00%、0.25%、0.50%、1.00%、1.50%）的TSB培養液，按照方法1.2.2進行實驗，比較不同離子對被膜形成的影響。

1.2.3.4起始pH對被膜形成的影響分別配制不同pH（3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00、10.00、11.00、12.00）的TSB培養液，按照1.2.2的方法測定，比較不同pH條件下被膜形成情況。

1.2.4不同接觸材料表面對被膜形成能力的影響將菌液與3%NaCl TSB培養液1∶100混勻后，每孔1 mL分別加入底部放有不同材料（經處理滅菌后的不銹鋼圓片、玻璃圓片）的24孔板及底部自身為聚苯乙烯（PS）材料的24孔板中，每組4個重復，平行3次。28℃培養16 h后移除培養物，用生理鹽水清洗3次，加入2 mL 99%甲醇固定15 min，清空，室溫晾干后用2 mL 1%結晶紫染液染色15 min，清洗未結合染液，室溫干燥后每孔加入2 mL 95%乙醇，待結晶紫完全溶解后吸取250 μL于96孔板，用酶標儀測定OD590nm。

1.2.5熒光顯微鏡觀察被膜的形成情況從1.2.3.2的實驗結果中，選取被膜生長較好（3%）與較差（8%）的NaCl濃度，在其條件下用熒光顯微鏡觀察被膜形成情況，并對微孔板法結果進行驗證：分別在含3% NaCl及8%NaCl TSB培養液條件下，在裝有玻璃片的24孔板中進行被膜培養。28℃培養16 h后取出，移除培養物并用生理鹽水清洗3次，4℃條件下用4%的戊二醛固定2 h后用生理鹽水清洗3次，用SYBR GreenⅠ（1∶100000）避光染色30 min。再用生理鹽水清洗3次后制成載玻片置于熒光顯微鏡下觀察VaP40的被膜形成情況，并對微孔板法的結果進行驗證。

1.3數據分析

實驗數據的統計分析采用Excel、SPASS、Origin等軟件。

2　結果與分析

2.1生物被膜形成能力的測定

用改良微孔板法檢測114株溶藻弧菌分離菌株的被膜形成能力，結果顯示（表1）：幾乎所有的菌株都能形成生物被膜，但不同菌株之間被膜形成能力不同，其中具有強被膜形成能力的有12株（10.53%），中等強度被膜形成能力的共53株（47.37%）；47株（38.60%）被膜形成能力較弱。其中菌株VaP40的成膜能力（OD590nm=2.941±0.036）顯著高于其他菌株（p＜0.01）。

表1　溶藻弧菌生物被膜測定結果Table 1　Results of biofilm formation of Vibrio alginolyticus

表2　不同來源溶藻弧菌生物被膜形成能力比較（%）Table 2　Comparison of biofilm formation by Vibrio alginolyticus from different source（%）

從表2中可看出，不同來源分離菌株的被膜形成呈現不同的強弱分布。從中洋河豚魚表皮分離的菌株產生物被膜能力強或中強的數目比例明顯高于其他來源（70.58%），而僅有的2株無被膜形成能力的菌株來源于中洋養殖池水樣。

2.2不同培養溫度對被膜形成趨勢的影響

在28、37及42℃的條件下，培養初期OD590nm值明顯呈上升趨勢，生物被膜的量逐漸增多，到16 h時達到峰值，而在24 h之后迅速下降。結果還發現4℃條件下，菌株P40在不同的時間點下OD590nm值均很小，基本沒有生物被膜的形成，而在28℃時生物被膜的形成量最大（圖1）。

圖1　培養溫度對VaP40被膜形成趨勢的影響Fig.1　Effect of temperature on the biofilm-forming tendency of VaP40

2.3NaCl濃度對被膜形成的影響

在一定范圍內，NaCl濃度顯著影響著溶藻弧菌被膜的形成。菌株VaP40在濃度為1%～6%時均能大量形成生物被膜，且濃度為3%時達到峰值，與2.5%濃度時的形成量差異不顯著，但極顯著高于其余濃度條件下的OD590nm測定值（p＜0.01）；當濃度高于6%時，被膜形成量迅速降低（圖2）。

圖2　NaCl濃度對VaP40被膜形成的影響Fig.2　Effect of concentration of NaCl on the biofilm formation of VaP40

2.4Ca2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+對被膜形成的影響

當添加Ca2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+四種不同金屬離子后，生物被膜的形成量都不同程度的在降低。當添加濃度為0.25%的Cu2+、Mn2+后生物被膜量極顯著降低（p＜0.01），到濃度為0.25%～1.5%時OD590nm值達到基本穩定；而當添加0.25%～1.5%的Ca2+、Mg2+后OD590nm值也均逐漸減小，但其抑制效果均沒有Cu2+、Mn2+高，其中Mg2+抑制效果最低，Mn2+效果最好（圖3）。

圖3　Ca2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+對VaP40被膜形成的影響Fig.3　Effect of Ca2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+on the biofilm formation of VaP40

2.5起始pH對被膜形成的影響

溶藻弧菌在起始pH為3.00～5.00時，OD590nm值很低，基本不形成生物被膜或形成量很低，pH在6.00～9.00時，有很強的被膜形成能力，其中pH6.00～8.00之間無顯著差異，但均極顯著高于其余pH條件下的測定值（p＜0.01）；隨后被膜形成量隨著pH增加而降低，到pH為12.00時基本無被膜形成能力（圖4）。

2.6不同接觸材料表面對被膜形成能力的影響

溶藻弧菌在聚苯乙烯（PS）、不銹鋼片及玻璃片表面均可以形成明顯的生物被膜，但其被膜形成能力不同，圖中結果發現生物被膜在親水性表面（玻璃和不銹鋼）粘附程度均顯著強于疏水性表面（PS）（p＜0.05），且當接觸不銹鋼片時測定的OD590nm最大（圖5）。

圖4　不同pH對VaP40被膜形成的影響Fig.4　Effect of Various pH on the biofilm formation of VaP40

圖5　不同材料表面對VaP40被膜形成的影響Fig.5　Effect of different contact surfaces on the biofilm formation of VaP40

2.7熒光顯微鏡觀察生物被膜

在3%NaCl條件下，菌株P40呈現了多細胞聚集的生物被膜結構，并大面積的覆蓋了材料表面，熒光強度較強。而在8%NaCl條件細胞分布比較稀少，熒光強度較弱。因此，熒光顯微鏡的觀察明顯可以看出，在3%NaCl條件下有明顯的被膜形成，而8%NaCl條件下被膜的形成量很少。該方法的觀察結果也與微孔板法所得的結果相一致（圖6）。

圖6　VaP40生物被膜的熒光顯微鏡圖（400×）Fig.6　The fluorescence microscope images of biofilm of VaP40（400×）

3　討論

研究結果發現溶藻弧菌易形成生物被膜，這可能是因為其廣泛存在于水產品及海域環境，有較強適應環境的生存能力；且不同來源不同菌株之間被膜的形成能力具有很大的差異性，這很大原因是由于生物被膜的形成是由多種機制共同調節的，因而對不同地域菌株進行研究很有必要。

生物被膜的形成過程分為起初的粘附、逐漸成熟再到衰老的階段［14］。本實驗結果發現溶藻弧菌也大致經歷了這幾個階段：在0～8 h時為起初的粘附形成階段，到16 h后達到成熟階段，20 h之后開始進入衰老階段。這一研究趨勢與姚剛等［15］對溶藻弧菌生物被膜的結果基本一致。

研究發現，溶藻弧菌在28～42℃均有很好的被膜形成能力，而在低溫4℃時形成量很低，這與起初菌體在低溫條件生長遲緩有很大關系。而高溫下良好的被膜形成能力也很有可能是溶藻弧菌在夏季大量引發疾病的重要原因之一。據報道Na+可以驅動細菌鞭毛的運動，進而促進被膜的形成［16］，本實驗結果也發現當NaCl含量在1%～6%時溶藻弧菌能很好的形成生物被膜。而當不添加鹽或鹽含量過高時，溶藻弧菌很難生長，故而基本不形成生物被膜，也與本次結果相符。

研究結果顯示溶藻弧菌在中性偏堿的條件下被膜的形成量更多，而酸性或強堿性條件時會受到抑制，這也與溶藻弧菌適宜生長在pH為7.5～8.6的天然海水中有很大關系。

本實驗顯示Ca2+抑制溶藻弧菌被膜形成，主要原因可能是Ca2+對溶藻弧菌菌體有一定損傷作用，而Cu2+、Mn2+的抑制作用則很可能是因為在添加這些金屬離子之后培養液具有親水性使生物有機體分散生長［17］，從而減少了生物被膜的形成。

許多材料（如玻璃、不銹鋼、PS等）都是食品加工或包裝的常用材料。Chavant等［18］發現，細菌不論是在親水性的玻璃和不銹鋼上還是疏水性的PS上都可形成被膜，并且親水性材料表面更易形成，本次實驗結果也與該研究發現相一致。

總之，細菌被膜的形成過程很復雜，涉及到細菌本身特性、培養環境（溫度、pH、滲透壓等）和細菌粘附表面特性（疏水性等）等多種不同因素［19］，細菌所在的生存環境對被膜的形成情況有著很大的影響。對不同環境條件下溶藻弧菌的被膜形成特性的研究，能夠為食品環境中生物被膜的有效控制提供理論支持。

4　結論

改良微孔板法對114株溶藻弧菌分離菌株生物被膜形成能力進行測定后結果顯示有112株有生物被膜形成能力，且不同菌株生物被膜的形成能力具有很大差異；溶藻弧菌被膜的形成受環境因素的影響，研究表明于28℃條件下，溶藻弧菌在含3%NaCl、pH為6.00～8.00的TSB中培養16 h時生物被膜的形成量最大；當添加一定濃度的Mn2+、Cu2+、Ca2+、Mg2+后則不同程度地抑制被膜的形成，并且抑制效果依次降低；菌株在接觸親水性表面（不銹鋼和玻璃）時被膜形成量顯著高于疏水性表面（聚苯乙烯）（p＜0.05），且在不銹鋼表面形成量最大。

［1］Hall-Stoodley L，Costerton J W and Stoodley P.Bacterial bioflims from the natural environment to infections diseases［J］. Nature Reviews Microbiology，2004，2（2）：95-108.

［2］Costerton J W，Stewart P S，Greenberg E P.Bacterial biofilms：a common cause of persistent infections［J］.Science，1999，284（5418）：1318-1322.

［3］戚韓英，汪文斌，鄭昱，等.生物膜形成機理及影響因素探究［J］.微生物學通報，2013，40（4）：677-685.

［4］蔣學兵，馬聰，郭建巍，等.中國海域海洋細菌的分離與鑒定方法研究［J］.解放軍醫學雜志，2009（7）：898-900.

［5］韓善橋，虞積耀，姜濤，等.海水中致病性弧菌分離及抗菌藥物敏感性分析［J］.中國抗生素雜志，2008，33（4）：239-241.［6］Amel B，Amine B，Kamel C，et al.Survival of Vibrio alginolyticus in seawater and retention of virulence of its starved cells［J］.Marine Environment Research，2007（64）：469-478.

［7］Larsen J L，Farid A F，Dalsgaard I.Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio alginolyticus in marine and estuarine bathing areas in Danish coast［J］.Zentralbl Bakteriol MikrobiolHyg B，1981，173（5）：338-345.

［8］封會茹，游京蓉，劉玉堂，等.溶藻弧菌引起暴發型食物中毒的病原學研究［J］.中國食品衛生雜志，2003（4）：331-334.

［9］侯霄煜.由溶藻弧菌引起的一起食物中毒［J］.中國衛生檢驗雜志，2005（9）：1123

［10］龔玲芬，郁祝新.副溶血弧菌和溶藻弧菌混合污染引起食物中毒的調查［J］.職業與健康，2008（4）：343-344.

［11］丁文艷，寧喜斌，李玉婷，等.不同副溶血性弧菌菌株成膜能力及成膜影響因子的研究［J］.食品工業科技，2014（23）：163-167.

［12］Srdjan S，Dragana V，Ivana D，et al.A modified microtiterplate test for quantification of staphylococcal biofilm formation［J］. Journal of Microbiological Methods，2000（40）：175-179.

［13］Christensen G D，Simpson W A，Younger J J，et al. Adherence ofcoagulase-negative staphylococci to plastic tissue cultureplates：aquantitativemodelfortheadherenceof staphylococci to medical devices［J］.J Clin Microbiol，1985（22）：996-1006.

［14］鄧旗，孫力軍，王雅玲，等.環境條件對腐敗希瓦氏菌生物被膜形成能力的影響［J］.中國食品學報，2013（10）：43-50.

［15］姚剛，覃映雪，鄒文政，等.致病性溶藻弧菌生物膜形成特性研究［J］.水產科學，2012（2）：73-78.

［16］Knobloch J K，Bartscht K，Sabottke A，et al.Biofilm formation by Staphylococcus epidermidis depends on functional RsbU，an activator of the sigB operon：differential activation mechanisms due to ethanol and salt stress［J］.Journal of Bacteriology，2001，183（8）：2624-2633.

［17］渠宏雁，孟良玉，劉錦峰，等.副溶血性弧菌生物被膜的形成與優化［J］.中國食品學報，2013（9）：56-61.

［18］Chavant P，Martinie B，Meylheuc T，et al.Listeria monocytogenes LO28：surface physicochemical properties and ability to form biofilms at different temperatures and growth phases［J］.Applied and Environmental Microbiology，2002，68（2）：728-737.

［19］Moltz A G.Formation of biofilms by Listeria monocytogenes under various growth conditions［J］.Journal of Food Protection，2005，68（1）：92-97.

Characterization and biofilm forming-ability of Vibrio alginolyticus

JIA Ling-hua，NING Xi-bin*，ZHANG Xu-jing
（College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing&Preservation，Shanghai 201306，China）

Modified microtiter-plate test was used to investigate the biofilm formation of 114 Vibrio alginolyticus strains.The strongest biofilm formation strain was selected for biofilm characteristics study under various environmental factors.Further，the biofilm formation was observed by using fluorescence microscopy.The results showed that among all the tested strains，112（98.25%）had biofilm formation ability，and 65（57.02%）were at the strong or moderate level.V.alginolyticus formed strong biofilm in pH6.00～8.00 TSB with 3%NaCl at 28℃for 16 h.The ability of biofilm formation was inhibited by adding a certain concentration of Cu2+，Mn2+，Ca2+，Mg2+.It’s also found that the bacteria adhered to hydrophilic surfaces（stainless steel and glass）better than to hydrophobic ones（polystyrene），and adhered best to stainless steel sheet.The fluorescence microscope observation was consistent with the modified microtiter-plate results.It concluded that V.Alginolyticus biofilm forming-ability was affected by various environmental factors with diversity among different strains.The results provided a theoretical support for the effective control of V.Alginolyticus biofilm formation.

Vibrio alginolyticus；biofilm；environmental factors；characteristic

TS201.3

A

1002-0306（2015）20-0201-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.034

2015－01－30

賈玲華（1991-），女，碩士研究生，研究方向：食品安全，E-mail：jialinghua123@163.com。

寧喜斌（1964-），男，博士，教授，研究方向：食品安全、微生物學，E-mail：xbning@shou.edu.cn。

上海市科委工程中心建設（11DZ2280300）。