梅毒螺旋體Tp0751蛋白在早期梅毒兔模型皮損轉錄水平的研究

柯吳堅 楊慧蘭 楊斌 鄭和平 楊立剛 陳征宇薛耀華 任旭琦 呂萍 張曉輝 王柳苑

梅毒螺旋體Tp0751蛋白在早期梅毒兔模型皮損轉錄水平的研究

柯吳堅 楊慧蘭 楊斌 鄭和平 楊立剛 陳征宇薛耀華 任旭琦 呂萍 張曉輝 王柳苑

目的探討梅毒螺旋體（Tp）Tp0751蛋白在早期梅毒兔模型中轉錄水平變化情況。方法3只新西蘭白兔背部剔毛，皮下注入107/ml Tp Nichols Seattle株0.1 ml，共10處，建立早期兔梅毒感染模型。同時于未注射部位行皮膚活檢術，切取0.4 cm×0.4 cm皮膚作為陰性對照。每天觀察注射部位皮膚變化情況，測量并記錄皮疹大小。每隔3天切取1處注射部位0.4 cm×0.4 cm皮膚用于Tp0751和Tp0574 mRNA檢測。整個實驗過程30 d，共行11次皮膚活檢。熒光定量PCR連續動態觀察兔硬下疳皮損形成過程中Tp0751 mRNA表達的差異。結果新西蘭白兔皮下注入Tp后，背部在第6天出現紅色丘疹，到第19天皮疹達最大并出現潰瘍，形成硬下疳。第25天，全身陸續出現播散性二期梅毒疹。Tp0574和Tp0751 mRNA水平在早期呈現上升趨勢，到第15天達最高峰（與其他各時間點比較，均P＜0.05），其后迅速下降，在第27天有少許上升。標準化的Tp0751 mRNA從第15天起轉錄水平逐漸升高，到第24天達最高峰（P＜0.05）。結論標準化Tp0751轉錄水平在Tp被清除后期出現全身播散性二期梅毒疹前高表達。表明Tp0751蛋白可能參與Tp全身播散。

蒼白密螺旋體；梅毒；模型，動物；兔；Tp0751蛋白

梅毒是由梅毒螺旋體（Treponema pallidum，Tp）感染引起的一種性傳播疾病。在自然宿主中，Tp感染始于暴露的黏膜表面或表皮微損傷，隨后Tp在感染入口處繁殖并通過循環系統播散全身［1］。體外研究顯示，Tp可通過Tp0751蛋白黏附到宿主體內的層黏連蛋白，并經自催化裂解作用降解層黏連蛋白和纖維蛋白原［2-6］，提示Tp在感染過程中利用Tp0751在體內進行播散［2］。我們建立梅毒早期感染兔模型，連續觀察Tp0751蛋白在皮損中轉錄水平變化情況，以期從宿主方面探討Tp播散的機制。

一、動物來源

新西蘭白兔3月齡，3 kg重，購于南方醫科大學實驗動物中心，合格證號44002100005265。予不含抗生素的飼料和水喂養，取血清行性病研究實驗室試驗（VDRL）和梅毒螺旋體免疫熒光抗體試驗（FTA）以排除兔梅毒螺旋體感染。將檢測結果全陰性新西蘭白兔3只用于后續動物實驗。

二、方法

1.Tp0751序列分析和引物設計：從基因庫和DNA資料庫中搜索Tp0751氨基酸和核酸序列（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Treponema%20pallidum），用BioEdit 7.1軟件（http://bioedit.software.informer.com/7.1/）對密螺旋體屬的5個梅毒蒼白密螺旋體（Nichols、DAl-1、Chicago、Mexico A 和SS-14）、3 個雅司蒼白密螺旋體（Samoa D、CDC2 和 Gauthier）和1個未分類的類人猿密螺旋體（Fribourg-Blanc）進行多重序列比對。應用引物設計軟件Primer 3：WWW primer tool（http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi）對基因庫查詢到Nichols株Tp0751基因序列（序列號：NC_000919.1）進行引物設計。用Restriction Mapper（http://www.restrictionmapper.org/）和NEBcutter V2.0.（http://tools.neb.com/NEBcutter2/）預判待擴增的DNA序列不被HindⅢ限制性內切酶（英國New England Biolabs公司）酶切。Tp0751正向引物：5′-ATGATACCTTCGGCGCTCTA-3′，反向引物：5′-CTATGCGCATTGCTGTTTGT-3′，擴增片段204 bp。管家基因Tp0574 正向引物：5′-CGTGTGGTATCAACTATGG-3′，反向引物：5′-TCAACCGTGTACTCAGTGC-3′，擴增片段 313 bp。Tp0574引物和質粒標準品由華盛頓大學Giacani教授饋贈。

2.Tp傳代培養：取2 ml凍存的108/ml Tp Nichols Seattle株（由華盛頓大學Lukehart教授饋贈）接種于新西蘭白兔雙側睪丸，每個睪丸接種1 ml。待7～10 d形成睪丸炎后，處死兔子，手術取睪丸，切碎、離心制備成108/ml菌懸液。為使Tp恢復毒力，再次按以上步驟傳代于另一只新西蘭白兔睪丸并提取Tp后用于建立早期梅毒兔模型。

3.早期梅毒兔模型建立：3只新西蘭白兔背部剔毛，每只兔皮下注入107/ml Tp Nichols Seattle株0.1 ml，共10處。同時于未注射部位行皮膚活檢術，切取0.4 cm×0.4 cm皮膚作為陰性對照。每天觀察注射部位皮膚變化情況，測量并記錄皮疹大小。每隔3天切取1處注射部位0.4 cm×0.4 cm皮膚用于Tp0751和Tp0574 mRNA檢測。整個實驗過程30 d，共行11次皮膚活檢。

4.總RNA提取和cDNA合成：用Ultraspec RNA分離液（美國Biotecx公司）從兔皮膚組織和兔睪丸提取的Nichols Seattle株菌懸液分離提取總RNA；用Turbo DNA酶（美國Ambion公司）去除總RNA中基因組DNA；用SuperScriptⅢ第1鏈合成系統（美國Invitrogen公司）合成cDNA，以上過程嚴格按試劑盒說明書操作。

5.PCR擴增Tp0751：以兔睪丸Nichols Seattle株cDNA為模板，PCR擴增Tp0751 mRNA。50 μl PCR擴增反應體系：5 μl待測 cDNA 樣本、200 μmol/L dNTPs、5 μl 10 × Go Taq PCR緩沖液 （美國 Promega 公司）、1.5 mmol/L MgCl2、0.6 μmol/L Tp0751引物、0.5 U熱啟動Taq PCR聚合酶（美國Promega公司）。擴增條件：95℃變性 10 min；95℃ 1 min、60℃ 2 min、72℃1 min，共45個循環；最后72℃延伸10 min。擴增PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

6.Tp0751質粒標準品構建：將4 μl Tp0751 PCR擴增產物克隆至TOPO TA克隆pCR 2.1質粒（美國Life Technologies公司）。將重組質粒轉化到TOP 10感受態細胞（美國Invitrogen公司）。挑選10個菌落，用常規PCR法（同上）驗證轉化子。取PCR驗證正確的轉化子搖菌過夜，Plasmid Mini試劑盒（德國Qiagen公司）提取質粒。雙向DNA測序法（美國Genewiz公司）再次驗證重組質粒。線性質粒經限制性內切酶HindⅢ（Promega）酶切過夜。用PCR純化試劑盒（德國Qiagen公司）純化酶切后質粒。NanoDrop-1000分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）檢測質粒濃度。質?？截悢涤嬎愎?=［（6.02× 1023拷貝數）×（質粒濃度 g/μl）］/［擴增產物堿基數 ×（660 道爾頓/bp）］［7］。根據計算結果，10 倍倍比稀釋質粒（106～ 100）拷貝數/μl。為獲得可靠的標準曲線，每個不同濃度的質粒在LightCycle擴增儀（瑞士Roche公司）重復擴增6次。標準曲線最大可接受誤差閾值設置為0.05。

7.實時熒光定量PCR檢測Tp0751和Tp0574 mRNA：參考LightCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green試劑盒說明，熒光定量PCR檢測早期梅毒兔模型皮損Tp0751和Tp0574轉錄水平。以兔睪丸Nichols Seattle株cDNA為陽性對照，以分子水（mH2O）為陰性對照。反應體系：5 μl待測cDNA 樣本、1 μmol/L Tp0751 或 Tp0574 引物、4 μl 5 × Master Mix、9 μl mH2O。反應條件：95℃變性 10 min；95℃ 10 s、60℃8 s、72℃13 s，共45個循環；最后72℃延伸10 min。當每個循環擴增溫度達引物采集溫度（88℃）時，SYBR Green結合到雙鏈DNA并釋放熒光，在530 nm處可檢測到熒光信號。每次檢測均加入已知濃度的質粒標準品作為內參。每個樣本重復檢測3次。LightCycler software（3.5版本）分析檢測結果。根據熔解曲線排除非特異性擴增和形成的引物二聚體。

圖1 早期梅毒兔模型一期和二期皮疹形成過程 1A：皮下注入107/ml Tp Nichols Seattle株后第7天，背部見高出皮膚的紅色小丘疹；1B：第21天，背部紅色丘疹增大，正中出現潰瘍；1C：第30天，背部丘疹變平，潰瘍結痂消失；1D：第25天，背部出現播散性淡紅色斑丘疹；1E：第28天，背部播散性斑丘疹變大、顏色加深

三、結果

1.Tp0751序列分析結果：從基因庫中搜索到9個密螺旋體的Tp0751氨基酸和核酸序列進行多重序列比對，結果顯示，9個密螺旋體的Tp0751的基因序列完全一致，并未出現基因突變、插入或缺失等情況。

2.早期梅毒兔模型一期和二期皮疹形成過程：予兔背部皮下注入107/ml Tp Nichols Seattle株0.1 ml，第6天，可見直徑0.5 cm、邊界清楚、質地略硬的紅色小丘疹。隨著時間增加，丘疹逐漸增大、高出皮膚，顏色加深。到第19天時，皮疹增大到直徑2.1 cm，正中出現直徑0.2 cm潰瘍。持續4～5 d后，皮疹逐漸變小，顏色變淡，潰瘍處結痂、消失（圖1A～1C）。從第25天起（圖1D），兔模型全身陸續出現散在的淺紅色的播散性二期梅毒疹。隨著時間的增加，紅色丘疹逐漸加深、變大、高出皮膚（圖1E），5～7 d后變平并消失。

3.實時熒光定量PCR檢測Tp0751和Tp0574 mRNA水平：制備的Tp0751質粒標準品其拷貝數達5.85×109拷貝/μl，予10倍倍比稀釋建立標準曲線后，分別對Tp早期兔模型不同時間皮損Tp0574和Tp0751 mRNA進行動態表達水平檢測，發現二者的mRNA水平呈現逐漸上升，到第15天達最高峰后迅速下降，隨后在第27天又有小幅上升。各時間點Tp0574和Tp0751 mRNA水平經One-Way ANOVA分析比較，差異有統計學意義（分別F=14.54、9.677，均P＜0.000 1）。用SNK法對各時間點均值間兩兩比較，在第15天Tp0574和Tp0751轉錄水平均達最高（P＜0.05）。見表1。

將Tp0751 mRNA熒光定量PCR檢測結果與Tp管家基因Tp0574進行定量比較，最終獲得標準化Tp0751 mRNA動態表達水平。經One-Way ANOVA分析比較，各時間點轉錄水平差異有統計學意義（F=4.367，P=0.0003）。各時間點均值間兩兩比較，標準化Tp0751轉錄水平在早期呈持續穩定表達，從第15天起，其轉錄水平呈上升趨勢，在第24天也即出現二期全身播散性梅毒疹前1天，達最高峰（P＜0.05），隨后呈下降趨勢。

四、討論

多種病原體通過細胞外基質（ECM）層黏連蛋白侵入附著到宿主組織［5］。對Tp基因組預測的編碼外膜蛋白的開放閱讀框（ORF）進行分析，并重組表達這些蛋白質發現，Tp外膜蛋白Tp0751具有黏附層黏連蛋白功能［6］。進一步研究顯示，Tp0751 可黏附到層黏連蛋白 1、2、4、8、10 亞型［5］。感染過程中，當高度侵襲性病原體的黏附素遇到宿主體內各種組織時，這種廣泛的黏附功能將發揮其普遍黏附作用［5］。與其他侵襲性病原體（如肺炎鏈球菌、鼠疫耶爾森菌、霍亂弧菌和產氣莢膜梭菌等）相似，Tp可表達Tp0751蛋白，該蛋白可結合并降解人纖維蛋白原和層黏連蛋白［2-3］。Houston 等［3］對 Tp0751一級序列分析顯示，其C端存在HEXXH金屬蛋白酶基序，通過引入 3個獨立突變點 （AEXXH［H198A］，HAXXH［E199A］和 HEXXA［H202A］）可阻止 Tp0751介導纖維蛋白凝塊溶解作用，但該點突變不影響Tp0751與宿主成分黏附作用［2］，提示Tp0751基因的保守性在Tp體內播散中具有重要作用。

表1 實時熒光定量PCR動態檢測早期兔模型不同時間皮損Tp0751和Tp0574 mRNA結果（±s）

表1 實時熒光定量PCR動態檢測早期兔模型不同時間皮損Tp0751和Tp0574 mRNA結果（±s）

注：n=3。a：用SNK法對各時間點均值間兩兩比較，Tp0574和Tp0751轉錄水平與其他時間點比較，差異均有統計學意義，P＜0.05

活檢時間 Tp0751拷貝/μl Tp0574拷貝/μl Tp0751×100/Tp0574第6天 1.78±2.68 17.78±23.45 3.68±5.54第9天 1.96±1.40 30.22±19.96 9.44±10.36第12天 9.57±8.07 106.83±80.65 8.16±2.91第15天 32.50±19.48a 490.33±338.64a 7.01±0.94第18天 12.28±7.21 126.78±74.29 9.85±2.02第21天 0.76±0.56 8.78±5.83 12.08±7.59第24天 2.09±1.90 6.89±2.71 29.31±20.93a第27天 11.41±17.31 44.22±59.25 13.58±13.79第30天 1.62±1.67 7.22±8.32 11.08±9.22

本研究予3只兔背部皮下注入Nichols Seattle株，每隔3天行皮膚活檢術，取皮損行Tp0751和Tp0574 mRNA熒光定量PCR檢測。在皮下注入Tp后第6天出現紅色小丘疹。隨時間的增加，丘疹逐漸增大。當到第19天時，皮疹達最大并出現潰瘍。在第25天，早期兔模型出現全身播散性紅色、略高于皮膚的二期梅毒疹。二期梅毒疹持續5～7 d后消失。以上實驗與Godornes等［6］建立的早期梅毒模型觀察到的結果相似，證明早期梅毒兔模型建立成功。分別對Tp早期兔模型皮損Tp0574和Tp0751 mRNA進行動態表達水平檢測發現，二者的mRNA水平呈現逐漸上升趨勢，到第15天達最高峰（P＜0.05），其后迅速下降。雖然在第27天又有少許上升，但差異無統計學意義（P＞0.05）。Tp0574和Tp0751轉錄水平與Tp在宿主一期皮損內增殖（早期轉錄水平增加）和誘導宿主后天抗感染免疫所致的病原體清除（后期下降）的過程相平行，進一步支持早期梅毒模型建立成功。

Tp0751轉錄水平受皮損內Tp數量多少影響，為獲得標準化Tp0751 mRNA水平，我們需要選用合適的參比基因作為對照，以期獲得可靠的實驗數據。Giacani等［8］為檢測不同Tp菌株感染兔模型睪丸中tpr基因mRNA表達水平，選擇多個Tp高轉錄表達基因如47 000的脂蛋白基因（Tp0574）、flaA 基 因 （Tp0249）、tpp17 基 因 （Tp0435）、groEL 基 因（Tp0030）和V型ATP酶的A亞基（Tp0426）進行轉錄水平分析。結果發現，Tp0574和Tp0426基因二者在不同Tp菌株感染峰值間的表達差異最低，因此，建議使用任一基因作為參照基因用于mRNA表達標準化的參考基因。此外，Smajs等［9］研究顯示，Tp0574在Tp體內持續穩定表達，通過計算Tp0574 cDNA/DNA比值（17.7）可間接計算出皮損內Tp感染數。為此，我們選用Tp管家基因Tp0574作為Tp0751標準化的參比基因，最終獲得較為客觀的Tp0751轉錄水平動態變化趨勢。

Tp自然感染過程始于黏附到暴露的黏膜表面或表皮微損傷，隨后Tp開始在感染入口處繁殖并誘導產生一期梅毒皮損（硬下疳），該皮損含有大量的螺旋體。硬下疳持續存在，直到宿主后天抗感染免疫的形成，引發調理吞噬介導的病原體清除，從而使硬下疳皮損自然消退［10-11］。雖然在一期梅毒皮損形成的早期Tp就開始播散并侵入身體各處，但Turner等［12］研究證實，二期梅毒主要由Tp通過造血系統在體內的播散所致。Reid等［13］根據對TprK可變區異質性研究顯示，96%的二期梅毒疹由于單個Tp的體內再次播散所致。

我們的結果顯示，Tp0574和Tp0751 mRNA在接種Tp第15天后迅速下降，提示兔模型皮損內Tp被宿主局部后天抗感染免疫大量清除，從而使二者mRNA水平表達下降。而標準化的Tp0751從第15天起轉錄水平逐漸升高，在第24天（即出現全身播散性二期梅毒疹前1天）達最高峰（P＜0.05）。根據前期體外Tp0751的黏附和播散功能研究結果，結合以上數據，我們推測，在早期梅毒皮損形成后期，Tp為了對抗宿主后天抗感染免疫引發調理吞噬介導的清除作用，通過高度表達Tp0751蛋白降解層黏連蛋白和纖維蛋白原，進而在宿主體內播散。

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Transcript levels of theTreponema pallidumprotein Tp0751 in skin lesions of a rabbit model of early syphilis

Ke Wujian*,Yang Huilan,Yang Bin,Zheng Heping,Yang Ligang,Chen Zhengyu,Xue Yaohua,Ren Xuqi,Lyu Ping,Zhang Xiaohui,Wang Liuyuan.*Guangdong Provincial Dermatology Hospital,Guangzhou 510009,China

ObjectiveTo trace changes in the transcript level of theTreponema pallidum（Tp）protein Tp0751 in skin lesions of a rabbit model of early syphilis.MethodsThree New Zealand white rabbits were intracutaneously injected with 0.1 ml of Tp （Nichols Seattle strains）suspensions （107treponemes/ml）at 10 sites on the shaved back to establish a model of early syphilis.All the rabbits

a single injection with the total amount of treponemes being 107.Then,skin changes at injection sites were observed,and the size of skin rashes was recorded on a daily basis.Skin specimens sized 0.4 cm × 0.4 cm were excised from an injection site and a non-injection site（negative control）separately every 3 days for the detection of Tp0751 and Tp0574 mRNAs.The whole experiment lasted 30 days,and a total of 11 skin biopsies were carried out.Fluorescence-based quantitative PCR was performed to measure the mRNA expressions of Tp0751 and Tp0574 continuously and dynamically during the development of chancre.ResultsAfter intracutaneous injection of Tp suspensions,red papules occurred on the back of rabbits on day 6,and reached maximum size on day 19 with the formation of ulcer and chancre.On day 25,disseminated secondary syphilides gradually appeared all over the body surface of the rabbits.The mRNA expression levels of Tp0574 and Tp0751 increased at the early stage,peaked onday 15（compared with the other time points,allP＜0.05）,thereafter rapidly declined,but rose slightly on day 27.The standardized expression level of Tp0751 mRNA increased gradually after day 15,and peaked on day 24（compared with the other time points,allP＜ 0.05）.ConclusionThe transcript level of Tp0751 was high in rabbits at the late stage of Tp clearance when generalized disseminated secondary syphilides had not appeared,suggesting that Tp0751 may be involved in the systemic spread of Tp.

Treponema pallidum;Syphilis;Models,animal;Rabbits;Tp0751 protein

s:Yang Huilan,Email:huilany88@hotmail.com;Yang Bin,Email:yangbin101@hotmail.com

作者單位：510009廣州，廣東省皮膚性病防治中心（柯吳堅、楊斌、鄭和平、楊立剛、陳征宇、薛耀華、任旭琦、呂萍、張曉輝、王柳苑）；廣州軍區廣州總醫院（楊慧蘭）

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.12.011

廣東省醫學科研基金指令性課題（C2012032）

楊慧蘭，Email：huilany88@hotmail.com；楊斌，Email：yangbin101@hotmail.com

2015-03-17）

（本文編輯：吳曉初）