劉豨湯抗大鼠肝纖維化作用機制的實驗研究

劉新軍　王慧凱　姜學連△

（1.濱州醫學院，山東濱州256603；2.濱州醫學院附屬醫院，山東濱州256603）

·實驗報告·

劉豨湯抗大鼠肝纖維化作用機制的實驗研究

劉新軍1王慧凱2姜學連2△

（1.濱州醫學院，山東濱州256603；2.濱州醫學院附屬醫院，山東濱州256603）

目的觀察中藥復方劉豨湯對肝纖維化血清學和免疫組織化學方面的作用。方法用豬血清腹腔注射法制作肝纖維化模型，通過運用劉豨湯做預防和治療，研究記錄治療前后血清學肝功能、肝纖維化以及免疫組織化學指標，制作標本，最后用圖像分析儀定量分析、統計及處理。結果劉豨湯治療后，大鼠肝纖維化程度明顯減輕，能夠顯著降低血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、堿性磷酸酶（ALP）、肝纖維化指標Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（C-Ⅳ）、層粘連蛋白（LN）、透明質酸酶（HA）也受到抑制，并能抑制Ⅳ型膠原及LN合成、降低TGF-β1的表達。結論劉豨湯能夠預防和治療肝纖維化，證明其具有保護肝細胞、抑制膠原增生并促進降解、抑制TGF-β1的表達的作用。

肝纖維化作用機制實驗研究免疫組織化學劉豨湯

劉豨湯具有活血化瘀、健脾、祛濕、解毒及消癥散結等作用，在臨床上已證實能夠較好地治療肝炎及肝硬化早期患者，有效阻抑肝纖維化的發展進度［1］。目前該方主要用于臨床治療，未進行實驗研究，目前尚不明確劉豨湯治療肝纖維化的機制。故我們做了以下實驗，以探討其作用機制?，F報告如下。

1　材料與方法

1.1動物98只Wistar大鼠，雄性，清潔級，大鼠體質量95～105 g，購于山東醫科大學動物中心。

1.2試劑與藥物中藥復方劉豨湯：劉寄奴20 g，豨薟草30 g，柴胡6 g，郁金10 g，赤芍30 g，丹參20 g，茜草20 g，蒼術10 g，土茯苓15 g，茵陳15 g，莪術10 g，澤瀉10 g。中藥購于廣東一方制藥有限公司，由專業人員煎煮、濃縮成含生藥3 g/mL的藥液；西藥秋水仙堿，訂購于廣東彼迪藥業有限公司，配制0.02 mg/mL濃度的灌胃藥液。

1.3分組與造模將98只大鼠隨機分為7組，每組14只，即正常對照組、模型1組、模型2組、中藥預防組、中藥治療組、西藥預防組、西藥治療組。建模與取材：參照于世瀛等［2］制作模型的方法，采集豬血清，注入大鼠腹腔，建造模型。正常對照組中，每只大鼠給予0.5 mL 0.9%氯化鈉注射液腹腔注射。其余大鼠給藥方式為：取豬血清0.5 mL，注入大鼠腹腔，每隔7 d給藥2次，在第35日，取7只正常對照組大鼠，模型1組、兩預防組所有大鼠，共49只，采用乙醚吸入的麻醉方式，分離大鼠股動脈，取血，分離血清，-80℃保存，留作檢測血清學指標的標本；將以上大鼠處死后解剖，暴露肝臟，在距左葉邊緣3mm處取肝臟組織，放入福爾馬林液中固定肝組織，制作光鏡標本及免疫組織化學標本，每次處死大鼠取材前，測量各組大鼠體質量并仔細記錄。第70日，取7只正常對照組大鼠，模型2組、兩治療組所有大鼠，共49只，取血清及肝臟組織標本，方法參照第1次取材操作。給藥方法，正常對照組及模型組按1.0 mL/100 g體質量給予0.9%氯化鈉注射液灌胃，兩預防組于給以藥液灌胃，每日于下午5點灌胃1次，連續35 d，其中中藥預防組按照3 g生藥/100 g體質量的藥物劑量灌胃給藥，西藥預防組按0.02 mg/ 100 g體質量的藥物劑量灌胃給藥，連續35 d。中藥治療組、西藥治療組于實驗開始后的第36日開始給藥，劑量、方式、時間同前。每7日測量1次大鼠的體質量，然后根據大鼠體質量的變化按時調整灌胃用藥的劑量。

1.4觀察指標1）血清肝功能指標應用生化分析儀檢測，丙氨酸氨基轉移酶（ALT），天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、血清總膽紅素（TBIL）、堿性磷酸酶（ALP）、白蛋白（ALB）、白蛋白/球蛋白（A/G）；2）采取放免法檢測肝纖維化指標、透明質酸酶（HA）、Ⅲ型前膠原蛋白（PCⅢ）、Ⅳ型膠原蛋白（C-Ⅳ）、層粘連蛋白（LN）；3）采用SABC法檢測免疫組織化學指標：Ⅳ型膠原、層粘連蛋白（LN）、轉化生長因子β1（TGF-β1）。4）光鏡標本，取大鼠肝臟左葉距邊緣3 mm處，大小約0.5 cm×0.5 cm× 0.5 cm的小塊肝臟組織2～3塊，取肝組織，10%福爾馬林液固定，24 h后，依次進行脫水、包埋、切片、HE染色及Masson染色等實驗操作，制作標本。采用圖像分析儀檢測、記錄膠原含量。反應產物為棕褐色。

1.5統計學處理數據采用SPSS19.0數據分析軟件，血清肝功能及肝纖維化指標各組間用χ2檢驗及t檢驗進行統計學處理，免疫組織化學結果采用圖像分析儀測量，根據需要結果取均值，各組間采用t檢驗處理統計比較差異性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1大鼠一般情況大鼠生長無異常變化，試驗結束后，大鼠未出現死亡。制作模型及實驗過程中，大鼠體質量的變化各組間無明顯差別，大鼠外觀正常，毛發無異常變化，大鼠可活動自如，食欲好，每周檢測大鼠體質量增長無明顯異常。各組大鼠性情平和，無攻擊性，各組之間無明顯異常。

2.2各組動物肝功能指標比較見表1。制作模型后，大鼠血清指標包括ALT、AST、TBIL、ALP均出現了大幅度的升高，ALB、A/G的水平則明顯下降，說明正常對照組與模型組之間的差異有統計學意義（P＜0.01）；在經過藥物的預防和治療之后，預防及治療組大鼠血清學肝功能指標出現了明顯的恢復，結果證實，中藥、西藥治療組之間的差異有統計學意義（P＜0.01）。

表1　各組大鼠血清肝功能指標比較（）

表1　各組大鼠血清肝功能指標比較（）

與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與西藥治療組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，下同。

組別n正常對照組14模型組28中藥預防組14 ALB（g/L）A/G 36.5±2.81.12±0.04 27.26±1.6**0.68±0.21**36.7±1.2△△1.15±0.05△△中藥治療組14 43.25±6.37△△##174.34±21.43△△##7.±1.49△△##286.5±38.58△△##38.3±1.5△△##1.0±0.06△△##西藥預防組14 78.84±10.49**△△194.38±32.26**△△9.87±1.72**△445.38±44.48**△△29.4±2.2**1.03±0.07△△西藥治療組14 81.54±12.30**213.42±32.16**10.42±1.69**526.34±41.68**28.6±2.1**0.84±0.11**ALT（IU/L）AST（IU/L）TBIL（mol/L）51.22±5.34136.57±46.326.54±1.40 96.31±14.62**241.11±51.16**10.46±3.25**43.37±7.18△△146.25±34.27△△7.81±3.02△△ALP（IU/L）246.87±56.79 597.36±84.30**256.38±21.65△△

表2　各組大鼠血清肝纖維化指標結果（）

表2　各組大鼠血清肝纖維化指標結果（）

組別n正常對照組14模型組28中藥預防組14 HA（μg/mL）PCⅢ（μg/mL）C-Ⅳ（ng/mL）LN（ng/mL）105.47±13.4664.23±11.2576.38±18.27124.47±14.09 256.10±34.40**126.27±14.31**112.16±9.34**229.72±23.35**113.25±16.21△△78.28±10.56△△81.35±12.27△△132.78±32.03△△中藥治療組14136.32±23.41△△##86.32±12.53△△##89.24±15.25△△##143.42±21.53△△##西藥預防組14124.35±11.39△△90.32±8.76△△89.38±1.72△△156.23±32.64△△西藥治療組14163.15±22.17△△98.38±14.35△△95.43±13.02△△176.31±42.37△△

2.3各組大鼠血清肝纖維化指標比較見表2。通過對比PCⅢ、C-Ⅳ、LN和HA含量，模型組血清中各指標含量明顯增多，正常對照組中各指標水平則相對較低，證明兩組之間的差異高度顯著（P＜0.01）；相較于模型組，兩治療組及兩預防組中各肝纖維化指標的水平均較低，肝纖維化指標的下降變化程度中，中藥治療組與西藥物治療之間的差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.4各組大鼠IV型膠原、LN和TGFβ1表達比較見表3。1）Ⅳ型膠原：正常對照組中，Ⅳ型膠原于血管、膽管基膜內分布較多，其分布雖然比較連續，但形態則顯得非常不規則，以沿血竇方向分布的膠原含量居多；模型組中，發現有Ⅳ型膠原陽性細胞，大處多在細胞外基質，Ⅳ型膠原大量分布，以纖維間隔內為主；兩預防組中無大量的Ⅳ型膠原；西藥預防組中，發現少量增生的Ⅳ型膠原，但尚未形成纖維間隔；西藥治療組中的Ⅳ膠原增生比較多見，還發現有纖維間隔，較模型組含量少。標本采用圖像分析儀測量，通過比較兩治療組的結果發現，中、西藥治療組Ⅳ型膠原水平之間的差異有統計學意義（P＜0.01）。2）LN：在正常組中，中央靜脈周圍、匯管區血管和膽管周圍發現有LN，多數分布于基膜，排布均勻，沿肝竇外方向分布；模型組中，發現大量增生的LN，主要位于基膜以及纖維間隔，在血管壁也有大量的LN；中藥預防組和中藥治療組中，LN增生受到抑制程度最為明顯，西藥預防組及治療組比中藥組的增加量也很明顯。標本采用圖像分析儀測量，兩治療組比較后發現，中藥與西藥治療組LN結果之間的差異高度顯著（P＜0.01）。3）TGF-β1：正常對照組有TGF-β1表達，但TGF-β1的含量極少，模型組則發現了大量的TGF-β1陽性細胞，且分布范圍具有集中于匯管區、肝血竇及纖維間隔周圍的特點，經藥物預防治療后，TGF-β1陽性細胞含量明顯減少，應用圖像分析儀測量，比較結果發現模型組和西藥治療組比正常組具有更高含量的TGF-β1，較中藥治療組中的TGF-β1含量則顯著增高，通過比較各組之間的結果發現，兩治療組之間的差異有統計學意義（P＜0.01）。

表3　各組大鼠免疫組織化學指標檢查結果（）

表3　各組大鼠免疫組織化學指標檢查結果（）

組別n正常對照組14模型組28中藥預防組14Ⅳ型膠原LNTGF-β131.25±5.4634.27±4.4912.38±2.23 263.10±34.43**316.49±38.37**142.76±21.69**35.58±6.21△△38.36±4.19△△13.74±5.49△△中藥治療組1436.42±6.48△△##73.28±23.25△△##17.21±6.48△△##西藥預防組1464.49±10.17**△△190.36±35.39**△△35.431±0.27**△△西藥治療組14150.25±28.28**△△98.38±14.35**△△95.43±19.52**△△

3　討論

肝纖維化是肝小葉的組織結構發生異常變化的過程［3］。在肝小葉受損初期，各種不同的損傷因素（包括化學及物理因素）發生后，肝星狀細胞功能受到異常的影響，導致細胞外基質（ECM）持續不斷的沉積在肝組織細胞周圍，隨著ECM大量異常的產生與沉積，肝小葉的功能與結構逐步發生了異常的變化，導致形成了肝纖維化［4］。本文通信作者姜學連教授從事在臨床工作數十年，在辨證治療肝纖維化方面，積累了豐富的臨床經驗，在應用劉豨湯治療肝纖維化的過程中取得了明顯效果。劉豨湯方中以劉寄奴、豨薟草為君藥，其配伍之中兼具寒熱同用、氣血雙治，既能發揮活血解毒、平肝、化瘀之功，又能起到散結、消癥、退黃利膽的功效。方中應用柴胡、郁金疏肝解郁，配以赤芍、丹參、莪術活血、養血，茜草化瘀止血，佐以茵陳清肝利膽、退黃，加澤瀉以疏利三焦，土茯苓、蒼術共同發揮健脾祛濕的功效，方中各種藥物相互配伍，發揮活血化瘀、健脾、祛濕、解毒及消癥散結的功效?，F代醫學研究證明，劉寄奴［5］濃縮煎液可使大鼠血清谷丙轉氨酶明顯下降，有較好的利膽作用，豨簽草［6］經水提取后，其成分具有抑制乙型肝炎病毒表面抗原增長的作用，柴胡［7-8］中含有大量的柴胡皂苷，研究表明其能夠抑制肝星狀細胞，同時還能促進細胞外基質的合成。另據研究發現，郁金［9］揮發油能增強機體免疫功能，尤其對于中毒性肝炎小鼠效果更明顯。研究發現赤芍［10-12］具有抗炎細胞浸潤、抗肝纖維化以及降低轉氨酶和膽紅素水平的作用?，F代藥理學發現茵陳［13-15］具有保護細胞膜、改善微循環、降酶等重要的作用。丹參［16］能夠有效地降低轉氨酶水平修復受損的肝組織，茜草［17-18］能夠有效的抗炎、抗血小板聚集，蒼術［19］則有保護肝細胞、抗炎的作用。土茯苓［20］則有預防肝癌的價值，澤瀉［21］則具有較好的降脂作用，莪術［22］則具有抗凝和抑制血栓形成的作用。

本實驗結果表明，劉豨湯能夠明顯降低血清ALT、AST、TBIL、ALP水平，并能顯著升高ALB、A/G水平，同時能夠有效抑制血清PCⅢ、C-Ⅳ、LN和HA的生成，并能明顯抑制Ⅳ型膠原、LN、TGF-β1的表達。結果證實，劉豨湯具有抗肝纖維化的作用，其機制主要是阻抑肝細胞變性、壞死，減輕肝細胞遭到破壞的程度，加快促進合成糖原以保護細胞膜系統，并能阻抑TGF-β1的表達，從基因水平阻抑膠原及非膠原糖蛋白的合成過程，其抗肝纖維化效果明顯優于秋水仙堿，為這一經驗方的臨床應用提供了科學的理論依據。

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R285.5

A

1004-745X（2015）12-2141-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.12.024

2015-08-07）

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