組織蛋白酶D綠色熒光蛋白復合質粒轉染技術在慢性光損傷成纖維細胞研究中的作用

鄭躍 陳海燕 許慶芳 葉聰秀 劉惠嫻 易金玲 賴維

組織蛋白酶D綠色熒光蛋白復合質粒轉染技術在慢性光損傷成纖維細胞研究中的作用

鄭躍 陳海燕 許慶芳 葉聰秀 劉惠嫻 易金玲 賴維

目的探討組織蛋白酶D綠色熒光蛋白復合質粒（GFP-CatD）技術在成纖維細胞慢性光損傷研究中的作用。方法長波紫外線（UVA）25 J/cm2每天照射人皮膚成纖維細胞1次，共21 d，構建慢性光損傷成纖維細胞模型。構建GFP-CatD質粒，將其轉染入慢性光損傷成纖維細胞，熒光顯微鏡觀察綠色熒光標記的組織蛋白酶D表達，Western印跡檢測組織蛋白酶D表達，流式細胞儀檢測轉染GFP-CatD后的慢性光損傷成纖維細胞凋亡率，噻唑藍（MTT）法檢測細胞增殖率。結果慢性光損傷成纖維細胞轉染GFP-CatD質粒96 h，可見綠色熒光蛋白組織蛋白酶D在慢性光損傷細胞胞質內表達。Western印跡結果顯示，慢性光損傷成纖維細胞轉染GFP-CatD質粒后，組織蛋白酶D蛋白表達為未轉染細胞的1.28倍。細胞凋亡檢測結果發現，轉染后的光老化成纖維細胞凋亡細胞率為4.29%±1.30%，與無轉染的空白對照組凋亡細胞率3.03%±1.70%比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。MTT細胞增殖檢測結果發現，轉染后的光老化成纖維細胞的細胞增殖率為45.20%±4.70%，無轉染質粒的光老化成纖維細胞為43.60%±3.90%（P＞0.05）。結論GFP-CatD復合質粒轉染慢性光損傷成纖維細胞可示蹤到組織蛋白酶D熒光蛋白，且不影響慢性光損傷成纖維細胞原有的正常生物活性和周期。

組織蛋白酶D；成纖維細胞；質粒；細胞衰老；皮膚衰老；紫外線

近年來研究發現，除了基質金屬蛋白酶（MMP）家族外，溶菌酶、膠原酶、組織蛋白酶（cathepsin）等多種酶類均參與皮膚光老化發生［1-5］。我們的前期研究發現，組織蛋白酶D（CatD）與皮膚光老化發生密切相關［2-3］。但CatD究竟是通過誘導細胞老化、抑制光誘導變性的細胞外基質清除、減弱正常細胞分裂修復功能作用還是其他途徑參與光老化發生機制，尚不清楚。在本研究中，我們用CatD綠色熒光蛋白復合（GFP-CatD）質粒技術，為更好示蹤、調控CatD在光老化細胞中的表達及遷移，進一步闡明CatD在皮膚光老化中的作用機制奠定基礎。

一、材料

胰酶、胎牛血清（FBS）、LB培養基、DMEM培養基（美國Gibco BRL公司）。鏈霉素、氨芐西林（美國Sigma公司）。紫外光源為德國沃曼UV801KL。一抗兔抗人CatD單克隆IgG抗體，內參照兔抗人GAPDH多克隆IgG抗體，二抗HRP-羊抗兔IgG（美國Santa Cruz公司）。BCA蛋白定量試劑盒（美國Pierce公司）。ECL顯色試劑盒，預染標準參照物（加拿大Ferments公司）。噻唑藍（MTT）試劑盒（美國Sigma公司）。細胞凋亡試劑盒（南京凱基公司）。質粒提取試劑盒（德國Qiagen公司）。內切酶及連接酶（美國New England Biolabs公司）。

二、方法

1.構建GFP-CatD質粒：用EcoRI、XhoI進行酶切，同時選擇PEGF-N1作為克隆表達載體。酶切反應體系（總體系量40 μl）包括 EcoR 1 μl、緩沖液 4 μl、ddH2O 25 μl、10 × BSA 4 μl、Xho I 1 μl及克隆表達載體 PEGF-N1 5 μl。酶切后進行PCR擴增，隨后進行連接反應。連接反應體系（總量10 μl）包含酶切回收的載體 DNA（100 ng/μl）1 μl、退火雙鏈 DNA（100 ng/μl）1 μl、10 × T4 DNA 連接酶緩沖液 1 μl、T4 DNA 連接酶 1 μl、ddH2O 去離子水 6 μl。42 ℃水浴熱休克 90 s。快速將管轉移至冰浴中，冰浴2 min。分別加入500 μl LB培養基，混勻，37℃、30×g，振蕩培養 40 min 后，將 150 μl菌液涂布于含氨芐西林（100 mg/L）的LB平板表面，室溫下放置，至液體吸收。倒置平板，轉移入37℃生化培養箱過夜培養。然后從平板上面挑取大腸桿菌單菌落進行擴增培養，加入含有相應抗生素的3 ml LB培養液中37℃過夜培養，用高純質粒小量提取試劑盒,按試劑說明書步驟提取質粒，質粒進行酶切鑒定并送廣州萊德爾生物科技有限公司測定分析。

2.構建慢性光損傷成纖維細胞模型：取3～6歲小兒包皮環切術包皮，參照文獻［3］分離，DMEM培養基培養成纖維細胞，3～5代細胞凍存。細胞復蘇后用長波紫外線（UVA）每天照射人皮膚成纖維細胞1次，照射劑量為25 J/cm2，共21 d。照射期間，細胞常規5～7 d進行傳代。誘導后的慢性光損傷成纖維細胞分為3組：①處理組：為轉染GFP-CatD質粒的慢性光損傷成纖維細胞；②空白對照組：為轉染空白GFP質粒（即不含CatD片段的GFP質粒）的慢性光損傷成纖維細胞；③陰性對照組：為不轉染質粒的慢性光損傷成纖維細胞。

3.復合質粒轉染慢性光損傷成纖維細胞模型：轉染前1d，將慢性光損傷細胞以3×106接種于培養板中。用50 μl不含血清培養基Opti-MEM?稀釋1.25 ml（20 μmol/L）的GFPCatD質粒儲存液，輕輕混勻，室溫孵育5 min。將稀釋后的GFP-CatD質粒貯存液及lipo2000輕輕混勻，制備成GFPCatD-lipo2000混合液室溫孵育20 min。同時設置不含CatD片段的GFP空白質粒為對照，制備GFP-lipo2000混合液。將GFP-CatD-lipo2000混合液及GFP-lipo2000混合液分別加入含有慢性光損傷細胞的400 μl培養基（v2）的培養孔中，輕輕混勻，培養4～6 h，待GFP-CatD轉染入細胞，將孔中剩余的GFP-CatD-lipo2000混合液的培養基移去，更換新培養基，將培養板置于37℃的CO2培養箱中培養96 h。

4.示蹤熒光標記的CatD：轉染后96 h，細胞開始表達目的蛋白，用510 nm波長光激發，熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白細胞內表達。

5.Western印跡：GFP-CatD質粒以及空白GFP質粒轉染后96 h，提取細胞總蛋白保存-70℃冰箱。BCA法蛋白定量。制備不連續SDS-PAGE，加樣孔注入提取液（目的蛋白25～30 μg）及5 μl標準蛋白90 V衡壓30 min，后120 V衡壓90 min條件下SDS-PAGE電泳。電泳凝膠上的蛋白質100 V 50 min電轉印到PVDF膜。一抗兔抗人CatD-IgG（濃度1∶1 000），內參照兔抗人 GAPDH-IgG（濃度 1∶1 500），4 ℃孵育12 h，TBST液洗膜，加入 HRP-羊抗兔 IgG（濃度 1∶1 000）37℃孵育1 h，TBST液洗膜。ECL顯色試劑盒，A液及B液1∶1混合，孵育膜2～3 min，見到熒光即與X線片一起置于暗盒曝光，顯影液顯影，定影液定影。所有實驗重復3次。

6.MTT法檢測細胞增殖：GFP-CatD質粒以及空白GFP質粒轉染細胞后96 h，用含10%胎小牛血清得培養液配成單一細胞懸液，以每孔5 000個細胞接種到96孔板，每孔體積200 μl。培養 3～ 5 d后，每孔加 MTT 溶液（5 g/L）20 μl。繼續孵育4 h，終止培養，吸棄孔內培養上清液，每孔加150 μl DMSO，振蕩10 min。酶聯免疫監測儀490 nm波長測定各孔吸光度值。

7.細胞凋亡檢測：轉染后的慢性光損傷成纖維細胞細胞用5%胰酶消化，調整細胞濃度為1×106個/ml。根據細胞凋亡試劑盒內的凋亡檢測說明書步驟，每組取1 ml細胞，300×g，4℃離心10 min，棄上清。加入1 ml預冷的PBS，輕輕振蕩使細胞懸浮，300×g，4℃離心10 min，棄上清。重復PBS洗滌3次。將細胞重懸于200 μl結合緩沖液。加入10 μl Annexin V-FITC 和 10 μl PI，輕輕混勻，4 ℃反應 30 min。加入 300 μl結合緩沖液，即刻于流式細胞儀上檢測細胞凋亡率。

圖1 人成纖維細胞UVA每天照射1次，照射劑量為25 J/cm2，共21 d，構建慢性光損傷成纖維細胞模型（×40） 1A：照射前；1B：照射7 d；1C：照射14 d；1D：照射21 d。顯微鏡下觀察，成纖維細胞逐漸出現細胞體積變大，形狀扁平，過度伸展，伸展末端細長有分支，細胞顆粒增加，胞質空泡化

圖2 熒光顯微鏡下（×40），慢性光損傷成纖維細胞轉染GFP-CatD質粒后96 h（2A），胞質內可見綠色熒光蛋白標記的CatD表達。轉染空白GFP質粒后96 h（2B），慢性光損傷成纖維細胞胞質內可見單綠色熒光蛋白表達。未轉染質粒的成纖維細胞（2C）未見熒光表達

8.統計學處理：采用SPSS 15.0統計軟件，各組數據均以±s表示。所有實驗重復3次，重復結果用方差齊性檢驗。各組間比較用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

三、結果

1.慢性光損傷成纖維細胞模型建立：成纖維細胞經25 J/cm2UVA誘導處理7、14、21 d，細胞逐漸出現慢性光損傷的特征性改變，表現為細胞體積變大，形狀扁平，過度伸展，伸展末端細長有分支，細胞顆粒增加，胞質空泡化（圖1）。

2.熒光示蹤GFP-CatD蛋白：慢性光損傷成纖維細胞轉染GFP-CatD質粒后96 h，目的蛋白表達，熒光顯微鏡下可見GFP-CatD在慢性光損傷細胞胞質內表達（圖2）。

3.Western印跡：慢性光損傷細胞轉染GFP-CatD質粒96 h后，CatD表達高于未轉染質粒的慢性光損傷成纖維細胞及轉染空白GFP質粒的慢性光損傷成纖維細胞。陰性對照組的CatD表達低于無UVA誘導成纖維細胞的CatD蛋白表達。灰度值分析結果顯示，慢性光損傷細胞轉染GFP-CatD質粒后CatD蛋白表達為陰性對照組的1.28倍。空白對照組與陰性對照組的CatD蛋白表達無明顯差異。見圖3。

4.流式細胞儀檢測：轉染CatD-GFP質粒后的光老化成纖維細胞活細胞率為93.06%±5.10%，空白對照組為90.69%±5.50%，陰性對照組為97.97%±4.20%，3組間差異無統計學意義（P＞0.05）。細胞凋亡檢測結果發現，轉染質粒后的光老化成纖維細胞凋亡率為4.29%±1.30%，轉染GFP空白質粒的對照組為5.22%±1.90%，無轉染質粒的陰性對照組為3.03%±1.70%，3組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4。

5.細胞增殖檢測：MTT法檢測細胞增殖結果發現，轉染GFP-CatD質粒后的慢性光損傷細胞增殖率為45.20%±4.70%，與空白對照組（46.60%±4.20%）、陰性對照組（43.60%±3.90%）比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

四、討論

在我們前期研究中，檢測到無論是光老化成纖維細胞還是人體老化皮膚，CatD表達都是降低的，且CatD的低表達發生在基因階段［2-3］。隨之，我們在CatD外源性蛋白表達上調層面研究發現，在人體皮膚使用CatD凝膠外源性補充CatD蛋白，可修復慢性光損傷皮膚屏障［6］，為了在基因表達層面進一步闡明CatD在慢性光損傷皮膚中的作用，在本研究中我們使用了一種新的綠色熒光蛋白復合質粒（GFP）示蹤技術。

圖3 Western印跡結果顯示慢性光損傷成纖維細胞組織蛋白酶D（CatD）表達 1：未誘導細胞；2：轉染CatD-GFP質粒的慢性光損傷成纖維細胞；3：轉染空白GFP質粒的慢性光損傷成纖維細胞；4：無轉染質粒的慢性光損傷成纖維細胞

圖4 流式細胞儀檢測各處理組光老化成纖維細胞活細胞率 轉染GFP-CatD質粒組活細胞率為97.97%±4.20%，轉染空白GFP質粒組為90.69%±5.50%，陰性對照組為93.06%±5.10%

綠色熒光蛋白是一種穩定自發熒光的標記分子，已成為研究蛋白質相互作用和構象變化、檢測蛋白質表達、蛋白質和細胞示蹤的重要標記物［7］。GFP-CatD復合質粒，即在同一真核質粒中組裝入GFP mRNA和CatD的mRNA，轉染入細胞后，表達出CatD綠色熒光蛋白復合蛋白，通過追蹤熒光蛋白，即可記錄到CatD的表達及遷移軌跡。本研究將該技術用于研究皮膚慢性光損傷機制，將GFP-CatD轉染細胞后，在慢性光損傷成纖維細胞中示蹤到CatD熒光蛋白。我們的研究一方面在誘導慢性光損傷的活成纖維細胞中示蹤到CatD，另一方面在CatD表達、遷移的同時，實時監測慢性光損傷細胞的生物學活性改變。該技術與以往研究蛋白酶表達及定位的免疫組化、免疫熒光相比，具有熒光及目的蛋白均在慢性光損傷活細胞內表達、可同時實時定位示蹤目的蛋白并檢測活細胞生物學狀態、外源污染小等優點，可用于成纖維細胞慢性光損傷機制的動態生物學研究及動態修復治療機制的研究，特別是用于包括組織蛋白酶家族在內的多種蛋白酶在慢性光損傷細胞內定位、遷移及功能研究。

已有研究表明，將僅表達GFP的空載質粒轉入皮膚成纖維細胞，細胞正常生物活性和周期不受影響［8］，本研究結果與該研究結果一致。我們的研究發現，GFP-CatD復合質粒轉染入慢性光損傷成纖維細胞，細胞凋亡率及細胞增殖率與空白對照相比，差異無統計學意義，說明GFP-CatD復合質粒不影響慢性光損傷成纖維細胞原有的正常生物活性和周期，可用于CatD在皮膚慢性光損傷（光老化）中作用機制的研究。

CatD與皮膚角化、屏障功能及顏色有關［9-10］，其在慢性光損傷皮膚及成纖維細胞中表達下調，可通過皮膚角化異常、屏障功能受損及加劇ROS聚集等機制參與皮膚慢性光損傷發生機制。在本研究中，我們用GFP-CatD復合質粒技術，從基因表達層面外源性上調了CatD在慢性光損傷成纖維細胞中的表達，由于本研究是在監測生物學活性下的活慢性光損傷成纖維細胞內，對CatD進行外源誘導上調表達，并對其動態示蹤，為進一步研究外源性調控減緩甚至逆轉細胞及皮膚的慢性光損傷過程，外源性導入的組織蛋白酶如何通過調控光損傷皮膚活細胞角化過程、修復光損傷皮膚屏障、參與光損傷皮膚膠原蛋白及彈性蛋白的合成及分解動態平衡等途徑修復皮膚慢性光損傷過程及機制研究提供一種新的技術參考。

［1］Yaar M,Gilchrest BA.Photoageing:mechanism,prevention and therapy［J］.Br J Dermatol,2007,157（5）:874-887.

［2］Zheng Y,Lai W,Wan M,et al.Expression of cathepsins in human skin photoaging［J］.Skin Pharmacol Physiol,2011,24:10-21.

［3］賴維,鄭躍,陸春,等.天冬氨酸/半胱氨酸組織蛋白酶在光老化成纖維細胞中的表達變化［J］.中華皮膚科雜志,2010,43（3）:192-195.

［4］Lai W,Zheng Y,Ye ZZ,et al.Changes of cathepsin B in human photoaging skin bothin vivoandin vitro［J］.Chin Med J（Engl）,2010,123（5）:527-531.

［5］鄭躍,賴維,蘇向陽,等.組織蛋白酶B在光老化皮膚的表達變化及意義［J］.中華皮膚科雜志,2010,43（1）:31-34.

［6］Zheng Y,Chen H,Lai W,et al.Cathepsin D repairing role in photodamaged skin barrier［J］.Skin Pharmacol Physiol,2014,28（2）:97-102.

［7］段青,王倩,祁慶生.綠色熒光蛋白在蛋白質研究中的應用［J］.生命的化學,2007,27（1）:48-51.

［8］果磊,劉波,張恒術,等.增強型綠色熒光蛋白基因轉染對原代培養的人成纖維細胞細胞周期的影響［J］.激光雜志,2007,28（3）:93-95.

［9］Yamasaki R,Zhang J,Koshiishi I,et al.Involvement of lysosomal storage-induced p38 MAP kinase activation in the overproduction of nitric oxide by microglia in cathepsin D-deficient mice［J］.Mol Cell Neurosci,2007,35（4）:573-584.

［10］Egberts F,Heinrich M,Jensen JM,et al.Cathepsin D is involved in the regulation of transglutaminase 1 and epidermal differentiation［J］.J Cell Sci,2004,117（Pt 11）:2295-2307.

Performance of transfection with a complex plasmid encoding green fluorescent protein tagged cathepsin D in researches on chronic photodamaged fibroblasts

Zheng Yue,Chen Haiyan,Xu Qingfang,Ye Congxiu,Liu Huixian,Yi Jinling,Lai Wei.Department of Dermatovenereology,Third Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510630,China

ObjectiveTo evaluate the performance of transfection with a complex plasmid encoding green fluorescent protein tagged CatD （GFP-CatD）in researches on chronic photodamaged fibroblasts.MethodsHuman dermal fibroblasts（HSFs）were irradiated with ultraviolet A （UVA）at 25 J/cm2once a day for 21 consecutive days to establish a chronic photodamaged cell model.A plasmid encoding GFP-CatD was constructed and transfected into some chronic photodamaged fibroblasts （experimental group）.The photodamaged HSFs receiving no treatment served as the blank control group,and those transfected with the negative plasmid encoding GFP only as the negative control group.After additional culture,fluorescence microscopy and Western-blot analysis were performed to observe and measure the expression of GFP-CatD in HSFs respectively,flow cytometry and methyl thiazolyl tetrazolium （MTT）assay to evaluate the apoptosis and proliferation of chronic photodamaged fibroblasts respectively.ResultsFluorescence microscopy showed the expression of GFP-CatD in cytoplasm of chronic photodamaged fibroblasts at 96 hours after transfection with the GFP-CatD-encoding plasmid.Western-blot analysis revealed that the expression of CatD in the experimental group was 1.28 times that in the blank control group.There were no significant differences in the apoptosis rate（4.29%±1.30%vs.3.03% ±1.70%,P＞0.05）or proliferative rate（45.20% ±4.70%vs.43.60±3.90%,P＞0.05）between the experimental group and blank control group.ConclusionCatD could be traced in chronic photodamaged fibroblasts with no changes in biological activity or cell cycle after transfection with the GFP-CatD-encoding complex plasmid.

Cathepsin D;Fibroblasts;Plasmids;Cell aging;Skin aging;Ultraviolet rays

Lai Wei,Email:drlaiwei@163.com

作者單位：510630廣州，中山大學附屬第三醫院皮膚性病科

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.12.013

國家自然科學基金（81201241、81171523）；廣東省自然科學基金（S2012040007202）；中華醫學會－歐萊雅中國人健康皮膚/毛發研究項目（S2011080818）

賴維，Email：drlaiwei@163.com

2015-03-20）

（本文編輯：吳曉初）