市售橙汁抗氧化活性物質的研究

張　華，HUHMAN David，LEI Zhen-tian，WATSON Bonnie，周　濃，*

（1.重慶三峽學院生命科學與工程學院，重慶404100；2.The Samuel Roberts Noble Foundation，Ardmore，OK 73401，USA）

市售橙汁抗氧化活性物質的研究

張華1，HUHMAN David2，LEI Zhen-tian2，WATSON Bonnie2，周濃1，*

（1.重慶三峽學院生命科學與工程學院，重慶404100；2.The Samuel Roberts Noble Foundation，Ardmore，OK 73401，USA）

利用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）法和鐵離子還原能力（Ferric reducing antioxidant power，FRAP）法、福林酚法以及超高效液相-四極桿飛行時間串聯質譜（Ultra-high performance liquid chromatography-quadruple time-of-flight-mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）法，分別對市售橙汁的抗氧化活性、總酚含量以及抗氧化活性物質種類進行了研究，以達到明確橙汁的抗氧化活性有無，以及研究其主要抗氧化活性物質種類的目的。實驗結果表明橙汁甲醇提取液具有清除DPPH自由基的能力［（1023±9.56）μg/mL，VCEAC（Vitamin cequivalent antioxidant capaciy）］和還原鐵離子能力［（804.49±7.57）μg/mL，VCEAC］，并且總酚含量豐富［（601.57±9.92）μg/mL，阿魏酸當量］。橙汁中鑒定出的主要的酚類化合物為柚皮素和橙皮苷，其中柚皮素是主要的抗氧化活性物質之一。

橙汁，抗氧化活性，UPLC-QTOF-MS，柚皮素，橙皮苷

大量的研究結果顯示，水果蔬菜的攝入有助于減少人體心腦血管疾病及腫瘤等的發生［1-3］，這主要和水果中活性物質的抗氧化活性密切相關。目前已經被報道具有抗氧化活性物質包括：酚類物質［4］、類胡蘿卜素類及維生素C（VC）［5］等活性物質。隨著保健意識的提高，人們對具有抗氧化活性果蔬或產品的關注度也越來越高。研究表明，柑橘具有良好的抗氧化活性［6］。目前對柑橘的抗氧化活性報道主要集中于鮮果，并且表明新鮮果汁具有很好的抗氧化活性［7-9］，但是對于市場銷售的橙汁產品的抗氧化活性能力以及抗氧化活性物質的研究甚少。市售橙汁作為日常大眾消費產品，被人們理所當然的認為具有抗氧化活性［8］，在一定程度上缺乏科學研究。為此，本文主要針對市售橙汁提取液的抗氧化活性能力進行測定，并且測定其總酚含量，同時利用UPLC-QTOF-MS技術鑒定其主要的生物活性物質，以及分析這些物質與抗氧化活性可能存在的相關關系，旨在為市售橙汁抗氧化活性相關研究提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

市售橙汁（非濃縮型無果粒，品牌：Simply Orange，xx廠家）購買于沃爾瑪超市，避光保存于4℃冰箱；甲醇（HPLC級）、乙腈（HPLC級）、超純水（HPLC級）美國Honeywell公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、抗壞血酸（維生素C，VC，質量分數＞99.0%）、福林酚試劑、7-羥基香豆素（質量分數＞98.0%，CAS號93-35-6）、阿魏酸（質量分數＞99.0%，CAS號1135-24-6）、蜜三糖（質量分數＞98.0%，CAS號512-69-6）美國Sigma-Aldrich公司。

Thermo Scientific Sorvall?Legend RT型臺式低溫離心機美國Thermo Fisher Scientific公司；UV2401PC型紫外-可見分光光度計日本島津公司；WatersACQUITYUPLC-MICRASS?Q-Tof PREMIERTM飛行時間質譜儀配有ESI電離源接口和Lock-spray接口，英國Waters公司；Milli-Q超純水系統雙蒸水制備儀美國密理博公司。

1.2實驗方法

1.2.1對照品溶液的制備

1.2.1.1阿魏酸標準溶液的配制首先配制濃度為1.00mg/mL的阿魏酸甲醇貯備液，再用甲醇依次稀釋成濃度為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60和0.80mg/mL的標準溶液。阿魏酸標準溶液用于橙汁中總酚含量的測定實驗。現配現用。

1.2.1.2VC標準溶液的配制配制濃度為1.00mg/mL的VC水溶液貯備液，再依次用水稀釋成濃度為0、0.02、0.06、0.20、0.40、0.60和0.80mg/L的系列標準溶液。VC標準溶液現配現用。VC標準溶液主要用于測定橙汁抗氧化活性的當量計算。

1.2.2供試品溶液的制備

1.2.2.1甲醇提取溶液的制備取市售橙汁1mL加入8mL的甲醇，在4℃條件下，以3100r/min離心30min。取3mL上清液為實驗樣品，每個樣品4個重復。

1.2.2.2UPLC-QTOF-MS樣品溶液的制備取500μL的甲醇提取液，加入到1.5mL樣品瓶，再加入500μL 80%甲醇（7-羥基香豆素為內標化合物，濃度為0.036mg/mL），振蕩30s，超聲30s，在搖床上緩慢提取2h。最后4℃條件下，3100r/min離心30min，取50μL已經過濾膜的上清液用于UPLC-QTOF-MS分析檢測［10］。

1.2.3DPPH法測定抗氧化活性參照Gyamfi等的測試方法［11］。準確吸取50μL甲醇提取液，加入450μL Tris-HCl緩沖溶液（50mmol/L，pH7.4），再加入1.0mL 0.1mmol/L DPPH甲醇溶液，搖勻，室溫下避光靜置30min。測定517nm處樣品吸光值，吸光值越低，表明樣品抗自由基能力越強。VC水溶液為標樣作標準曲線，得到吸光度（Y）與VC含量（X）之間的回歸方程。樣品清除DPPH·自由基抗氧化能力用VCEAC（Vitamin C equivalent antioxidant capacity）來表示，單位采用μg/mL。每個樣品重復4次。

式中，Ai為加空白甲醇的DPPH·吸光度；Aj為加樣品反應后的DPPH·吸光度。

1.2.4FRAP法測定抗氧化活性參照Benzie等［12］的方法。取100μL的甲醇提取液，加入3mL已經預先混合的FRAP反應試劑（醋酸緩沖液濃度為0.1mol/L，pH3.6），TPTZ（溶于40mmol/L鹽酸）濃度為10mmol/L，三氯化鐵溶液濃度為20mmol/L。以上三種溶液混合，體積比依次為10∶1∶1。）。振蕩30s，超聲30s，反應10min，搖勻，在593nm下測定吸光度。VC水溶液為標樣作標準曲線，得到吸光度（Y）與VC含量（X）之間的回歸方程。樣品還原三價鐵離子抗氧化能力用VCEAC（Vitamin C equivalent antioxidant capacity）來表示，單位采用μg/mL。每個樣品重復4次。

1.2.5總酚含量的測定參照Slinkard K等［13］的方法。取500μL的甲醇提取液加入6.0mL的蒸餾水中，加入1.0mL福林酚試劑。1min后，加入2mL 15%碳酸鈉溶液，加蒸餾水定容至10mL。充分混勻，在室溫下，避光放置2h，在760nm下測吸光度。以阿魏酸甲醇溶液做標準曲線，得到吸光度（Y）與阿魏酸含量（X）之間的回歸方程，樣品的總酚含量換算為每毫升樣品中的含量（μg/mL）。每個樣品4個重復。

1.2.6酚類物質鑒定

1.2.6.1色譜條件參照Brechenmacher等［10］實驗方法采用Waters超高效液相色譜（UPLC）。色譜柱：UPLC BEH C18柱（2.1mm×150mm，1.7μm）（Waters Acquity）；流動相：A相為0.1%醋酸水溶液，B相為乙腈，進行梯度洗脫（0～30min，5%～70%B；30～33min，70%～95%B；33～36.1min，95%B；36.1～39min，95%A），流速為0.56mL/min，柱溫為60℃，自動進樣器溫度為4℃，進樣體積為5μL。

1.2.6.2質譜條件UPLC-MS接口為電噴霧離子化源（ESI），負離子模式；毛細管壓：2.9kV；錐孔電壓：48.0V；提取錐電壓：5.0V；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣體溫度：350℃；錐孔氣體流速：50L/h；脫溶劑氣體流量：850L/h；碰撞氣：氮氣；質量掃描范圍50～2000m/z，掃描時間：0.460s；質量鎖定（Lock Mass）參照溶液為蜜三糖（Raffinose，［M-H］-503.1612）；質量鎖定（Lock Mass）參照溶液為蜜三糖（Raffinose，［M-H］-503.1612）；蜜三糖濃度為50fmol/mL，流速0.2mL/h。

1.2.7數據的統計與分析UPLC-QTOF-MS數據通過AMDIS軟件，MET-IDEA軟件，LC/MSD Trap 5.2軟件，以及結合實驗室自建生物活性物質數據庫對色譜質譜數據進行分析。通過Origin 7.5軟件進行作圖分析。Microsoft Excel軟件及SPSS軟件對實驗數據進行分析。

2　結果與分析

2.1市售橙汁提取物抗氧化活性和總酚含量的測定

依據DDPH法測定VC標準溶液清除自由基能力，所得標準曲線方程為Y=0.2346X+0.6724（R2=0.9958）。依據FRAP法測定VC標準溶液還原鐵離子能力，所得標準曲線方程為Y=1.332X-0.0095（R2=0.9902）。依據福林酚法測定阿魏酸標準溶液的總酚含量，所得阿魏酸標準曲線方程為Y=0.3656X-0.237（R2=0.9946）。樣品的抗氧化活性和總酚含量測定后，經過相應的換算，結果見表1：橙汁甲醇提取液的DPPH自由基清除能力測定結果為（1023±9.56）μg/mL（VCEAC）；FRAP法測定橙汁甲醇提取液的還原能力測定結果為（804.49±7.57）μg/mL（VCEAC）。市售橙汁提取物中測得總酚含量為（601.57±9.92）μg/mL（阿魏酸當量），這與朱玉昌等的研究結果較為一致［14］。可見市售橙汁具有抗氧化活性，并含有豐富的酚類物質。

表1　市售橙汁抗氧化活性及總酚含量Table 1　Antioxidant capacities and the total phenolic content in commercial orange juice

2.2UPLC-QTOF-MS法分析市售橙汁提取物抗氧化活性物質

利用UPLC-QTOF-MS技術對橙汁甲醇提取物進行酚類物質分析，從圖1中可以看出，橙汁中至少10個峰相對含量較高（圖1和表2）。和實驗室數據庫信息比對，最終鑒定出的化合物包括：7-羥基香豆素（2號峰，內標化合物）（圖1和圖2）、柚皮素（5號峰）（圖1和圖3）和橙皮苷（6號峰）（圖1和圖4）。其中橙皮苷結合有糖基，橙皮苷的質核比301.1［M-H］-和609.2［MH］-，分別是苷元離子和準分子離子峰（見圖1和表2）。

圖1　橙汁甲醇提取物總離子流圖Fig.1　Totalion chromatogram in extract of commercial orange juice

圖2　2號峰質譜圖Fig.2　Mass spectrogram of peak 2

表2　UPLC-QTOF-MS鑒定市售橙汁提取物中生物活性物質Table 2　Identification compounds in commercial orange juice by UPLC-QTOF-MS

圖3　5號峰質譜圖Fig.3　Mass spectrogram of peak 5

圖4　6號峰質譜圖Fig.4　Mass spectrogram of peak 6

同時利用AMDIS軟件，MET-IDEA軟件以及標準化合物數據庫信息，以內標法（7-羥基香豆素為內標化合物）對鑒定出的化合物進行含量計算［15］。具體數據分析過程，參見文獻［16-17］。橙汁甲醇提取液中10種化合物含量見表2，其中柚皮素和橙皮苷含量分別為（135.92±4.04）μg/100mL和（339.37±3.72）μg/100mL。此外4號、8號和9號峰的含量也較高，但是未能鑒定出，需進一步分離后確定物質種類。

2.3市售橙汁提取物抗氧化活性與總酚含量及活性物質的相關性

由表3可知，市售橙汁DPPH法抗氧化活性測定值與總酚含量相關性為0.814；市售橙汁FRAP法抗氧化活性測定值與總酚含量相關性為0.449。可見，橙汁抗氧化活性與總酚含量密切相關。

統計學中，相關系數r值在1～0.8之間表示極相關，在0.8～0.6之間表示較相關，在0.6～0.4之間表示弱相關，小于0.4表示不相關。據此，抗氧化活性與活性物質相關性分析結果表明，2號峰（7-羥基香豆素）、6號峰（橙皮苷）、7號峰（未知）、8號峰（未知）、9號峰（未知）均與抗氧化活性測定值呈現負相關或不相關（-0.731＜r＜0.355）。但是4號峰（未知）、5號峰（柚皮素）與兩種抗氧化活性測定值均呈現正相關性（0.729＜r＜0.960，p＜0.05），3號峰（未知）與DPPH抗氧化活性測定值呈現正相關（r=0.707），但是與鐵離子還原法測定值不相關（r=0.265）。3號峰物質也可能是主要的抗氧化活性物質之一。可見柚皮素是主要的抗氧化活性物質之一，橙皮苷并非是橙汁中主要的抗氧化活性物質。這與侯留鑫等［18］的研究結果相一致。橙皮苷的抗氧化活性較低，可能與其酚羥基的糖基化相關［19］。

表3　抗氧化活性與總酚及酚類物質相關性（r）Table 3　The correlations between antioxidant capacity and total phenolic content/individual compound content（r）

3　結論

市場銷售橙汁作為大眾消費飲品，研究其營養價值具有重要的現實意義。本研究通過對橙汁的DPPH自由基清除能力和鐵離子還原能力測定，總酚含量分析以及化學物質鑒定等工作，表明市售橙汁具有較強的抗氧化活性，酚類物質含量豐富，柚皮素是其主要的抗氧化活性物質之一。本研究與其他研究不同之處在于實驗對象為大眾消費產品市售橙汁，并在理論層面上揭示其抗氧化活性及抗氧化活性物質種類。但是，市售橙汁中仍然有抗氧化活性物質未被鑒定出來，需要加大其研究力度，從而更好地服務今后的橙汁產品在抗氧化活性方面的開發和應用。

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Identification of antioxidant compounds in commercial orange juice

ZHANG Hua1，HUHMAN David2，LEI Zhen-tian2，WATSON Bonnie2，ZHOU Nong1，*
（1.College of Life Science&Engineering，Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404100，China；2.The Samuel Roberts Noble Foundation，Ardmore，OK 73401，USA）

DPPH（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazylradical）method，FRAP（Ferricreducingantioxidantpower）method，Folin-Ciocalteu assay and Ultra-high performance liquid chromatography-quadruple time-of-flight mass spectrometry（UPLC-QTOF-MS）were applied in this paper to analyze the antioxidant capacity of commercial orange juice and the antioxidants inside.The results showed that the commercial orange juice could scavenge the DPPH free radical［（1023±9.56）μg/mL，VCEAC（Vitamin cequivalent antioxidant capaciy）］，and reduce iron ion［（804.49±7.57）μg/mL，VCEAC］.The phenolic content was rich［（601.57±9.92）μg/mL，Ferulic acid equivalent］.The compounds identified included narigenin and hesperidin.And the narigenin was one of the main antioxidants.

commercial orange juice；antioxidation；UPLC-QTOF-MS；narigenin；hesperidin

TS201.4

A

1002-0306（2015）14-0139-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.020

2014－11－18

張華（1982-），女，博士，講師，研究方向：植物化學物質鑒定及抗氧化活性分析。

周濃（1978-），男，碩士，副教授，研究方向：藥用植物栽培與質量控制。

國家自然科學基金項目（81260622）；重慶三峽學院引進高層次人員科研啟動項目（14RC05）。