響應面法優(yōu)化腺苷脫氨酶法快速檢測發(fā)酵液中的腺苷含量

祖　　昕，董會娜，李　　寧，3，張大偉，*，孫玉梅

（1.大連工業(yè)大學生物工程學院，遼寧大連116034；2.中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所，天津300308；3.蘭州大學基礎醫(yī)學院，甘肅蘭州730000）

響應面法優(yōu)化腺苷脫氨酶法快速檢測發(fā)酵液中的腺苷含量

祖昕1，2，董會娜2，李寧2，3，張大偉2，*，孫玉梅1，*

（1.大連工業(yè)大學生物工程學院，遼寧大連116034；2.中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所，天津300308；3.蘭州大學基礎醫(yī)學院，甘肅蘭州730000）

通過腺苷脫氨酶（ADA）與靛酚藍方法結合建立一種高通量快速檢測腺苷的新方法。通過單因素、響應面方法優(yōu)化氫氧化鈉、水楊酸、亞硝基鐵氰化鈉和次氯酸鈉的用量，并進行了驗證，以最優(yōu)試劑用量建立腺苷的標準曲線。確定了檢測腺苷的最優(yōu)試劑用量氫氧化鈉25.85g/L、水楊酸68.05g/L、亞硝基鐵氰化鈉2.19g/L和次氯酸鈉40.9mL/L，該方法線性范圍為0.01～10mmol/L，加標回收率在95.5%～103.8%之間，RSD精準度在0.9%～3.3%之間。本方法與HPLC法檢測發(fā)酵液中的腺苷含量結果一致。本方法可以用來快速、高通量的檢測發(fā)酵液中的腺苷含量。

腺苷，腺苷脫氨酶，高通量篩選，響應面

腺苷又稱腺嘌呤核苷，是酶反應和細胞修復所需輔助因子的重要組成部分，在神經(jīng)傳遞中起著重要的作用［1-2］。由于腺苷具有減慢心律、增強心肌對缺血的耐受力等保護心臟的功能，現(xiàn)已被廣泛的應用在醫(yī)療和保健食品領域［3-5］。同時，腺苷還是合成多種藥用核苷類物質的醫(yī)藥中間體，目前已成功的合成腺苷酸、三磷酸腺苷等藥用物質以及嘌呤霉素、s-腺苷蛋氨酸等核苷類抗菌素［6］。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)核苷類物質始于1968年，小西八真［7］第一次成功的以枯草芽孢桿菌異亮氨酸缺陷型發(fā)酵法生產(chǎn)鳥苷。發(fā)酵法主要是以枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株，經(jīng)誘變篩選出黃嘌呤缺陷、抗嘌呤結構類似物等表型，從而得到腺苷的高產(chǎn)菌株［8-9］。

在微生物代謝過程中，腺苷作為產(chǎn)物會被釋放到培養(yǎng)基中，為了驗證微生物生產(chǎn)腺苷的能力，需要測定培養(yǎng)基中腺苷的含量。目前腺苷測定的常用方法主要包括紙層析法和高效液相色譜法（HPLC）。紙層析法檢測腺苷精度不高，而且所用的有機溶劑如丙酮等，具有一定的揮發(fā)性和毒性。HPLC法雖然檢測結果精準可靠，可用于檢測微量腺苷，但是儀器成本過高，檢測時間較長，不適用于快速、高通量的檢測。另外，還有基于腺苷與其適體特異性識別和腺苷適體偶聯(lián)金納米粒子自組裝導致共振光散射信號放大建立的腺苷檢測新方法，但仍處于實驗室研究階段。本研究將腺苷脫氨酶（ADA）和靛酚藍方法結合建立一種新的、快速檢測腺苷的方法。ADA水解腺苷生成銨，在亞硝基鐵氰化鈉的作用下銨可以與水楊酸、次氯酸離子在堿性條件下反應生成水溶性藍色化合物，通過該化合物顏色的變化可以對腺苷濃度進行檢測［10-11］。本方法操作簡便、快速，可節(jié)省大量的人力物力，同時可用于快速檢測發(fā)酵液中的腺苷產(chǎn)量及進行腺苷高產(chǎn)菌株的高通量篩選。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ZX05中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所保藏；LB固體培養(yǎng)基自制；M9培養(yǎng)基（不含硫酸銨，含2g/L尿素） 自制；0.01mol/L PBS緩沖液自制；試劑A25.85g/L氫氧化鈉，68.05g/L水楊酸，2.19g/L亞硝基鐵氰化鈉；試劑B40.9mL/L次氯酸鈉；腺苷（Adenosine）標準品Sigma公司；腺苷脫氨酶（ADA） 上海金穗生物科技有限公司；氫氧化鈉、水楊酸、亞硝基鐵氰化鈉、次氯酸鈉（含5%活性氯）、氯化銨均為分析純；乙腈HPLC級。

Spectramax M5連續(xù)多波長多功能讀板機Molecular Devices公司；1260 series高效液相色譜儀Agilent公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌種活化取-80℃保藏的菌種劃線接種于LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱恒溫靜置培養(yǎng)14～16h。

1.2.2種子培養(yǎng)挑取LB固體培養(yǎng)基上的一個單菌落接于裝有50mL LB培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，37℃，200r/min，培養(yǎng)12h。

1.2.3搖瓶發(fā)酵取0.5mL的種子液接于裝有50mL M9培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，37℃，200r/min，培養(yǎng)48h。

1.2.4腺苷檢測試劑的單因素優(yōu)化

1.2.4.1氫氧化鈉對顯色反應的影響取25μL 10mmol/L的氯化銨溶液，加入50μL終濃度為17.5、20、22.5、25、30g/L氫氧化鈉溶液、50μL 62g/L水楊酸溶液、50μL 2g/L亞硝基鐵氰化鈉溶液和50μL 60mL/L次氯酸鈉溶液，37℃恒溫箱溫浴30min。以超純水為參比，測定OD696的變化情況，每個濃度重復3次。

1.2.4.2水楊酸對顯色反應的影響取25μL 10mmol/L的氯化銨溶液，加入50μL 25g/L氫氧化鈉溶液、50μL終濃度為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85g/L水楊酸溶液、50μL 2g/L亞硝基鐵氰化鈉溶液和50μL 60mL/L次氯酸鈉溶液，37℃恒溫箱溫浴30min。以超純水為參比，測定OD696的變化情況，每個濃度重復3次。

1.2.4.3亞硝基鐵氰化鈉對顯色反應的影響取25μL 10mmol/L的氯化銨溶液，加入50μL 25g/L氫氧化鈉溶液、50μL 65g/L水楊酸溶液、50μL終濃度為0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、3.5、4g/L亞硝基鐵氰化鈉溶液和50μL 60mL/L次氯酸鈉溶液，37℃恒溫箱溫浴30min。以超純水為參比，測定OD696的變化情況，每個濃度重復3次。

1.2.4.4次氯酸鈉對顯色反應的影響取25μL 10mmol/L的氯化銨溶液，加入50μL 25g/L氫氧化鈉溶液、50μL 65g/L水楊酸溶液、50μL 1.5g/L亞硝基鐵氰化鈉溶液和50μL終濃度為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mL/L次氯酸鈉溶液，37℃恒溫箱溫浴30min。以超純水為參比，測定OD696的變化情況，每個濃度重復3次。

1.2.5響應面分析法優(yōu)化腺苷檢測試劑在單因素實驗的基礎上，著重考查氫氧化鈉濃度（A）、水楊酸濃度（B）、亞硝基鐵氰化鈉濃度（C）和次氯酸鈉濃度（D）對腺苷檢測的影響。運用Design Expert 8.0軟件程序，根據(jù)CCD［12］中心組合實驗設計原理，采用四因素五水平響應面（RSM）［13-14］分析方法，以吸光度值為響應值Y做響應面，對各試劑濃度進行優(yōu)化，因素水平如表1所示。實驗結果用Design Expert 8.0軟件進行處理。

表1　CCD因素水平及編碼Table 1　Variables and levels used for CCD

1.2.6腺苷標準曲線的繪制準確稱取腺苷標準品適量，加M9培養(yǎng)基溶解制成10mmol/L的溶液。分別吸取不同體積的標準品溶液進行稀釋，使腺苷終濃度為0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mmol/L。取25μL腺苷溶液，加入100μL 0.01mol/L的PBS緩沖液，再加入1μL ADA，37℃恒溫箱溫浴40min后，加入50μL試劑A、50μL試劑B，再放入37℃恒溫箱溫浴30min。以不加ADA的反應體系作為空白參比，在696nm處測其吸光度值。以吸光度值（y）對腺苷濃度（x）作圖繪制標準曲線。

1.2.7發(fā)酵液中的腺苷含量檢測將產(chǎn)腺苷枯草芽孢桿菌ZX05發(fā)酵24h的發(fā)酵液12000r/min離心3min，取25μL上清液，按照1.2.6的方法，以相應的發(fā)酵液作為空白參比，測定OD696的值。同時取上清液1mL過濾進行HPLC分析，根據(jù)保留時間定性，峰面積定量。HPLC條件：色譜柱為Agilent C18柱（250mm×416mm，5μm），流動相為水（pH=3.0）∶乙腈=94∶6，流速0.8mL/min，檢測波長280nm，柱溫35℃，進樣量10μL。

1.2.8加標回收實驗取1.2.7中離心過的上清液與適量的腺苷標準溶液混合，使腺苷溶液終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1、2mmol/L。以相應的發(fā)酵液作為空白參比，按1.2.6的方法檢測加標樣本。

2　結果與分析

2.1最大吸收波長的測定

取25μL 10mmol/L的氯化銨溶液，加入50μL 25g/L氫氧化鈉溶液、50μL 62g/L水楊酸溶液、50μL 2g/L亞硝基鐵氰化鈉溶液和50μL 60mL/L次氯酸鈉溶液，37℃恒溫箱溫浴30min。在波長450～750nm之間進行掃描，隨后又進一步縮小掃描范圍，吸光度值曲線見圖1和圖2。由圖2可知，在696nm處有一強吸收峰，選定此波長作為測定波長。

圖1　 波長掃描圖Fig.1　Scanning of wavelength

圖2　 波長掃描圖Fig.2　Scanning of wavelength

2.2單因素優(yōu)化實驗結果

2.2.1氫氧化鈉對顯色反應的影響由圖3可知，在氫氧化鈉濃度為25g/L時，吸光度值最大。因此，實驗選取氫氧化鈉溶液濃度為25g/L。

2.2.2水楊酸對顯色反應的影響由圖4可知，在水楊酸溶液濃度為65g/L時，吸光度值最大。因此，實驗選取水楊酸溶液濃度為65g/L。

2.2.3亞硝基鐵氰化鈉對顯色反應的影響由圖5可知，在亞硝基鐵氰化鈉溶液濃度為1.5g/L時，吸光度值最大。因此，實驗選取亞硝基鐵氰化鈉溶液濃度為1.5g/L。

圖3　氫氧化鈉對顯色反應的影響Fig.3　The effects of sodium hydroxide on the absorbance

圖4　水楊酸對顯色反應的影響Fig.4　The effects of salicylic acid on the absorbance

圖5　亞硝基鐵氰化鈉對顯色反應的影響Fig.5　The effects of sodium nitroferricyanide on the absorbance

圖6　次氯酸鈉對顯色反應的影響Fig.6　The effects of sodium hypochlorite on the absorbance

2.2.4次氯酸鈉對顯色反應的影響由圖6可知，在次氯酸鈉溶液濃度為60mL/L時，吸光度值最大。因此，實驗選取次氯酸鈉溶液濃度為60mL/L。

2.3響應面法優(yōu)化實驗結果

2.3.1響應面實驗設計及結果根據(jù)CCD實驗設計原理，在單因素實驗的基礎上，選取氫氧化鈉、水楊酸、亞硝基鐵氰化鈉和次氯酸鈉濃度4個因素，進行四因素五水平的響應面實驗設計，共30個實驗點，實驗結果見表2。

表2　中心組合實驗設計及實驗結果Table 2　Experimental design and results based on CCD

2.3.2數(shù)學模型的建立及統(tǒng)計學分析對表2進行方差分析及多元回歸分析。方差分析（ANOVA）及回歸系數(shù)的顯著性分析采用F檢驗，p值用來評估各個變量對吸光度值的影響，以p值（Prob＞F）＜0.05判定某模擬項為顯著項［15］。方差分析結果見表3，得到的回歸模型為：

Y=8.04-0.10A+0.37B+0.16C-0.21D+0.05AB+ 0.01AC-0.04AD+0.13BC+0.07BD-0.13CD-0.12A2-0.13B2-0.23C2-0.08D2

由表3可知，回歸模型的顯著性水平p=0.0005＜0.05，說明此模型顯著。失擬項p=0.2895＞0.05，影響不顯著，且回歸方程的R2=0.8545，說明該模型的擬合效果較好，可以用該回歸方程代替真實實驗點對實驗結果進行分析。

表3　二次方模型ANOVA分析Table 3　ANOVA for quadratic model

表4　響應面模型中變量的回歸系數(shù)和重要水平Table 4　Regression coefficients and their significance for response surface model

回歸模型顯著性檢驗結果見表4。檢驗結果表明，水楊酸、亞硝基鐵氰化鈉溶液濃度的一次項和二次項、次氯酸鈉溶液濃度的一次項、氫氧化鈉溶液濃度的二次項為顯著項，交互項影響不顯著。

圖7　氫氧化鈉和水楊酸對吸光度值產(chǎn)生的交互影響Fig.7　Effect of the interaction between sodium hydroxide and salicylic acid on OD696

等高線的形狀可以反映因素間交互作用的強弱大小，圓形表示交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著。圖7表示氫氧化鈉和水楊酸之間的相互影響。等高線呈圓形說明氫氧化鈉和水楊酸之間的交互作用不顯著。此結果與顯著性分析表所反映出的結果一致。根據(jù)回歸方程得到最優(yōu)試劑用量：氫氧化鈉25.85g/L，水楊酸68.05g/L，亞硝基鐵氰化鈉2.19g/L，次氯酸鈉40.9mL/L。對應于此最優(yōu)值，預測的最優(yōu)吸光度值為8.6336。

2.3.3模型的驗證為了考察模型的實用性和準確性，對該模型進行驗證實驗。按照此最終試劑參數(shù)進行六次重復實驗，可得吸光度值為8.7210±0.094，實驗值與預測值（8.6336）的偏差＜5%。表明此模型是可行的，并具有一定的實踐參考價值。

2.4標準曲線的繪制

按照1.2.6的方法制標的準曲線見圖8。回歸方程為y=0.8207x+0.4028，R2=0.9940，線性范圍為0.01～10mmol/L，呈良好的線性關系。

圖8　M9培養(yǎng)基中腺苷標準曲線Fig.8　Adenosine standard curves using ADA assay in M9 medium

2.5 ADA法和HPLC法檢測發(fā)酵液中腺苷含量結果比較

按照1.2.7的方法測定發(fā)酵液中的腺苷含量，ADA法做3個平行，實驗結果見圖9。

圖9　ADA法和HPLC法檢測發(fā)酵液中的腺苷含量Fig.9　Concentration of adenosine detected by ADA assay and HPLC

由圖9可知，ADA法檢測發(fā)酵液所含腺苷的含量為（1.091±0.005）mmol/L，HPLC檢測的結果為（1.087± 0.001）mmol/L，兩種檢測方法檢測到的腺苷含量一致，說明可以利用本方法來檢測腺苷含量。

2.6加標回收實驗結果

按照1.2.8的方法，以2.4中的標準曲線計算加標回收實驗中腺苷的測定值，結果見表5。

表5　標準加標回收實驗結果Table 5　The results of standard addition recovery experiments

由表5知，該方法回收率在95.5%～103.8%之間，RSD精準度在0.9%～3.3%之間。檢測結果顯示本方法的準確性和重現(xiàn)性良好，可以用來檢測發(fā)酵液中的腺苷含量。

3　結論與討論

本研究建立了一種快速、高通量檢測發(fā)酵液中腺苷含量的方法。該方法只需要用到腺苷脫氨酶和氫氧化鈉、水楊酸等幾種簡單的化學試劑，且檢測能夠在1.5h內(nèi)完成。通過單因素、響應面方法優(yōu)化得到最優(yōu)試劑用量為氫氧化鈉25.85g/L、水楊酸68.05g/L、亞硝基鐵氰化鈉2.19g/L和次氯酸鈉40.9mL/L，以最優(yōu)試劑用量建立腺苷的標準曲線，其線性范圍為0.01～10mmol/L。該方法回收率在95.5%～103.8%之間，RSD精準度在0.9%～3.3%之間。

本方法與HPLC法檢測結果一致，且加標回收實驗亦驗證了本方法的準確性。值得注意的是，腺苷脫氨酶要充分水解腺苷產(chǎn)生銨，且該檢測方法的反應條件是在堿性條件下進行，試劑A、試劑B加入的時間要盡可能的短，否則會導致實驗結果檢測不準確。本研究方法與傳統(tǒng)的HPLC檢測方法相比，大大節(jié)省了檢測時間、樣品處理時間，尤其是高通量篩選檢測的時間。同時，本方法省去了昂貴的設備使用費、維修費，且操作簡單，無需對操作人員再進行額外的培訓。

研究發(fā)現(xiàn)本方法能夠對發(fā)酵液樣本進行快速且高通量檢測，為高通量篩選腺苷高產(chǎn)菌株奠定了基礎。本方法用到的檢測銨的方法只是常用的檢測方法之一［16］。銨的其他檢測方法［17-21］，亦可以與腺苷脫氨酶結合來對腺苷進行檢查。同時，此方法也為其他能夠通過脫氨反應產(chǎn)生氨的檢測提供了一種可選方法。

［1］Linden J.Adenosine in tissue protection and tissue regeneration［J］.Mol Pharmacol，2005，67（5）：1385-1387.

［2］Lu Q，Newton J，Harrington E O，et al.Adenosine enhances endothelial barrier function via alteration of small gtpases［J］.Am J Respir Crit Care Med，2011，183（1）：A1949.［3］Marzilli M，Orsini E，Marraccini P，et al.Beneficial effects of intracoronary adenosine as an adjunct to primary angioplasty in acute myocardial infarction［J］.Circulation，2000，101（18）：2154-2159.

［4］Lawson C S，Coltart D J，Hearse D J.Dose-dependency and temporal characteristics of protection by ischaemic preconditioning against ischaemia-induced arrhythmias in rat hearts［J］.J Mol Cell Cardiol，1993，25（12）：1391-1402.

［5］Pelleg A，Porter R S.The pharmacology of adenosine［J］. Pharmacotherapy，1990，10（3）：157-174.

［6］蘇哈道尼克R J.核苷類抗菌素［M］.北京：科學出版社，1982：1-153.

［7］Konishi S，Kubota K，Aoki R，et al.Studies on the production of purine nucleotides［J］.Amino Acid and Nucleic Acid，1968，18（15）：22-24.

［8］Haneda K，Hirano A，Kodaira R，et al.Accumulation of nucleic acid-related substances by microorganisms：part II. Production of adenosine by mutants derived from Bacillus sp［J］. Agr Biol Chem，1971，35（12）：1906-1912.

［9］Nishiyama T，Nakamatsu T，Shirota T.Adenosine production by a mutant of Bacillus subtilis resistant to adenine analogs［J］. Nippon Nogeikagaku Kaishi，1994，68（4）：809-814.

［10］胡小玲，吳鵬.水楊酸次氯酸鹽測定水中氨氮方法的改進［J］.干旱環(huán)境監(jiān)測，2005，19（3）：184-185.

［11］蔣岳文，陳淑梅，馬英.靛酚藍分光光度法測定海水中氨氮最佳條件的選擇［J］.海洋環(huán)境科學，1997，16（4）：43-47.

［12］顧英，韓鳳麗，王洪洋.響應面法優(yōu)化紅薯葉類黃酮提取工藝的研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（3）：286-333.

［13］Yatsyshyn V Y，F(xiàn)edorovych D V，Sibirny A A.Medium optimization for production of flavin mononucleotide by the recombinant strain of the yeast Candida famata using statistical designs［J］.Biochem Eng J，2010，49（1）：52-60.

［14］Vaheed H，Shojaosadati S，Galip H.Evaluation and optimization of ethanol production from carob pod extract by Zymomonas mobilis using response surface methodology［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2011，38（1）：101-111.

［15］Dong H N，Zhao X M，Ma Y Y，et al.Optimization of a synthetic medium for ethanol production by xylose-fermenting Zymomonas mobilis using response surface methodology［J］. Chinese Sci Bull，2012，57（28-29）：3782-3789.

［16］Okumura M，F(xiàn)ujinaga K，Seike Y，et al.A simple and rapid visual method for the determination of ammonia nitrogen in environmental waters using thymol［J］.Anal Bioanal Chem，1999，365（5）：467-469.

［17］SG，D.An ion exchange method for plasma ammonia concentration［J］.J Lab Clin Med，1961，58：149-155.

［18］Thomas D H，Rey M，Jackson P E.Determination of inorganic cations and ammonium in environmental waters by ion chromatography with a high-capacity cation-exchange column［J］.J Chromatogr A，2002，956（1-2）：181-186.

［19］Diaz J，Tornel P L，Martinez P.Reference intervals for blood ammonia in healthy subjects，determined by microdiffusion［J］. Clin Chem，1995，41（7）：1048.

［20］Da Fonseca-Wollheim F，Heinze K G.Which is the appropriate coenzyme for the measurement of ammonia with glutamate dehydrogenase？［J］.Eur J Clin Chem Clin Biochem，1992，30（9）：537-540.

［21］Yamaguchi F，Etoh T，Takahashi M，et al.A new enzymatic cycling method for ammonia assay using NAD synthetase［J］.Clin Chim Acta，2005，352（1-2）：165-173.

Optimization of a rapid enzymatic assay for adenosine in fermentation broth based on adenosine deaminase by response surface methodology

ZU Xin1，2，DONG Hui-na2，LI Ning2，3，ZHANG Da-wei2，*，SUN Yu-mei1，*
（1.School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China；2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China；3.School of Basic Medical Sciences，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China）

This study attempted to establish a new rapid assay for adenosine combined adenosine deaminase（ADA）with indophenol method.Based on the single factor tests，the optimal reaction conditions were explored by response surface methodology with four variables of sodium hydroxide，salicylic acid，sodium nitroferricyanide and sodium hypochlorite.And a verification experiment using the optimum composition（sodium hydroxide 25.85g/L，salicylic acid 68.05g/L，sodium nitroferricyanide 2.19g/L，sodium hypochlorite 40.9mL/L）was performed. A adenosine standard curve was established under the optimum reaction conditions in range of 0.01～10mmol/L. The recovery of adenosine by ADA assay were between 95.5%～103.8%and RSD were between 0.9%～3.3%. This assay showed high consistency with HPLC method when determine the concentration of adanosine in fermentaton broth.Then the reliability of the ADA assay was further supported by spike and recovery test.The results showed that the method could rapidly and high-throughput determine the adenosine concentration in fermentation broth.

adenosine；adenosine deaminase；high-throughput screening；response surface methodology

TS207.3

A

1002-0306（2015）14-0081-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.007

2014－10－20

祖昕（1990-），女，在讀碩士研究生，研究方向：微生物代謝。

張大偉（1978-）男，博士，研究員，研究方向：微生物代謝控制，蛋白組學分析。孫玉梅（1962-），女，博士，教授，研究方向：微生物發(fā)酵工程，生物降解。

國家自然基金（31200036，31370089）。