重組人色素上皮衍生因子對HaCaT細胞體外增殖和白細胞介素6、8及血管內皮生長因子表達的影響

李小瓊 魏志平 劉彥群

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重組人色素上皮衍生因子對HaCaT細胞體外增殖和白細胞介素6、8及血管內皮生長因子表達的影響

李小瓊 魏志平 劉彥群

目的 探討重組人色素上皮衍生因子（rhPEDF）對HaCaT細胞體外增殖和白細胞介素6（IL-6）、IL-8及血管內皮生長因子（VEGF）表達的影響。方法 HaCaT細胞分4組進行不同處理，分別為100 μg/L rhPEDF組、50 μg/L rhPEDF組、25 μg/L rhPEDF組及對照組（只加RPMI 1640培養液）。采用CCK8法檢測不同濃度rhPEDF作用于HaCaT細胞24、48、72 h后對細胞體外增殖的影響。RT-PCR和Western印跡法檢測rhPEDF對HaCaT細胞IL-6、IL-8、VEGF mRNA及其蛋白表達的影響。統計分析方法采用兩因素方差分析、單因素方差分析、SNK-q檢驗以及Pearson相關分析。結果 25、50、100 μg/L的rhPEDF作用24、48、72 h后對HaCaT細胞體外增殖均有不同程度的抑制作用。隨時間延長和rhPEDF濃度的增加，rhPEDF對HaCaT細胞體外增殖的抑制作用均逐漸增強（F=1115、329.9，均P＜0.001）。與對照組相比，不同濃度（100、50、25 μg/L）rhPEDF作用于HaCaT細胞48 h后，VEGF、IL-6、IL-8 mRNA及蛋白的表達均下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）。隨rhPEDF濃度的增加，各濃度rhPEDF組VEGF mRNA、IL-6和IL-8蛋白表達均出現下調，與對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；100 μg/L rhPEDF組的IL-6、IL-8 mRNA表達明顯低于25 μg/L rhPEDF組（P＜0.05）；100 μg/L rhPEDF組 VEGF蛋白表達分別低于 50、25 μg/L rhPEDF組（P＜0.05），而 50與25 μg/L rhPEDF組間差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 rhPEDF可抑制HaCaT細胞體外增殖，并可在mRNA及蛋白水平下調IL-6、IL-8、VEGF的表達。

角蛋白細胞；白細胞介素8；白細胞介素6；血管內皮生長因子類；銀屑病；色素上皮衍生因子；HaCaT細胞

色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor，PEDF）是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的一員，具有神經保護作用，能夠抑制多種腫瘤細胞及內皮細胞增殖，誘導凋亡，抑制血管新生［1］。在膀胱癌及前列腺癌的研究中發現，PEDF與白細胞介素 8（IL-8）的表達呈負相關，表現出抗炎作用［2-3］。Nakamura等［4］在最近的研究中發現，銀屑病患者血清中PEDF與IL-6呈負相關。Abe等［5］首次報告，PEDF源性肽能減輕銀屑病小鼠模型的棘層增厚和血管新生。本實驗研究了重組人色素上皮衍生因子（rhPEDF）對HaCaT細胞體外增殖和 IL-6、IL-8、血管內皮生長因子（VEGF）表達的影響，探討PEDF在銀屑病發病機制中的作用。

一、材料與方法

1.細胞與試劑：人永生化角質形成細胞株HaCaT細胞（上海復祥生物科技有限公司），rhPEDF（美國Peprotech公司），RPMI 1640培養基（美國Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），兔抗人IL-6、IL-8單克隆抗體（美國bioworld公司），兔抗人VEGF單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），鼠抗人β肌動蛋白單克隆抗體（美國Santa Cruz Biotechnology公司），堿性磷酸酶標記山羊抗兔IgG，馬抗小鼠IgG抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司），BCA試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），RT-PCR引物設計［生工生物工程（上海）股份有限公司］，逆轉錄及PCR試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］。

2.細胞培養及實驗分組：HaCaT細胞培養于含10%胎牛血清、1%青霉素、鏈霉素的RPMI 1640培養液中，置于37℃5%CO2飽和濕度培養箱中培養，待細胞長滿瓶底后，用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞，接種于培養瓶內，置培養箱中培養24 h貼壁后，更換無血清、無雙抗RPMI 1640培養液，并加入不同濃度rhPEDF。HaCaT細胞分為4 組，分別為 100 μg/L rhPEDF 組、50 μg/L rhPEDF 組、25 μg/L rhPEDF組及只加RPMI 1640培養液的對照組。

3.CCK8法檢測HaCaT細胞體外增殖：取HaCaT細胞6×103個/ml接種于96孔培養板，每孔100μl，培養24h，細胞貼壁后，按上述實驗分組分別加入不同濃度rhPEDF。每組設6個復孔，分別培養24、48、72 h后終止培養，棄去原培養基，將無血清、無雙抗RPMI 1640培養液與CCK8試劑按10∶1比例混勻，每孔加入100 μl，于培養箱中孵育2 h，酶標儀測定450 nm波長處每孔的吸光度（A值）。實驗重復3次。細胞增殖抑制率=（1－給藥組A值/對照組A值）×100%。

4.RT-PCR法檢測HaCaT細胞IL-6、IL-8、VEGF mRNA表達：實驗分組同上，培養24 h后提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA。目的基因IL-6上游引物：5′-ATTCCTTCTTCTGG TCAGAAACC-3′，下游引物：3′-ACAAAGGATATTCAAACTG CATAGC-5′，擴增片段為 205 bp；IL-8 上游引物：5′-TCTTGG CAGCCTTCCTGATTT-3′，下游引物：5′-CTGGCATCTTCACTG ATTCTTGG-3′，擴增片段為 320 bp；VEGF 上游引物：5′-CATGAACTTTCTGCTGTCTTGG-3′，下游引物：5′-GGTCTGC ATTCACATTTGTTGT-3′，擴增片段為396 bp；內參β肌動蛋白上游引物：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，下游引物：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′，擴增片段為241 bp。采用逆轉錄試劑盒將其逆轉錄得到cDNA。PCR反應體系為25 μl，擴增條件為94℃預變性3 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環，最后 72℃延伸5 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統掃描拍照，檢測各電泳條帶的灰度值，計算與β肌動蛋白比值，得到目的產物的相對含量。

5.Western印跡法檢測HaCaT細胞IL-6、IL-8及VEGF的表達：實驗分組同上，培養48 h后收集細胞，提取總蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，上樣80 μg進行電泳、轉膜及封閉，一抗孵育（兔抗人IL-6、IL-8單克隆抗體滴度為1∶1 000；兔抗人VEGF單克隆抗體為1∶200，鼠抗人β肌動蛋白單克隆抗體為1∶500），4℃過夜，二抗孵育（山羊抗兔IgG抗體的工作滴度為 1∶500；馬抗小鼠 IgG 抗體為 1∶500）2 h，BCIP/NBT顯色液顯色，凝膠成像系統觀察結果，目的蛋白條帶IL-6、IL-8、VEGF與相應內參β肌動蛋白條帶的灰度值比值作為其蛋白表達的半定量指標。

6.統計學分析：采用SPSS 13.0統計軟件，計量資料用±s表示。分析rhPEDF對HaCaT細胞體外增殖的影響隨時間和濃度變化的趨勢采用兩因素方差分析；多個均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；相關分析用Pearson相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

二、結果

1.rhPEDF 對 HaCaT 細胞增殖的影響：25、50、100 μg/L的rhPEDF作用24、48、72 h后對HaCaT細胞增殖均有不同程度的抑制。隨時間延長，抑制作用逐漸增強（F=1 115.000，P<0.001）；隨rhPEDF濃度增加，抑制作用也逐漸增強（F=329.900，P<0.001）；時間和濃度之間存在交互作用（F=72.148，P<0.001），說明時間因素的變化趨勢隨rhPEDF濃度不同而不同。見表1。

2.rhPEDF對 HaCaT細胞 IL-6、IL-8、VEGF mRNA 及其蛋白表達的影響：與對照組相比，不同濃度rhPEDF作用于HaCaT細胞48 h后，VEGF、IL-6、IL-8 mRNA 及蛋白的表達均下降，差異均有統計學意義（P<0.05）。隨rhPEDF濃度的增加，VEGF mRNA、IL-6和IL-8蛋白均出現下調，差異均有統計學意義 （P<0.05）；100 μg/L rhPEDF 組的 IL-6、IL-8mRNA 表達明顯低于 25 μg/L rhPEDF 組（P ＜ 0.05）；100 μg/L rhPEDF組VEGF蛋白表達分別低于50、25 μg/L rhPEDF組（P＜0.05），而在50和25 μg/L rhPEDF組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表1 重組人色素上皮衍生因子（rhPEDF）作用于HaCaT細胞不同時間對增殖抑制率的影響（%± s，n=3）

表1 重組人色素上皮衍生因子（rhPEDF）作用于HaCaT細胞不同時間對增殖抑制率的影響（%± s，n=3）

組別 24 h 48 h 72 h 100 μg/L rhPEDF 26.33±2.11 37.65±2.36 50.19±1.09 50 μg/L rhPEDF 19.32±2.46 27.82±0.87 41.92±3.01 25 μg/L rhPEDF 13.96±1.49 19.37±2.50 35.62±1.90

表2 重組人色素上皮衍生因子（rhPEDF）對HaCaT細胞白細胞介素6和8、血管內皮生長因子（VEGF）及其mRNA表達的影響（± s，n=3）

表2 重組人色素上皮衍生因子（rhPEDF）對HaCaT細胞白細胞介素6和8、血管內皮生長因子（VEGF）及其mRNA表達的影響（± s，n=3）

注：不同濃度rhPEDF組白細胞介素6和8、VEGF及其mRNA相對表達量分別與對照組相比，均P＜0.05

組別 白細胞介素6 白細胞介素8 VEGF mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白100 μg/L rhPEDF 0.411±0.098 0.637±0.022 0.551±0.049 0.411±0.015 0.507±0.109 0.428±0.082 50 μg/L rhPEDF 0.567±0.066 0.761±0.038 0.700±0.073 0.501±0.015 0.695±0.027 0.700±0.091 25 μg/L rhPEDF 0.755±0.048 0.939±0.049 0.763±0.071 0.695±0.039 0.874±0.063 0.838±0.093對照組 1.031±0.197 1.153±0.007 0.974±0.129 0.848±0.021 1.035±0.059 1.106±0.071 F值 15.436 165.000 12.441 169.834 30.300 36.627 P值 0.001 ＜0.001 0.002 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

三、討論

PEDF在人體中分布廣泛，具有抗增殖、抗血管新生、抗炎等作用，現已成為腫瘤及血管新生、炎癥性相關疾病治療的新靶點［1］。銀屑病是慢性炎癥性皮膚病，其組織病理學特征包括角質形成細胞過度增殖，角化不全，表皮內中性粒細胞浸潤，真皮乳頭血管增生、迂曲等［6］。Li等［7］的研究表明，rhPEDF對HaCaT細胞體外增殖具有抑制作用，并發現VEGF165能夠促進HaCaT細胞PEDF的表達。本實驗結果也證明，rhPEDF對HaCaT細胞的增殖具有顯著抑制作用。

PEDF不僅能夠抑制多種細胞增殖，還是重要的血管生長抑制因子［1］。微血管生成異常與銀屑病的發生發展、持續存在及復發有密切關系，VEGF是新血管生成不可缺少的誘導因子［8］。銀屑病皮損中大量增殖的角質形成細胞分泌VEGF，并能促進角質形成細胞分泌較多的促炎因子如IL-6和IL-8［9］。研究發現，PEDF能抑制腫瘤細胞及血管內皮細胞VEGF的表達［1］，而PEDF源性肽能抑制銀屑病小鼠模型的血管新生［5］，推測PEDF通過抑制角質形成細胞VEGF表達，進而抑制銀屑病的血管新生。本實驗結果也顯示，隨著rhPEDF濃度增高，HaCaT細胞中VEGF mRNA和蛋白表達逐漸下調。

在糖尿病視網膜疾病的研究中發現，PEDF不僅抑制VEGF的表達，而且抑制TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達，表現出抗炎作用［10］。Hirsch 等［3］的研究表明，PEDF 能夠通過抑制前列腺癌細胞中IL-8的表達，達到抗炎及抗增殖作用。Nakamura等［4］認為，PEDF可能在銀屑病發病機制中發揮抗炎作用。銀屑病皮損角質形成細胞通過分泌多種細胞因子參與局部免疫反應，如IL-8參與中性粒細胞聚集及膿腫的形成，誘導炎癥反應［11］。研究表明，銀屑病皮損局部及外周血中IL-6、IL-8表達均增高，高表達的IL-6、IL-8又能促進角質形成細胞的增生［11-12］。因此，抑制銀屑病角質形成細胞炎癥因子的表達，對抑制炎癥反應有重要作用。本實驗結果表明，rhPEDF能夠抑制HaCaT細胞IL-6、IL-8 mRNA和蛋白的表達。

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Effects of recombinant human pigment epithelium derived factor onin vitroproliferation of and expressions of interleukin-6,-8 and vascular endothelial growth factor in cultured human HaCaT keratinocytes

Li Xiaoqiong,Wei Zhiping,Liu Yanqun.Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College,Xuzhou 221002,Jiangsu,China

ObjectiveTo investigate the effects of recombinant human pigment epithelium derived factor（rhPEDF）onin vitroproliferation of and expressions of interleukin 6（IL-6）,IL-8 and vascular endothelial growth factor（VEGF）in cultured human HaCaT keratinocytes.MethodsSome cultured HaCaT cells were treated with rhPEDF at various concentrations（25,50,100 μg/L）for different durations,and some treated with RPMI 1640 medium only served as the control group.Cell counting kit-8（CCK8）assay was performed to evaluate cell proliferation after 24-,48-and 72-hour treatment,reverse transcription （RT）-PCR to measure the mRNA expressions of IL-6,IL-8 and VEGF in HaCaT cells after 24-hour treatment,and Western blot to detect the protein expressions of IL-6,IL-8 and VEGF in HaCaT cells after 48-hour treatment.Statistical analysis was carried out by two-and one-way analysis of variance,Student-Newman-Keuls（SNK）-qtest and Pearson correlation analysis.ResultsAfter treatment with rhPEDF of 25－100 μg/L for 24 － 72 hours,the proliferation of HaCaT cells was significantly inhibited to different extents compared with the control group（all P ＜ 0.05）,and the inhibition rate significantly increased with the increase in treatment duration and concentrations of rhPEDF（F=1115,329.9,respectively,bothP ＜ 0.001）.Moreover,there was a significant decrease in the expressions of IL-6,IL-8 and VEGF mRNAs（at 24 hours）and proteins（at 48 hours）in HaCaT cells after treatment with rhPEDF of 25 － 100 μg/L compared with the control group（allP ＜ 0.05）.The expression levels of VEGF mRNA as well as IL-6 and IL-8 proteins all significantly decreased with the increase of rhPEDF concentrations （allP ＜ 0.05）.The mRNA expressions of IL-6 and IL-8 were significantly lower in the 100-μg/L rhPEDF group than in the 25-μg/L rhPEDF group（bothP ＜ 0.05）,and the protein expression of VEGF was significantly weaker in the 100-μg/L rhPEDF group than in 25-and 50-μg/L rhPEDF groups （bothP ＜ 0.05）,but similar between the 25-and 50-μg/L rhPEDF groups （P ＞ 0.05）.ConclusionsrhPEDF can inhibit the proliferation of HaCaT cells,and down-regulate the mRNA and protein expressions of IL-6,IL-8 and VEGF.

Keratinocytes;Interleukin-8;Interleukin-6;Vascular endothelial growth factors;Psoriasis;Pigment epithelium derived factor;HaCaT cells

Wei Zhiping,Email:xzwzp1961@aliyun.com

作者單位：221002江蘇，徐州醫學院附屬醫院皮膚科

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.08.015

魏志平，Email：xzwzp1961@aliyun.com

2014-10-24）

（本文編輯：周良佳 顏艷）