不同提取方法對金華火腿粗肽液抗氧化活性的影響

胡亞亞，邢路娟，周光宏，張萬剛

（南京農業大學肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，江蘇南京210095）

不同提取方法對金華火腿粗肽液抗氧化活性的影響

胡亞亞，邢路娟，周光宏，張萬剛*

（南京農業大學肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，江蘇南京210095）

研究兩種提取方法（磷酸鹽和鹽酸）所得金華火腿粗肽液的抗氧化活性，以自由基的清除能力，金屬離子螯合能力，還原力以及總抗氧化能力為測定指標，以還原型谷胱甘肽（GSH）作對照。結果表明：磷酸鹽法提取的金華火腿粗肽液（P）多肽含量顯著（p＜0.05）高于鹽酸法提取的金華火腿粗肽液（H）；質量濃度低于5mg/mL時，P和H清除DPPH自由基與超氧陰離子自由基能力無顯著差異；P螯合金屬離子的能力顯著（p＜0.05）高于H和GSH；當質量濃度為4mg/mL時，P還原力顯著（p＜0.05）高于H；當質量濃度為1mg/mL時，P總抗氧化能力達到GSH的48%，顯著高于H（p＜0.05）。因此磷酸鹽所提取的金華火腿粗肽液抗氧化能力優于鹽酸所提取的金華火腿粗肽液。

金華火腿，抗氧化肽，DPPH自由基清除率

自由基是一類具有高度氧化活性的帶有單個或多個不配對電子的分子或原子，化學性質活躍［1］，過量會導致細胞組織受到氧化脅迫，引起細胞和機體的損傷［2］。目前一些人工合成的抗氧化劑如BHT（butylated hydroxytoluene，二丁基羥基甲苯）、BHA（butylated hydroxyanisole，丁基羥基茴香醚）、TBHQ（tert-butylhydroquinone，特丁基對苯二酚）等雖能有效抑制脂質氧化，但研究證實其有一定的毒性［3］。因此，越來越多的國家開始尋求高效、無毒、安全的天然抗氧化劑替代合成抗氧化劑［4］。

金華火腿是我國著名的傳統肉制品，其在制作過程中，經歷很長時間發酵，在此期間蛋白質發生強烈降解，生成許多肽類［5］。Escudero［6］用鹽酸溶液從西班牙干腌火腿中提取分離出具有抗高血壓和抗氧化活性的短肽。王娟［7］利用磷酸鹽提取金華火腿中的小肽并研究其結構。對于金華火腿抗氧化肽的提取，Zhu［8］參照西班牙干腌火腿選用鹽酸作為提取液，但是西班牙干腌火腿和金華火腿之間加工方法和品質等方面存在很大差異［9］，并且在強酸條件下，抗氧化肽的活性也會受到影響［8］，因此提取液對不同火腿抗氧化肽的提取可能會有很大影響。而對于不同提取方法對金華火腿粗肽液抗氧化活性的影響還未見報道。本實驗以兩種方法提取的金華火腿粗肽液為研究對象，通過對兩種金華火腿粗肽液自由基清除能力，螯合金屬離子能力，還原力以及總抗氧化能力等指標的測定，確定金華火腿抗氧化活性肽的提取工藝，探討金華火腿粗肽液的抗氧化能力，為下一步研究金華火腿多肽的抗氧化機制奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

金華火腿購自浙江省金字火腿食品有限公司；1，1-二苯基-2三硝基苯肼（DPPH）、還原型谷胱甘肽（GSH）、吩嗪甲酯硫酸鹽（PMS）、還原型輔酶（NADH）、菲咯嗪（Ferrozine） 均購自Sigma公司，分析純；總抗氧化能力試劑盒購于南京建成試劑公司；鄰苯二甲醛、β-巰基乙醇、氫氧化鈉、乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀國藥集團化學試劑公司，均為分析純。

T25勻漿機德國IKA公司；GM200刀式研磨儀德國Retsch；RE-52AA旋轉蒸發儀上海亞榮生化儀器廠；ES2030冷凍干燥機日本Hitachi公司；Spectral Max M2e多功能酶標儀美國伯騰儀器有限公司；Avanti J-E高速冷凍離心機美國Beckman Coulter公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品處理火腿按照傳統加工工藝加工，包括腌制、浸泡、洗刷、整形、曬腿、成熟和后熟等過程。隨機選取后熟結束的火腿六塊，取股二頭肌編號，在分析測試前于－20℃冰柜保存。

1.2.2粗肽的提取磷酸鹽法參照王娟等［7］的方法進行。具體操作為：取后熟結束的成品股二頭肌25g，絞碎后加入100mL磷酸緩沖液（pH7.0），冰浴勻漿4次（22000r/min，每次10s）。勻漿液于4℃條件下靜置2h后離心（4℃，12000×g，20min）。離心完畢后，取上清液加入三倍體積40%乙醇（V∶V），放置12h后再次離心（4℃，12000×g，20min），所得上清液用1mol/L氫氧化鈉調節至pH7.0。上清液經冷凍干燥后置于－20℃保存備用。此方法所得粗肽稱為金華火腿粗肽P。

鹽酸法參照Zhu等［10］的方法并有所修改。具體操作為：取后熟結束的成品股二頭肌25g，絞碎后加入100mL 0.01mol/L HCl，冰浴勻漿4次（22000r/min，每次10s）。勻漿液在4℃，12000×g條件下離心20min。所得上清液用雙層濾紙過濾后加入三倍體積乙醇，4℃條件下靜止2h后，在4℃，12000×g條件下離心20min。取上清液于40℃條件下旋轉蒸發，所得濃縮液于冷凍干燥機中干燥后置于－20℃保存備用。此方法所得粗肽液稱為金華火腿粗肽液H。

1.2.3肽含量的測定參照Church等［11］的方法并稍作修改。鄰苯二甲醛混合液的配制：取40mg鄰苯二甲醛（溶于1mL甲醇），25mL 100mmol/L硼砂，2.5mL 20%（w/w）SDS和100μL β-巰基乙醇，用去離子水調至總體積為50mL。取100μL樣品（包含5～100μg多肽）和2mL鄰苯二甲醛混合液混勻，室溫下孵育兩分鐘后340nm下測定吸光值。

1.2.4DPPH自由基清除率的測定參照You等［12］的方法并稍作修改。分別配制質量濃度為1、2、3、4、5mg/mL的P和H粗肽液，以相應質量濃度的GSH為對照。具體方法如下，將DPPH溶于95%乙醇中，配制成0.2mmol/L的溶液。樣品組為0.5mL DPPH溶液與0.5mL肽液混合，振蕩混勻，室溫放置30min后，在517nm波長處測定樣品吸光度值，記為A1；對照組為0.5mL DPPH溶液與0.5mL 95%乙醇混合，在517nm波長處測定樣品吸光度值，記為A2；空白組為0.5mL肽液與0.5mL 95%乙醇混合，在517nm波長處測定樣品吸光度值，記為A0。DPPH自由基的清除率按式（1）進行計算。

1.2.5還原力的測定還原力的測定采用鐵氰化鉀還原體系，參照Escudero等［13］的方法并稍作修改。配制質量濃度為1、2、3、4、5mg/mL的P和H粗肽液，以相應質量濃度的GSH為對照。具體方法如下，取0.5mL肽液、0.5mL 0.2mol/L磷酸緩沖液（pH6.6）和0.5mL 1%（w/v）鐵氰化鉀溶液混合，于50℃恒溫水浴鍋中保溫20min后快速冷卻。加入0.5mL 10%（w/v）醋酸，充分混勻，3000r/min離心10min。取0.5mL上清液，加0.5mL蒸餾水和0.1mL 0.1%（w/v）氯化鐵，充分混勻靜置10min后，在波長700nm處測定其吸光度。

1.2.6超氧陰離子自由基清除率的測定清除超氧陰離子自由基采用硝基四氮唑藍還原法，參照Liu等［14］的方法并稍作修改。具體方法如下，用50mmol/L的Tris-HCl（pH8.0）緩沖液將粗肽配制成質量濃度為1、2、3、4、5mg/mL的P和H粗肽液，以相應質量濃度的GSH為對照。取1.5mL肽液，依次加入0.5mL 300μmol/L NBT（以pH8.0的Tris-HCl緩沖液配制），0.5mL 468μmol/L NADH（以pH8.0的Tris-HCl緩沖液配制）和0.5mL 60μmol/L PMS（以pH8.0的Tris-HCl緩沖液配制），立即混勻，并于25℃水浴5min后，560nm波長處測定吸光值。以緩沖液代替樣品作為空白對照。超氧陰離子自由基的清除率按式（2）進行計算。

式中，A1—添加抗氧化肽吸光度值；A0—空白吸光度值。

1.2.7螯合金屬離子能力的測定參考Xie等［15］的方法并稍作修改。具體方法為，配制質量濃度為1、2、3、4、5mg/mL的P和H粗肽液，以相應質量濃度的GSH為對照。取1mL待測溶液，加入0.05mL濃度為2mmol/L的FeCl2，充分混勻后加入0.2mL濃度為5mmol/L的菲咯嗪試劑，混勻。室溫靜置10min，在562nm波長處測定吸光度值為A1。以去離子水代替樣品作為空白管，所測吸光度值為A0。Fe2+螯合率按式（3）進行計算。

1.2.8總抗氧化能力的測定按試劑盒說明書上方法測定總抗氧化能力。

1.2.9數據統計分析實驗重復6次，采用SPSSStatistics 17.0軟件進行統計分析，用One-Way ANOVA方法進行方差分析，采用Duncan’s multiple range test進行多重比較，顯著水平設為p＜0.05。

2　結果與分析

2.1金華火腿粗肽液肽含量

表1　兩種方法提取后金華火腿粗肽液肽含量Table 1　Peptide contents of Jinhua ham extracts from two extraction methods

表1列出了磷酸鹽法和鹽酸法提取金華火腿粗肽液肽含量的結果。由表1可知，P肽含量顯著高于H肽含量（p＜0.05）。磷酸提取法所得肽含量比Zhu［10］用鹽酸提取法所得金華火腿提取液肽含量高11倍，說明鹽酸方法提取可能對金華火腿多肽的分離不完全，磷酸鹽方法提取金華火腿粗肽優于鹽酸方法。

2.2金華火腿粗肽液清除DPPH自由基的能力

圖1　不同濃度抗氧化提取物清除DPPH自由基的能力Fig.1　The effect of different concentrations of antioxidant extracts on the DPPH radical scavenging activities

圖1列出了粗肽液P、粗肽液H和GSH對DPPH自由基清除能力的實驗結果。如圖1所示，用兩種方法提取得到的粗肽液都有清除DPPH自由基的能力，但低于GSH的清除能力（p＜0.05），且P與H清除DPPH自由基的能力差異不顯著。隨著肽濃度的增加，粗肽液清除DPPH自由基的能力顯著增加（p＜0.05）。在質量濃度為1mg/mL時，粗肽液P的清除率約為8.9%，H的清除率為11.9%，而濃度達到5mg/mL時，DPPH自由基清除率分別達到了44.2%和46.0%。金華火腿中所含肽大多為5～16個氨基酸組成，具有一定的疏水性，因此隨著濃度的增加，對DPPH自由基的親和能力逐漸增加［16］。在一定質量濃度范圍內，兩種提取方法對DPPH自由基清除能力影響差異不顯著，且都具有較高的DPPH自由基清除率。

2.3金華火腿粗肽液清除超氧陰離子自由基的能力

粗肽液P、粗肽液H和GSH對超氧陰離子自由基清除能力的實驗結果如圖2所示。超氧陰離子自由基本身并不活潑，但卻是機體產生自由基的根源，它既可以作為還原劑又可以作為氧化劑，還可以作為親核物和配體參與反應，導致機體氧化損傷［17］。由圖2所示，用兩種方法提取得到的粗肽液都有超氧陰離子清除能力，但低于GSH的清除能力（p＜0.05）。在質量濃度小于5mg/mL時，H和P的超氧陰離子清除能力差異不顯著（p＞0.05）。在質量濃度為5mg/mL時，P（74.9%）顯著低于H（80.9%），分別達到GSH（94.4%）超氧陰離子自由基清除率的79%和86%（p＜0.05）。研究表明一些側鏈有氨基或羧基的特定氨基酸（如Lys、Asp和Glu）具有清除自由基的作用，能夠增強肽的抗氧化性［18］。金華火腿中有較高含量的谷氨酸和賴氨酸［19］，因此隨著濃度的增加，其清除超氧陰離子自由基的能力逐步增加。在低質量濃度范圍內，兩種提取方式所得金華火腿粗肽液對超氧陰離子自由基清除能力差異不顯著，都有較高的清除率。

2.4金華火腿粗肽液的還原力

圖2　不同濃度抗氧化提取物清除超氧陰離子自由基的能力Fig.2　The effect of different concentrations of antioxidant extracts on the superoxide anion radical scavenging activities

圖3　不同濃度抗氧化提取物的還原力Fig.3　The effect of different concentrations of antioxidant extracts on reducing power

圖3列出了粗肽液P、粗肽液H和GSH還原力的實驗結果。由圖3所示，GSH還原力最強，極顯著高于金華火腿粗肽提取液P和H（p＜0.01）。三種抗氧化物質還原力隨著質量濃度的增大逐漸增加，并存在明顯的劑量效應關系。在質量濃度低于2mg/mL時，金華火腿提取液P還原力和H無顯著差異。當質量濃度達到3mg/mL時，金華火腿提取液P還原力顯著高于金華火腿提取液H（p＜0.05）；在4mg/mL時，P的還原力極顯著高于H（p＜0.01）；在質量濃度達到5mg/mL時，P還原力是H的1.8倍。還原力在一定程度上代表抗氧化物質提供電子的能力，還原力強的物質是優良的電子供體。一般自由基的清除是通過抗氧化物提供電子并生成穩定的物質而實現的，因此抗氧化物質提供電子能力的強弱能夠反映其抗氧化能力的強弱［20］。所以，在質量濃度較高的范圍內，P還原力比H高。

2.5金華火腿粗肽液螯合Fe2+的能力

圖4　不同濃度抗氧化提取物螯合Fe2+的能力Fig.4　The effect of different concentrations of antioxidant extracts on the Fe2+-chelating ability

粗肽液P、粗肽液H和GSH螯合Fe2+能力的實驗結果如圖4所示。有研究表明過渡金屬（Fe2+和Cu2+）是產生自由基的媒介，可以催化活性氧的產生，如羥自由基和超氧陰離子自由基［21］。抗氧化劑能影響金屬離子的催化活性，進而抑制其催化氧化的過程，因而測定其金屬離子的螯合能力是評價物質抗氧化活性的有效方法。由圖4可知，隨著質量濃度的增加，H螯合Fe2+的能力顯著增加（p＜0.05），由質量濃度為1mg/mL時的13.3%增至質量濃度5mg/mL時的33.5%。P的抗氧化能力隨著質量濃度的增加變化不顯著，并且粗肽液P表現出很強的Fe2+螯合能力，在質量濃度為1mg/mL時其螯合能力高達92.1%。在質量濃度達到2mg/mL時，P和H都極顯著高于GSH（p＜0.01）。與GSH相比，金華火腿粗肽液具有極強的金屬離子螯合能力，這可能與其中含有大量的酸性氨基酸和中性氨基酸有關，其側鏈中包含的氨基和羧基能夠與Fe2+緊密結合，從而減少Fe2+的含量，抑制了自由基的產生。這一特點對于其發揮抗氧化作用起著至關重要的作用［22］。

2.6金華火腿粗肽液的總抗氧化能力

圖5列出了粗肽液P、粗肽液H和GSH總抗氧化能力的實驗結果。物質的總抗氧化能力是其清除不同種類自由基，或是其不同活性成分清除不同自由基的總和。目前用于測定物質體外抗氧化能力的方法大多是針對某一種自由基而言，無法全面反映其總抗氧化能力［23］。由圖5可知，P總抗氧化能力高于H，但顯著低于GSH（p＜0.05），隨著質量濃度的增加，P總抗氧化能力顯著增加（p＜0.05）。在質量濃度為1mg/mL時，P（0.7U/mL）極顯著（p＜0.01）高于H（0.1U/mL），達到GSH（1.6U/mL）總抗氧化能力的48%。因此，P的總抗氧化能力比H高。

圖5　不同濃度抗氧化提取物的總抗氧化能力Fig.5　The effect of different concentrations of antioxidant extracts on T-AOC

3　結論

磷酸鹽提取的金華火腿粗肽液多肽含量顯著（p＜0.05）高于鹽酸提取的金華火腿粗肽液，其抗氧化活性隨著質量濃度的增加而增加，清除自由基能力與鹽酸提取的金華火腿粗肽液相當，而還原力，螯合Fe2+能力和總抗氧化能力顯著高于鹽酸提取的金華火腿粗肽液（p＜0.05）。鹽酸所提供的強酸性環境，會對抗氧化肽活性造成不可逆的損傷，而磷酸鹽在平衡滲透壓、維持離子強度和調節pH方面都有更好作用，這可能是磷酸鹽提取的金華火腿粗肽液的抗氧化能力優于鹽酸提取的金華火腿粗肽液的主要原因。因此，磷酸鹽提取法更適合于金華火腿中抗氧化肽的提取。

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Effect of extraction methods on the antioxidant activity of crude peptides from Jinhua ham

HU Ya-ya，XING Lu-juan，ZHOU Guang-hong，ZHANG Wan-gang*
（Key Laboratory of Meat Products Processing and Quality Control，Ministry of Education，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

Crude peptides were extracted by two solutions from Jinhua ham and evaluated for antioxidant activity by radical scavenging，metal ion chelating，reducing power and the total antioxidant capacity（T-AOC）with GSH as control.The results showed that the crude peptide extract from Jinhua ham using PBS as solution（crude peptide P）presented higher peptide content than crude peptide extract using HCl as solution（crude peptide H）.The DPPH radical scavenging capacity and the superoxide anion radical scavenging activities of crude peptide P did not differ significantly from that of crude peptide H below 5mg/mL.In addition，the crude peptide P showed higher metal ion chelating activity than crude peptide H and GSH，which presented higher reducing power than crude peptide H at 4mg/mL（p＜0.05）.Total antioxidant capacity of crude peptide P reached 48%of GSH at 1mg/mL，which was significantly higher than crude peptide H（p＜0.05）.In conclusion，crude peptide P had higher antioxidant activity than crude peptide H.

Jinhua ham；antioxidant peptide；DPPH radical scavenging ratio

TS251.1

A

1002-0306（2015）14-0115-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.014

2014－12－05

胡亞亞（1990-），男，碩士研究生，研究方向：肉品加工與質量控制。

張萬剛（1977-），男，教授，研究方向：畜產品加工與質量控制。

南京農業大學人才引進項目（804085）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD28B03）。