微波預處理葵花籽粕蛋白制備抗氧化多肽的研究

董　　聰，李　　芳，王　　琳，馬曉蘭，徐　　佳，孔令明，*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052；2.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學院，新疆烏魯木齊830021）

微波預處理葵花籽粕蛋白制備抗氧化多肽的研究

董聰1，李芳2，王琳1，馬曉蘭1，徐佳1，孔令明1，*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052；2.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學院，新疆烏魯木齊830021）

采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶對葵花籽粕蛋白進行酶解，并利用微波對其進行預處理。以多肽產(chǎn)物抗氧化性為指標，通過單因素及響應面法對預處理條件進行優(yōu)化，獲取最佳預處理條件。結(jié)果表明，最佳微波預處理條件為微波時間3min、微波功率500W、微波溫度57℃。在此條件下，葵花籽粕多肽對超氧陰離子自由基（O2-·）和羥基自由基（·OH）清除能力分別為72.78%和54.13%。

葵花籽粕蛋白，微波預處理，多肽，抗氧化活性

向日葵，對環(huán)境適應性強、抗旱、抗?jié)场⒖箟A［1］，而新疆的氣候較適宜向日葵的生長，據(jù)報道新疆每年向日葵的種植面積在10萬畝左右，年產(chǎn)葵花籽25.39萬噸［2］。葵花籽粕是葵花籽制油后的副產(chǎn)物，葵花籽粕營養(yǎng)物質(zhì)豐富，如含有大量氨基酸組成均衡［3］的優(yōu)質(zhì)植物蛋白［4］、鈣、磷、煙酸［5］、類脂、碳水化合物、還原糖、灰分［6］及天然食用紅色素、糠醛等［7］。

葵花籽粕蛋白經(jīng)酶解可制成多肽，生物活性肽已被證實具有降血壓、抑菌、降膽固醇、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、促進微量元素及營養(yǎng)素的吸收等作用［8］。微波預提取技術(shù)是微波和傳統(tǒng)的溶劑萃取法相結(jié)合形成的一種新的萃取方法，具有提取率高和提取時間較短等特點，在食品及天然產(chǎn)物提取等領(lǐng)域均有廣泛的應用［9］。微波的預處理還可使蛋白質(zhì)高度壓縮、緊密的結(jié)構(gòu)斷開，長鏈打開，有利于酶解反應的進行。同時微波預處理過程所使用的汽化介質(zhì)比水容易揮發(fā)以及汽化溫度較低，使得微波預處理過程的工藝條件變得溫和，對熱敏有效成分的破壞減少［10］。

本研究采用微波技術(shù)對葵花籽粕蛋白進行預處理，然后對其進行酶解制備抗氧化活性多肽。其研究成果不僅可以提高葵花籽粕利用率，還將為葵花籽綜合利用及開發(fā)功能性食品提供科學數(shù)據(jù)和參考，從而促進新疆經(jīng)濟發(fā)展。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

葵花籽粕蛋白新疆農(nóng)業(yè)大學食藥學院實驗室自制；堿性蛋白酶（酶活力為13.59萬U/g）及木瓜蛋白酶（酶活力10.04萬U/g） 購于南寧龐博生物工程有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、鄰菲羅啉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、過氧化氫30%、鄰苯三酚等均為分析純。

WF-4000型微波快速反應系統(tǒng)上海屹堯分析儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；PHS-3C型雷磁上海儀電科學儀器股份有限公司；AL204-1C型電子天平上海梅特勒托利多儀器有限公司；TD5A-WS型臺式低速離心機長沙湘儀離心機儀器有限公司；TU-1810型紫外分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2實驗方法

1.2.1微波預處理及葵花籽粕蛋白酶解工藝流程

葵花籽粕蛋白→懸浮液（w∶v=1∶50）→微波預處理（調(diào)節(jié)溫度、功率、時間）→調(diào)pH7.6→水浴酶解200min→滅酶（100℃、15min）→離心（4500r/min、10min）→取上清液→測定抗氧化能力。

1.2.2抗氧化能力的測定·OH清除能力的測定采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法［11］；O2-·清除能力的測定采用鄰苯三酚自氧化法［6］。

（2）保障教學科研服務質(zhì)量風險。與經(jīng)營公司管理方明確相關(guān)房間和租賃會議室業(yè)主價或團購價，業(yè)主方（學校）提前一定時期將計劃告知經(jīng)營管理方，經(jīng)營管理方做好相應準備，并可視為對學校投入的回報之一。

1.2.3單因素實驗以堿性蛋白酶及木瓜蛋白酶為酶制劑，在酶解底物5g、時間200min、pH7.6、復合酶（堿性蛋白酶∶木瓜蛋白酶）比例2.5∶1、［E］/［S］2%、底物濃度2%、溫度50℃的酶解條件下，以·OH和O2-·自由基清除率為指標，確定微波預處理的功率［12］、溫度［12］、時間［13］條件。

1.2.3.1微波預處理功率對抗氧化能力的影響在微波預處理時間3min、溫度55℃、功率分別為200、300、400、500、600、700W的條件下，使葵花籽粕蛋白經(jīng)酶解后測定其對·OH和O2-·自由基的清除能力。

1.2.3.2微波預處理溫度對抗氧化能力的影響在微波預處理時間3min、功率500W、溫度分別為35、45、55、65、75、85℃的條件下，再使葵花籽粕蛋白經(jīng)酶解后，測定其對·OH和O2-·自由基的清除能力。

1.2.3.3微波預處理時間對抗氧化能力的影響在微波預處理功率500W、溫度55℃、時間分別為1、2、3、4、5min的條件下，再使葵花籽粕蛋白經(jīng)酶解后，測定其對·OH和O2-·自由基的清除能力。

1.2.4響應面優(yōu)化實驗在微波功率（X1）、微波時間（X2）、微波溫度（X3）單因素實驗的基礎上，以O2-·和·OH自由基清除率為指標，以微波功率、微波時間、微波溫度為實驗因素，進行三因素三水平響應面實驗，對微波輔助復合酶解工藝進行預處理條件優(yōu)化。因素水平表如表1所示。

表1 實驗因素水平表Table 1　Factors and levels of experiment table

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進行處理及分析。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1微波預處理功率對葵花籽粕多肽抗氧化能力的影響在1.2.3.1的處理條件下，葵花籽粕多肽抗氧化能力結(jié)果如圖1所示。由圖1可知微波功率在0～500W范圍內(nèi)時，抗氧化能力隨微波功率的增加而增大；在微波功率為500W時，O2-·和·OH自由基清除能力均達到最大值，分別為69.62%和46.09%；微波功率大于500W后，抗氧化能力并沒有隨功率的增加而增大，可能是因為功率較大致使蛋白質(zhì)變性，故確定適宜微波功率為500W。

圖1　微波功率對抗氧化能力的影響Fig.1　Microwave power effects the anti-oxidation

2.1.2微波預處理溫度對葵花籽粕多肽抗氧化能力的影響在1.2.3.2的處理條件下，葵花籽粕多肽抗氧化能力結(jié)果如圖2所示。

圖2　微波溫度對抗氧化能力的影響Fig.2　Microwave temperature effects the snti-oxidation

由圖2可知微波溫度在35～55℃范圍內(nèi)時，抗氧化能力隨微波溫度的增加而增大；在微波溫度為55℃時，O2-·和·OH自由基清除能力均達到最大值，分別為66.76%和53.48%；微波溫度高于55℃后，抗氧化能力隨微波溫度的增加而呈現(xiàn)下降趨勢，說明微波預處理溫度不一定和水浴酶解的溫度一致，故確定微波溫度為55℃。

2.1.3微波預處理時間對葵花籽粕多肽抗氧化能力的影響在1.2.3.3的處理條件下，葵花籽粕多肽抗氧化能力結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知微波時間在1～3min范圍內(nèi)時，抗氧化能力隨微波時間的增加而逐漸增大；在微波時間達到3min時，O2-·和·OH自由基清除能力均達到最大值，分別為67.62%和41.33%；微波時間大于3min后，抗氧化能力隨微波時間的增加而逐漸下降，可能是由于經(jīng)過微波的預處理使葵花籽粕蛋白質(zhì)高度壓縮、緊密的結(jié)構(gòu)斷開，長鏈打開，故抗氧化能力在較短時間內(nèi)呈現(xiàn)升高的趨勢，由此確定微波預處理時間為3min。

圖3　微波時間對抗氧化能力的影響Fig.3　Microwave time effects the anti-oxidation

2.2響應面實驗結(jié)果與分析

根據(jù)上述單因素實驗結(jié)果，利用Design Expert 8.0軟件進行響應面優(yōu)化實驗，實驗設計和結(jié)果見表2。

表2　根據(jù)Design-erpert 8.0設計響應面實驗方案及結(jié)果Table 2　The test scheme and results according to design-erpery 8.0 design response surface

利用Design-Expert8.0對結(jié)果進行回歸分析，以微波時間、微波功率、微波溫度為響應變量，以O2-·自由基清除率（Y1）和·OH自由基清除率（Y2）為響應值的回歸方程為：

Y1（%）=70.77++4.61X1+3.93X2-2.35X3+1.23X1X2+ 0.51X1X3+4.39X2X3-8.12X12-5.21X22-3.47X32

Y2（%）=54.64-2.03X1+1.25X2+3.54X3-0.062X1X2+ 4.12X1X3-1.29X2X3-3.79X12-5.59X22-5.92X32

以微波功率、時間、溫度為響應變量，以O2-·自由基清除率為響應值對表2進行方差分析，模型顯著性及數(shù)據(jù)結(jié)果見表3。

表3　O2-·模型方差分析及模型系數(shù)顯著性檢驗Table 3　Model significant inspection and regression model analysis of variance on the scavenging capacity of O2-·

由表3回歸方差分析可知，模型R2=0.9650說明回歸方程有意義，F(xiàn)模型=21.4438（p＜0.001），模型極顯著，失擬項F=3.7814（p＞0.05）結(jié)果不顯著，說明實驗結(jié)果誤差較小，擬合度較好，能較好的描述實驗結(jié)果。由表3可知，時間和溫度對O2-·自由基清除率影響極顯著（p＜0.001）；微波功率對O2-·自由基清除率的影響作用顯著（p＜0.05）；X2X3差異高度顯著（p＜0.01），說明溫度和功率之間存在交互作用；X1X2和X1X3差異不顯著，說明時間和溫度、時間和功率之間無交互作用；X12、X22、X32差異均顯著，說明各因素之間的關(guān)系是較為復雜的二次關(guān)系。由F值大小可知，各因素對O2-·自由基清除率影響大小順序為：時間＞溫度＞功率。

以微波功率、時間、溫度為響應變量，以·OH自由基清除率為響應值對表2進行方差分析，模型顯著性及數(shù)據(jù)結(jié)果見表4。

由表4回歸方差分析可知，模型R2=0.9628說明回歸方程有意義，F(xiàn)模型=1853.55（p＜0.001），模型極顯著，失擬項F=0.2678（p＞0.05）結(jié)果不顯著，說明實驗結(jié)果誤差較小，擬合度較好，能較好的反應實驗結(jié)果。由表4可知，功率對·OH清除率影響極顯著（p＜0.001），時間對·OH清除率影響顯著（p＜0.05），微波溫度對·OH清除率影響不顯著；X1X3差異高度顯著，說明時間和功率之間存在交互作用；X1X2和X2X3差異不顯著，說明時間和溫度、溫度和功率之間無交互作用；X12、X22、X32差異均顯著，說明各因素之間的關(guān)系是較為復雜的二次關(guān)系。由F值大小可知，各因素對·OH清除率影響大小順序為：功率＞時間＞溫度。圖4、圖5直觀地反映了個因素之間的交互作用及其對抗氧化性的影響。

表4　·OH清除率模型方差分析及模型系數(shù)顯著性檢驗Table 4　Model significant inspection and regression model analysis of variance on the scaveaging capacity of·OH

由圖4可知，時間一定的情況下，當溫度一定時，功率達560W前，O2-·清除率隨功率的增大而增大；而功率達560W后，繼續(xù)增大功率，O2-·清除率反而降低。每一個固定功率下，溫度的變化使O2-·清除率呈先升高后降低的趨勢。圖4［13］顯示，隨著溫度和功率的增大，O2-·清除率呈先升高后降低的趨勢，且升高較為迅速，說明溫度和功率之間的交互作用比較顯著。圖4中等高線均呈橢圓形表示二因素交互作用顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖4　溫度和功率對O2-·清除率影響的響應面圖Fig.4　Response surface of temperature and power on the scavenging capacity of O2-·

由圖5可知，溫度一定時，時間達2.6min前，·OH清除率隨時間的延長而增大；而時間達2.6min后，繼續(xù)延長時間，·OH清除率反而降低；每一個固定時間下，功率的變化使·OH清除率呈先升高后降低的趨勢；隨著時間和功率的增大，·OH清除率緩慢增大，時間和功率之間的交互作用較為明顯。等高線呈橢圓表明時間和功率之間的交互作用顯著。

通過軟件分析結(jié)果得出，以O2-·自由基清除率為指標，得到葵花籽粕多肽的最佳提取條件：微波時間3.31min、微波功率499W、微波溫度58.8℃；在此條件下，葵花籽粕多肽的超氧陰離子自由基的清除率為72.33%。以·OH清除率為指標，得到葵花籽粕多肽的最佳提取條件為：微波時間2.86min、微波功率524W、微波溫度55.09℃；在此條件下，葵花籽粕多肽對·OH清除率為55.26%。綜合考慮兩種自由基的清除率，取最佳條件為：微波時間3.01min、微波功率522W、微波溫度56.6℃。考慮到實際操作性，將實際實驗條件調(diào)整為：微波時間3min、微波功率500W、微波溫度57℃，平行實驗后得到O2-·和·OH的清除率分別為72.78%和54.13%，與模型理論預測值無顯著差異，表明響應面分析法對微波預處理葵花籽粕蛋白制備抗氧化活性多肽工藝的優(yōu)化條件切實可行。與前期工作中未加微波預處理的葵花籽粕蛋白酶解液對O2-·和·OH的清除率（分別為58.06%和46.72%）相比較，分別提高了25.35%和28.51%。

圖5　時間和功率對·OH清除率影響的響應面圖Fig.5　Response surface of time and power on the scavenging capacity of·OH

3　結(jié)論

對葵花籽粕蛋白進行微波預處理后酶解，得到葵花籽粕抗氧化活性多肽。測定葵花籽粕多肽對O2-·和·OH的清除率，確定其最佳預處理條件。在單因素實驗的基礎上，通過響應曲面法獲得最優(yōu)預處理條件為：微波時間3min、微波功率500W、微波溫度57℃。在此條件下，葵花籽粕多肽對O2-·和·OH的清除率分別為72.78%和54.13%。在與未加微波預處理的葵花籽粕蛋白酶解液的抗氧化能力相比有一定的提高，也說明微波預處理對輔助酶解有一定的促進的作用。

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Microwave pretreatment of sunflower meal protein preparation of antioxidant peptides

DONG Cong1，LI Fang2，WANG Lin1，MA Xiao-lan1，XU Jia1，KONG Ling-ming1，*
（1.College of Food and Pharmaceutics，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China；2.Xinjiang Institute of Light Industry Technology，Urumqi 830021，China）

In this paper，sunflower meal protein powder was used as raw material，before using alkaline protease and papain enzymatic hydrolysis，used microwave pretreated it.Antioxidant activity was investigated to optimum pretreatment process through single factor and response surface method.The results showed that the optimal pretreatment conditions were as followed：microwave time 3min，microwave power 500W，microwave temperature of 57℃.Under this condition，the scavenging of sunflower meal peptides on O2-·and OH-·were 72.78%and 54.13%.

sunflower meal protein；microwave pretreatment；peptides；antioxidant activity

TS201.1

B

1002-0306（2015）14-0308-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.054

2014－10－20

董聰（1990-），女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

孔令明（1976-），男，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及綜合利用。

自治區(qū)科技支疆項目（2013911070）。