響應面法優化超聲波輔助提取羅望子殼中總黃酮的工藝研究

文　攀，陳繼姝，裴志勝，金雅婷（瓊州學院，海南三亞572022）

響應面法優化超聲波輔助提取羅望子殼中總黃酮的工藝研究

文攀，陳繼姝*，裴志勝，金雅婷
（瓊州學院，海南三亞572022）

以羅望子殼為材料，用乙醇作為提取劑，利用超聲波輔助提取羅望子殼中的總黃酮。以總黃酮的提取率為指標，進行料液比、乙醇濃度、超聲波時間和超聲波功率的單因素實驗，并在此基礎上，選取料液比、乙醇濃度、超聲波時間和超聲波功率進行響應面優化實驗。結果表明，羅望子殼中總黃酮的最佳提取工藝參數為：料液比1∶47（g/mL）、乙醇濃度60%、超聲波時間26 min、超聲波功率1080 W，在此工藝條件下，羅望子殼中總黃酮的提取率為81.59%。

羅望子殼，總黃酮，超聲波，響應面

羅望子（Tamarindus indica L.），是一種生長于熱帶及亞熱帶的高大常綠喬木，在我國海南、廣西、臺灣有較多的栽培，其果肉含有豐富的有機酸、糖類、維生素、蛋白質、游離氨基酸等多種營養成分［1］。羅望子殼是羅望子粉生產過程中的一種副產物，約占種子的28.6%，殼中纖維占21.6%，灰分占7.4%，單寧物質占20%～24%［2］。據相關研究表明［2-3］，羅望子殼與果實一樣含有較高的黃酮類化合物，具有較強的抗氧化性和一定的降血糖活性。同時，王阿麗等［4］用高效液相色譜測定羅望子果實不同部位木犀草素的含量，發現羅望子殼中含有一定量的木犀草素，而木犀草素是主要黃酮類物質之一。可見，羅望子殼非常值得開發研究。

然而近年來，國內外對羅望子的研究主要集中在葉片、種仁和果實，以多糖、果膠、總黃酮的提取及提取物的抗氧化、降血糖等方面的研究為主［5-7］，鮮見羅望子殼總黃酮提取的相關報道。羅望子殼在鮮食和加工過程中因不可食用而被遺棄，既污染環境，也是一種資源浪費，如何綜合利用羅望子殼，提高產品附加值，保護環境，越來越受到人們的重視。因此本文采用超聲波輔助法對羅望子殼中的總黃酮提取工藝進行研究，以期使羅望子殼黃酮能夠成為一種新的天然食品添加劑資源，用于食品、藥品或作為具有某些生物活性的新資源，在產生經濟效益的同時減少環境污染，提高產品的附加值。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

羅望子市購；蘆丁標準品PCS0724中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉均為分析純，廣州化學試劑廠。

UV-2550紫外可見分光光度計日本島津；FA2204B分析天平蘇州江東精密儀器有限公司；JU-6224調節超聲發生器上海杰恩超聲設備有限公司；DZF-OB真空干燥箱上海凱朗儀器設備廠；DHG-9245A電熱恒溫鼓風干燥箱金壇盛藍儀器制造有限公司；DPX-9082B-1恒溫水浴箱金壇盛藍儀器制造有限公司；YF2-2粉碎機瑞安市永歷制藥機械有限公司；SHZ-D（III）循環水多用真空泵上海凌科實業發展有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1羅望子殼總黃酮的提取工藝流程羅望子殼→烘干（60℃鼓風干燥）→粉碎→過篩（60目）→稱重→液料混勻→超聲波處理→抽濾→取上清液測含量。

1.2.2羅望子殼總黃酮最大吸收峰的測定取羅望子殼粉1.0003 g放入50 mL的燒杯中，加入一定量60%乙醇溶液，充分混合均勻，在45℃恒溫水浴箱中浸提60 min，過濾，冷卻，加入5%亞硝酸鈉溶液1.5 mL，搖勻，放置6 min后加入10%的硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液20 mL，搖勻，放置10 min，用分光光度計以0.2 nm為精度進行高速掃描，測定總黃酮的吸收光譜。同樣的方法處理蘆丁對照品，比對兩個樣品的吸收光譜，確定最大吸收峰。

1.2.3標準曲線的制備精確稱取0.0646 g蘆丁標準品，用50 mL 60%的乙醇溶液溶解，充分混合搖勻，在45℃恒溫水浴箱中加熱60 min，冷卻過濾，再用60%乙醇溶液定容至250 mL，準確吸取蘆丁標準液0、0.3、0.6、0.9、0.12、0.15 mL于50 mL容量瓶中，依次加入5%亞硝酸鈉溶液1.5 mL，搖勻，靜置6 min后加入10%的硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min，加入4%的氫氧化鈉溶液20 mL，搖勻，靜置10 min，于334 nm處測定其吸光度。

1.2.4羅望子殼總黃酮的提取及測定準確稱取1.0028、1.0030、1.0032 g羅望子殼粉，分別放入50 mL 60%的乙醇溶液，置于超聲波發生器中，設定超聲波功率為1080 W，提取時間為25 min，按以上操作反復提取，直到提取液為無色，分別將每次的提取液合并，于334 nm處采用硝酸鋁顯色法［8］測定吸光值，計算羅望子殼總黃酮含量。羅望子殼中總黃酮提取率公式如下：

式中：C為根據蘆丁標準曲線計算羅望子殼總黃酮的質量濃度，mg/mL；V1為原提取液總體積，mL；D為提取液稀釋的倍數；M為稱取羅望子殼總黃酮含量：50.21 mg。

1.2.5單因素實驗通過單因素實驗確定不同因素的實驗水平。分別考察料液比、乙醇濃度、超聲波時間、超聲波功率四個因素對超聲波輔助提取效果的影響，以羅望子殼總黃酮提取率作為考察指標。

1.2.5.1料液比的篩選分別準確稱取1.0 g羅望子殼粉7份，料液比（g/mL）分別設定為1∶20、1∶30、1∶40、1∶45、1∶50、1∶60、1∶70，乙醇濃度為60%，設定超聲波時間20 min，超聲波功率1080 W，考察不同料液比對羅望子殼總黃酮提取效果的影響。

1.2.5.2乙醇濃度的篩選分別準確稱取1.0 g羅望子殼粉4份，乙醇濃度分別設定為40%、60%、80%、100%，料液比（g/mL）為1∶50，設定超聲波功率1080 W，超聲波時間20 min，考察不同乙醇濃度對羅望子殼總黃酮提取效果的影響。

1.2.5.3超聲波時間的篩選分別準確稱取1.0 g羅望子殼粉6份，料液比（g/mL）為1∶50，乙醇濃度為60%，設定超聲波功率為1080 W，超聲波時間分別為5、10、15、20、25、30 min，考察不同超聲波時間對羅望子殼總黃酮提取效果的影響。

1.2.5.4超聲波功率的篩選分別準確稱取1.0 g羅望子殼粉6份，料液比（g/mL）為1∶50，乙醇濃度為60%，設定超聲波時間20 min，超聲波功率分別設定為600、720、840、960、1080、1200 W，考察不同超聲波功率對羅望子殼總黃酮提取效果的影響。

1.2.6響應面優化實驗在上述單因素實驗的基礎上，根據Box-Behnken中心組合設計原理，以總黃酮提取率為指標，選取料液比、超聲波時間、超聲波功率、乙醇濃度四個因素進行響應面實驗設計（見表1），得出相關實驗數據，通過Design-Expert軟件對實驗數據進行回歸分析，得出優化羅望子殼總黃酮提取工藝參數，并開展驗證性實驗。

表1　響應面分析因子與水平表Table 1　Factor levels of response surface analysis

1.2.7數據處理每次實驗設3個平行樣，取平均值，數據采用Design Expert 7.0軟件進行統計分析。

2　結果與分析

2.1羅望子殼總黃酮最大吸收峰的確定

圖1　蘆丁和羅望子殼總黃酮的紫外吸收光譜Fig.1　The UV absorption spectrum of the rutin and total flavonoids in Tamarindus indica shell

從蘆丁和羅望子殼總黃酮的光譜掃描（圖1）可以看出，二者均在334 nm附近有強吸收，故本實驗選擇在波長為334 nm處測定羅望子殼中總黃酮提取液的吸光度。

2.2蘆丁對照品標準曲線的繪制

以蘆丁濃度為橫坐標X，吸光值為縱坐標Y，繪制標準曲線如圖2所示，線性回歸方程為：Y=24.370X-0.0066（R2=0.9928）。

圖2　蘆丁標準曲線Fig.2　Standard curve of rutin

圖3　料液比對羅望子殼中總黃酮提取率的影響Fig.3　Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of total flavonoids in Tamarindus indica shell

2.3單因素實驗

2.3.1料液比對羅望子殼中總黃酮提取效果的影響

由圖3可知，隨著液料比的增加，提取液中總黃酮的提取率增加，這可能是因為液料比增大時，黃酮與溶液在單位時間內存在較大的質量濃度梯度，擴散系數大，有利于黃酮的溶出［10］。但當液料比達到1∶45 g/mL時，總黃酮提取率的增加趨于緩慢，總黃酮的提取率基本達到最大值；當液料比達到1∶50 g/mL時，繼續增加溶劑的用量，總黃酮的提取率下降。可見，在一定范圍內，溶劑用量的增加有利于黃酮類化合物的浸出，當達到固液接觸飽和后，再增加提取劑的量，反而促進雜質的溶出，不利于有效成分的提取。同時，過多的溶劑造成溶劑和能源的浪費［11］。故選擇料液比1∶40、1∶45、1∶50 g/mL進行響應面實驗。

圖4　乙醇濃度對羅望子殼中總黃酮提取率的影響Fig.4　Effect of alcohol concentrartions on extraction rate of total flavonoids in Tamarindus indica shell

2.3.2乙醇濃度對羅望子殼中總黃酮提取率的影響

圖4表明，在乙醇濃度為40%～60%的范圍時，隨著乙醇濃度的增加，總黃酮提取率也相應提高。當乙醇濃度超過60%后，總黃酮提取率隨之下降。出現這一結果可能是因為黃酮是一類極性范圍很廣的化合物，其極性隨乙醇濃度的變化而變化，60%乙醇的極性與羅望子殼中黃酮類化合物的極性相似，所以提取率最高；但過高的乙醇濃度，會導致糖類、脂溶性物質等物質大量溶出，影響總黃酮的提?。?2］。因此，選擇乙醇濃度50%、60%、70%進行響應面實驗。

2.3.3超聲波時間對羅望子殼中總黃酮提取率的影響如圖5所示，初始時黃酮的提取率隨著提取時間的延長而增加，提取時間達到25 min時提取量最大，原因可能是初始時隨著提取時間的延長，黃酮較容易在超聲的空化作用、機械作用和熱效應下被溶劑快速地溶出，到達25 min時大部分黃酮已經溶出［10］。但當提取時間超過25 min后，隨著超聲波時間的增加其提取率下降，可能是長時間的超聲波振幅破壞黃酮類化合物的結構，導致黃酮溶出量減少［13］。因此選擇超聲波時間20、25、30 min進行響應面優化實驗。

圖5　超聲波時間對羅望子殼中總黃酮提取率的影響Fig.5　Effect of ultrasonic time on extraction result of total flavonoids from Tamarindus indica shell

2.3.4超聲波功率對羅望子殼中總黃酮提取率的影響由圖6可以看出，隨著超聲波功率的增加，總黃酮提取率增加。當超聲波功率為1080 W時，提取率達到最大值，之后，隨著超聲波功率的增大提取率下降。這可能是因為過高的功率產生的瞬間高溫使活性成分受到破壞，溶出較多雜質從而影響提取效果［14］。因此，選擇超聲波功率960、1080、1200 W進行響應面優化實驗。

2.4響應面法優化實驗

根據Box-Behnken型的中心組合實驗設計原理，綜合單因素實驗結果，選取料液比、超聲波時間、超聲波功率、乙醇濃度4個因素，采用四因素三水平的響應面分析方法，響應面分析方案及實驗結果如表2所示。采用Design-Expert軟件對所得數據進行分析。

圖6　超聲波功率對羅望子殼中總黃酮提取率的影響Fig.6　Effect of ultrasonic power on extraction result of total flavonoids from Tamarindus indica shell

表2　Box-Behnken響應面實驗設計及結果Table 2　The Box-Behnken experimental response surface design and result

2.5回歸模型的檢驗

以料液比X1、乙醇濃度X2、超聲波時間X3、超聲波功率X4實驗因素，總黃酮提取率Y為考察指標的回歸模型為：

Y=40.96667+0.906667X1-0.795833X2+1.129167X3+ 1.906667X4-2.230417X12-0.69X1X2+0.335X1X3+ 0.995X1X4-9.756667X22+0.6325X2X3-0.61X2X4-3.609167X32-0.315X3X4-3.882917X42。

回歸方程中各變量對指標（響應值）影響的顯著性，由F檢驗來判定，概率p的值越小，則相應變量的顯著程度越高［15］。

模型的方差分析表3表明，此模型的復相關系數R2為0.9385，離均差為0.8668。響應面回歸模型達到極顯著水平（p=0.0001＜0.01）；失擬度F值為7.077289，p=0.130066＞0.05，說明該二次模型能夠擬合真實的實驗結果，實驗誤差小［16］。

表3　回歸模型方差分析Table 3　Analysis results of regression model

表4的結果表明，在所選擇的因素水平范圍內，對結果影響的主次順序為：X4＞X3＞X1＞X2，即超聲波功率＞超聲時間＞料液比＞乙醇濃度。其中，一次項中，超聲波功率對響應面值影響極顯著（p＜0.01），料液比、乙醇濃度、超聲波時間對響應面值影響不顯著；二次項中，乙醇濃度、超聲波時間、超聲波功率對響應面值影響極顯著（p＜0.01），料液比對響應面值影響顯著（p＜0.05）；各交互項的影響均不顯著。

表4　回歸方程系數及其顯著性檢驗Table 4　The coefficients of regression equation and the test of significance

2.6最佳條件優化

將回歸方程用LINGO語言進行分析，得到最佳方案為：料液比為1∶46.41373 g/mL、超聲波時間為25.76313 min、超聲波功率為1113.406 W、乙醇濃度59.4546%，羅望子殼中總黃酮提取率的理論值為81.70%。

驗證響應面法的可行性，因儀器設備的條件及便于方便操作，將以上條件參數做微小的修正：料液比為1∶47 g/mL、超聲波時間為26 min、超聲波功率為1080 W、乙醇濃度為60%。在此條件下，重復實驗3次，得到實際平均提取率為81.59%，與理論值相比，其相對誤差約為0.13%，可見該模型較好的預測了實驗結果。

李會瑞等［17］結合正交實驗采用乙醇浸泡工藝提取羅望子殼總黃酮的最佳工藝條件為：料液比1∶40 g/mL，乙醇濃度75%，溫度80℃，時間2.0 h，總黃酮得率為2.7%。按照李會瑞的計算方法，本研究的總黃酮得率為4.097%?？赡苁怯捎诔暡▽毎目栈饔?，促使細胞內物質溶出，提高了得率，也說明了通過響應面優化得出的提取條件能顯著提高羅望子殼中總黃酮的得率。

3　結論

本研究選取料液比、乙醇濃度、超聲波時間、超聲波功率四個因素進行單因素實驗，采用Box-Behnken響應面設計進行優化，建立響應面與各因素之間的數學模型，根據此二次回歸模型，確定羅望子殼總黃酮的最佳提取工藝參數為：料液比為1∶47 g/mL、乙醇濃度為60%、超聲波時間為26 min、超聲波功率為1080 W，在此條件下羅望子殼中總黃酮提取率達81.59%。本實驗中建立的數學模型能很好地預測各因素與提取率之間的關系。

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Optimization of ultrasonic assisted extraction conditions of flavonoids from Tamarindus indica shell by response surface method

WEN Pan，CHEN Ji-shu*，PEI Zhi-sheng，JIN Ya-ting
（Qiongzhou University，Sanya 572022，China）

The shell of Tamarindus indica as material，ethanol as extracting agent，the flavonoids in Tamarindus indics was extracted by ultrasonic assisted extraction.The extraction ratio of total flavonoids as index，material liquid ratio，ethanol concentration，ultrasonic time and ultrasonic power as factors，single factor test and response surface optimization test were taken.The results showed that the optimum extraction conditions of flavonoids from Tamarindus indica shell were concentration of ethanol 60%，liquid-solid ration of 1∶47（g/mL），ultrasonic time 26 min，and ultrasonic power 1080 W.Under the above optimized conditions，the yield of flavonoids from Tamarindus indica shell was 81.59%.

Tamarindus indica shell；flavonoids；ultrasonic；response surface methodology

TS209

B

1002-0306（2015）20-0248-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.044

2015－01－16

文攀（1983-），女，碩士研究生，實驗師，研究方向：植物活性成分開發與利用，E-mail：408597297@qq.com。

陳繼姝（1993-），女，本科，研究方向：植物活性成分開發與利用，E-mail：53663540@qq.com。

2013年國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201311100068）；三亞市院地科技合作項目（2013YD34）。