表面活性劑協同超聲波優化牯嶺勾兒茶總黃酮提取工藝

俞　浩，毛斌斌，劉漢珍（安徽科技學院食品藥品學院，安徽鳳陽233100）

表面活性劑協同超聲波優化牯嶺勾兒茶總黃酮提取工藝

俞浩，毛斌斌，劉漢珍
（安徽科技學院食品藥品學院，安徽鳳陽233100）

以牯嶺勾兒茶總黃酮得率為指標，在單因素實驗的基礎上，采用正交實驗法優選表面活性劑協同超聲波提取牯嶺勾兒茶總黃酮的提取工藝。結果表明，牯嶺勾兒茶總黃酮的最佳提取工藝條件為：液固比35∶1（mL/g），乙醇濃度65%，SDS濃度為3.0 g/L，超聲功率250 W，該條件下總黃酮得率為3.81 mg/g，RSD為1.53%，且提取工藝簡單，重復性好。

牯嶺勾兒茶總黃酮，表面活性劑，超聲提取，正交設計法

牯嶺勾兒茶（Berchemia kulingensis Schneid）為鼠李科鼠李屬植物，主產于安徽、四川、廣西等省，其性味微澀、溫，具有祛風利濕，通經活絡之功效。安徽滁州一帶習用牯嶺勾兒茶的葉，夏季采收后加工炒制成茶，習稱“藤茶”，在當地有著較為悠久的飲用歷史。民間認為，長期飲用“藤茶”具有良好的保健功效。近年研究發現，勾兒茶屬植物富含氨基酸、多糖、黃酮、苷類等成分，具有保肝、抑菌、止咳平喘等多種藥理作用［1］。本實驗前期觀察了牯嶺勾兒茶多糖對免疫功能的影響和抗氧化作用，結果表明牯嶺勾兒茶多糖能夠增強老齡小鼠非特異性免疫功能和特異性免疫功能，具有抗過氧化損傷作用［2］。目前，有關牯嶺勾兒茶黃酮類成分的提取工藝及活性研究尚未見文獻報道。本實驗在單因素實驗的基礎上，采用正交設計法優選表面活性劑協同超聲提取牯嶺勾兒茶總黃酮的最佳工藝，為牯嶺勾兒茶的開發利用提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

牯嶺勾兒茶采自安徽省鳳陽縣韭山，經安徽科技學院劉漢珍副教授鑒定為牯嶺勾兒茶（Berchemia kulingensis Schneid）的葉；蘆丁對照品（0080-9905）中國藥品生物制品檢定所；十二烷基硫酸鈉（SDS）無錫市鹿城科技有限公司，分析純；十六烷基三甲基溴化銨（CTMAB） 上海凱爾生物科技有限公司，分析純；吐溫80天津市永大化學試劑有限公司，分析純；椰油酰胺基丙基甜菜堿（CAB） 上海金山經緯化工有限公司，分析純。

UV-5500PC型紫外可見分光光度計上海元析儀器有限公司；SB 25-12 DTDN型超聲波清洗機寧波新芝生物科技股份有限公司；SHZ-CD型循環水真空泵鞏義市予華儀器有限責任公司；FA2104B電子分析天平上海越平科學儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1蘆丁對照品溶液的配制精密稱定蘆丁對照品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加70%乙醇溶解并定容至刻度，配制成濃度為0.2 mg/mL的蘆丁對照品溶液。

1.2.2標準曲線的制備取25 mL容量瓶5支，分別加入蘆丁對照品溶液1、2、3、4、5 mL，各加蒸餾水至6.0 mL，加1 mL 5%NaNO2溶液，搖勻后放置6 min，加1 mL 10%Al（NO3）3溶液，搖勻后放置6 min，再加10 mL 4%NaOH溶液，最后加蒸餾水定容至刻度，搖勻放置15 min，以相應試劑為空白對照，在510 nm處測定吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得標準曲線方程為：Y=0.071X+0.001，R2=0.9999，蘆丁濃度在8.0～4.0 μg/mL范圍內線性關系良好。

1.2.3牯嶺勾兒茶總黃酮的提取與含量測定取牯嶺勾兒茶，粉碎機粉碎后過40目篩，稱取2.0 g，置100 mL具塞磨口三角瓶中，加入一定濃度的乙醇，再加入一定量的表面活性劑，浸泡2 h后，置超聲裝置中，在設定的超聲功率下超聲一定時間，抽濾，將提取液移入100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容。取一定體積的提取液，加蒸餾水6 mL，其余步驟同“1.2.2”方法，測定提取液中總黃酮含量，計算牯嶺勾兒茶總黃酮得率。牯嶺勾兒茶總黃酮得率（mg/g）=提取液中總黃酮質量/牯嶺勾兒茶粉末質量。

1.2.4表面活性劑的選擇取100 mL具塞磨口錐形瓶5個，分別加入牯嶺勾兒茶2.0 g，按液固比30∶1（mL/g）分別加入70%乙醇溶液，其中4個錐形瓶分別加入4 g/L的SDS、CTMAB、吐溫80和CAB，第5個錐形瓶中加入相應量的蒸餾水作空白對照。浸泡2 h后，置超聲裝置中，超聲功率250 W，超聲時間25 min，取提取液，測定吸光度，得總黃酮得率，計算相對提高率。相對提高率（%）=100×（加表面活性劑總黃酮得率-空白對照總黃酮得率）/空白對照總黃酮得率。

1.2.5單因素實驗

1.2.5.1乙醇濃度對總黃酮得率的影響設定超聲頻率40 kHz，按液固比30∶1，分別加入50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%乙醇，超聲功率250 W，超聲時間25 min，考察乙醇濃度對總黃酮得率的影響。

1.2.5.2液固比對總黃酮得率的影響設定超聲頻率40 kHz，按一定液固比加入65%乙醇，設定超聲功率250 W，超聲時間25 min，考察液固比為20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1（mL/g）條件下總黃酮得率。

1.2.5.3超聲功率對總黃酮得率的影響設定超聲頻率40 kHz，按液固比35∶1加入65%乙醇，設定超聲時間25 min，考察超聲功率為100、150、200、250、300、350、400 W條件下總黃酮得率。

1.2.5.4超聲時間對總黃酮得率的影響設定超聲頻率40 kHz，按液固比35∶1加入65%乙醇，設定超聲功率300 W，考察超聲時間為10、15、20、25、30、35、40 min條件下總黃酮得率。

1.2.5.5SDS濃度對總黃酮得率的影響設定超聲頻率40 kHz，按液固比35∶1加入65%乙醇，分別加入1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0（g/L）的SDS，超聲功率300 W，超聲時間20 min，考察SDS濃度對總黃酮得率的影響。

1.2.6正交實驗優選總黃酮提取工藝參照文獻方法［3-5］，根據單因素實驗結果，在考察的5個因素中，選取乙醇濃度、液固比、SDS濃度和超聲功率等4個對總黃酮得率影響較大的因素，以牯嶺勾兒茶總黃酮得率為指標，按照正交實驗四因素三水平設計（見表1），選用L9（34）正交表進行正交實驗，每個實驗號實驗重復2次。見表1。

表1　正交設計因素水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal design

1.3數據處理

結果分析采用SPSS for Windows 17.0軟件general linear models。

2　結果與分析

2.1表面活性劑的確定

表面活性劑具有雙親結構，其分子的疏水部分能結合在一起形成膠束，非極性物質可以進入膠束內核或表面活性劑分子之間，從而達到增溶目的［6-8］。因此，表面活性劑在輔助中藥提取技術方面應用非常廣泛。超聲波利用空化作用、機械振蕩作用、熱效應等原理，使植物細胞壁瞬間破裂，將細胞內容物釋放與溶出，且超聲波能加速藥材成分的擴散，縮短提取時間［9-11］。由表2可知，與未加表面活性劑比較，加入SDS、CTMBA、吐溫80、CAB后，牯嶺勾兒茶總黃酮得率分別提高了65.14%、49.71%、43.42%、48.00%。4種表面活性劑中，陰離子型表面活性劑SDS對總黃酮得率的影響最大，相對提高率為65.14%。因此，確定SDS為實驗因素之一。

表2　不同表面活性劑對總黃酮得率的影響Table 2　Effect of different surfactant on the yield of total flavonoids from berchemia kulingensis schneid

2.2單因素實驗結果

2.2.1乙醇濃度對總黃酮得率的影響由圖1可知，乙醇濃度在50%～65%時，總黃酮得率逐步提高，乙醇濃度為65%時總黃酮得率最高，其后隨著乙醇濃度的增加，總黃酮得率逐漸下降。可能原因是隨著乙醇濃度的增加，雜質的溶出度也增加，對黃酮的提取造成影響。因此，確定65%乙醇為最佳濃度。

圖1　乙醇濃度對牯嶺勾兒茶總黃酮得率的影響Fig.1　Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids from berchemia kulingensis schneid

圖2　液固比對牯嶺勾兒茶總黃酮得率的影響Fig.2　Effect of liquid-solid ratio on the yield of total flavonoids from berchemia kulingensis schneid

2.2.2液固比對總黃酮得率的影響由圖2可知，隨著液固比的增加，總黃酮得率逐漸增加，當液固比超過35∶1時，隨著液固比的增加，總黃酮得率保持在一個較為平穩的水平。原因可能是隨著液固比的增加，提取液粘度降低，超聲空化的阻力降低，有助于黃酮的溶出。考慮到液固比提高會增加提取成本，且后期濃縮處理負擔也會加重。因此，確定35∶1為最佳液固比。

圖3　超聲功率對牯嶺勾兒茶總黃酮得率的影響Fig.3　Effect of ultrasound power on the yield of total flavonoids from berchemia kulingensis schneid

2.2.3超聲功率對總黃酮得率的影響由圖3可知，在一定功率范圍內，總黃酮得率隨著超聲功率的增加不斷提高，超聲功率為300 W時，總黃酮得率最高。超過300 W后，隨著超聲功率的增加，總黃酮得率逐步降低，原因可能是功率過高會導致部分黃酮結構破壞。因此，確定300 W為最佳超聲功率。

圖4　超聲時間對牯嶺勾兒茶總黃酮得率的影響Fig.4　Effect of ultrasound time on the yield of total flavonoids from berchemia kulingensis schneid

2.2.4超聲時間對總黃酮得率的影響由圖4可知，超聲時間對總黃酮得率影響不大。可能原因是隨著超聲時間的延長，總黃酮得率增加，但空化效應減弱，牯嶺勾兒茶總黃酮的吸附力增強，也可能是超聲時間延長破壞了部分黃酮結構，造成總黃酮得率下降。從總黃酮得率和節約時間方面考慮，確定超聲時間為20 min。

圖5　SDS濃度對牯嶺勾兒茶總黃酮得率的影響Fig.5　Effect of SDS concentration on the yield of total flavonoids from berchemia kulingensis schneid

2.2.5SDS濃度對總黃酮得率的影響由圖5可知，SDS濃度為1.0～2.5 g/L時總黃酮得率隨濃度的增加而增加，SDS濃度為2.5 g/L時達最大值，其后逐步降低。可能原因是隨著表面活性劑濃度的增加，形成膠束數量不斷增加，從而增加黃酮的溶出度，總黃酮得率增加。但當表面活性劑的濃度達到臨界膠束濃度后，形成膠束數量不再增加，黃酮得率亦不再增加。因此，選取SDS的最佳濃度為2.5 g/L。

2.3正交實驗結果及分析

由表3、表4可知，4個因素對總黃酮得率均有顯著影響，影響大小順序為：C＞B＞D＞A，最佳提取工藝為A2B2C3D1，即液固比35∶1，乙醇濃度65%，SDS濃度3.0 g/L，超聲功率250 W。

2.4驗證實驗

稱取3份牯嶺勾兒茶樣品各2.0 g，采用優化工藝條件提取，3份樣品的總黃酮得率分別為3.79、3.82、3.81 mg/g，平均得率為3.81 mg/g，RSD為1.53%，結果表明該工藝條件穩定可行。

表3　正交實驗結果Table 3　Results of orthogonal experiment design

表4　方差分析結果Table 4　Results of variance analysis

3　結論

表面活性劑能降低溶劑的表面張力，使溶劑更易滲入藥材細胞內部，利于有效成分擴散并溶解于溶劑中，提高中藥化學成分的提取效率［12-16］。本實驗選擇了4種表面活性劑進行實驗，結果顯示，在相同濃度時，陰離子表面活性劑SDS輔助提取牯嶺勾兒茶總黃酮效果最好。在單因素實驗的基礎上，考察了乙醇濃度、液固比、超聲時間、超聲功率及SDS濃度對牯嶺勾兒茶總黃酮得率的影響，并在此基礎上采用正交實驗法對提取條件進行了優化，得到最佳提取工藝條件為：液固比35∶1，乙醇濃度65%，SDS濃度為3.0 g/L，超聲功率250 W。驗證性實驗結果顯示，采用此工藝條件提取3次，總黃酮平均得率為3.81 mg/g，RSD為1.53%，表明該工藝條件重復性好，為牯嶺勾兒茶的開發利用奠定了基礎。

［1］陳立，董俊興.勾兒茶屬植物化學成分及其生物活性研究進展［J］.中草藥，2006，37（4）：627-630.

［2］俞浩，張孝林，毛斌斌，等.路方方牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠免疫功能及抗氧化能力的影響［J］.食品工業科技，2014，35（5）：350-353.

［3］CAI Ding-jian，SHU Author VitaeQing，XU Bao-quan，et al. Orthogonal test design for optimization of the extraction of flavonid from the fructus gardeniae［J］.Biomedical and Environmental Sciences，2011，24（6）：688-693.

［4］Zhou Shen-kang，Bi Tie-Nan，Xu Yun-Feng，et al.Extraction optimization of carbohydrate compound from Huangqi using orthogonaldesign［J］.InternationalJournalofBiological Macromolecules，2013，58：13-17.

［5］Wu Tao，Yan Jun，Liu Rong-hua，et al.Optimization of microwave-assisted extraction of phenolics from potato and its downstreamwasteusingorthogonalarraydesign［J］.Food Chemistry，2012，133（4）：1292-1298.

［6］王純榮，鄭國棟，顏賢仔.表面活性劑協同微波提取大豆莢黃酮的研究［J］.江西農業大學學報，2011，33（1）：151-156.

［7］董樹國，陸釗，曹宏梅.表面活性劑輔助提取桑葉總黃酮的工藝研究［J］.安徽農業科學，2011，39（32）：19778-19780.

［8］Park Ji-yeon，Nam Bora，Choi Sun-A，et al.Effects of anionic surfactant on extraction of free fatty acid from Chlorella vulgari［J］.Bioresource Technology，2014，166：620-624.

［9］Eng AT，Heng MY，Ong ES.Evaluation of surfactant assisted pressurized liquid extraction for the determination of glycyrrhizin and ephedrine in medicinal plants［J］.Anal Chim Acta，2007，583（2）：289-295.

［10］史禮貌，解成喜.新疆大薊總黃酮的超聲提取及抗氧化性研究［J］.食品科學，2011，32（6）：120-123.

［11］Zhang Jun-wei，Wang Yan，Peng Qi-jun.Extraction of Theanine from Waste Liquid of Tea Polyphenol Production in Aqueous Two-phase Systems with Cationic and Anionic Surfactants［J］.Chinese Journal of Chemical Engineering，2013，21（1）：31-36.

［12］潘芳芳，高佳，陳京.正交優化表面活性劑提取山楂黃酮的工藝研究［J］.中國當代醫藥，2011，18（5）：136-138.

［13］顏賢仔，王純榮，寇磊.表面活性劑超聲法提取野生刺五加黃酮工藝［J］.食品工業科技，2011，32（12）：314-317.

［14］劉樹新，侯屹，李祥.超聲波-表面活性劑協同提取盾葉薯蕷總皂苷［J］.精細化工，2010，27（6）：562-566.

［15］胡楠，方波，陳晶晶，等.表面活性劑強化微波提取花生殼黃酮的工藝研究［J］.食品科技，2009，34（3）：200-203.

［16］宮坤，詹小龍，郭中婷，等.表面活性劑輔助提取石榴葉中總黃酮工藝的研究［J］.食品工業科技，2014，35（23）：261-264，322.

Optimization of surfactant assisted with ultrasonic extraction technology of total flavonoids from Berchemia kulingensis Schneid

YU Hao，MAO Bin-bin，LIU Han-zhen
（College of Food and Drug，Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，China）

With the index of yield of total flavonoids from Berchemia kulingensis Schneid，orthogonal experiment design was used to optimize the surfactant assisted with ultrasonic extraction technology of total flavonoids from Berchemia kulingensis Schneid in the basis of single factor.The results showed that the optimum extraction conditions of total flavonoids from Berchemia kulingensis Schneid as follows：SDS concentration 3.0 g/L，ethanol concentration 65%，ultrasonic power 250 W，solvent-solid ratio 35∶1，the yield of total flavonoids was 3.81 mg/g，RSD was 1.53%，and this extraction technology was simple and had good reproducibility.

total flavonoids of Berchemia kulingensis Schneid；surfactant；ultrasonic extraction；orthogonal design

TS201.1

B

1002-0306（2015）20-0244-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.043

2015－01－30

俞浩（1975-），男，博士，副教授，主要從事中藥新藥及保健食品的開發研制方面的研究，E-mail：yhz_1230@163.com。

安徽省高校省級自然科學研究重點項目（kj2014A051）。