EGCG-CS-PAA納米粒制備及其穩定性實驗研究

侯紹云，洪志勇，應　浩，侯善欣，黃美蓉，杜琪珍（浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江杭州310000）

EGCG-CS-PAA納米粒制備及其穩定性實驗研究

侯紹云，洪志勇，應浩，侯善欣，黃美蓉，杜琪珍*
（浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江杭州310000）

為保護EGCG的抗氧化活性，利用殼聚糖（CS）和聚天冬氨酸（PAA）之間離子交聯作用制備CS-PAA納米粒載體，裝載表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）。結果表明：CS/PAA質量比、溶液pH、攪拌時間以及鹽濃度對納米體系的粒徑、Zeta電位、包埋率等具有顯著影響。在CS/PAA（w/w）為1.0、pH為3.5、反應時間為60 min時，制備的EGCG-CS-PAA納米粒在粒徑和表面電荷等物理特征為最佳。采用FRAP法對EGCG-CS-PAA納米粒的抗氧化活性進行分析，結果顯示納米體系對EGCG活性具有良好的保護作用。同時EGCG-CS-PAA納米體系能在高溫、堿性等環境下起到較好的保護EGCG的作用。

EGCG，殼聚糖，納米粒，抗氧化活性

EGCG是一種酯型兒茶素，是茶多酚中活性最強的一種兒茶素單體［1］。近年的研究表明，EGCG具有抗氧化、抗癌、預防心血管疾病、降低血糖血脂、提高機體免疫力等多種生理功能［2-5］。然而EGCG性質很不穩定，易受光、氧、溫度、pH等外界因素的影響而發生變化［6-7］。其次EGCG在腸胃滯留時間短、滲透性差、容易受胃腸環境（如pH、酶等）的影響而變得不穩定，從而使EGCG口服的生物利用度大大降低［8］。因此，EGCG在食品、醫藥保健等方面的實際應用具有較大的局限性。

納米微膠囊，其顆粒微小，易于分散和懸浮在水中，形成均一穩定的膠體溶液，并且具有良好的靶向性和緩釋作用［9］。通過將功能因子包裹于納米粒子內部，能夠提高功能因子的穩定性，促使其活性的最大發揮。近年來，采用納米微膠囊技術包埋兒茶素以及茶多酚已經有很多報道［10-12］。殼聚糖擁有較好的生物相容性、生物可降解性和粘膜粘附作用等特性［13］，常被用來作為制備納米載體材料。同時，聚天冬氨基酸（PAA）具有無毒和生物降解性，也是理想的載體材料［14］。因此，本文研究通過殼聚糖（CS）和聚天冬氨酸（PAA）之間離子交聯作用制備CS-PAA納米粒載體，以此裝載EGCG，并且研究了EGCG-CS-PAA納米分散體系對EGCG抗氧化活性的保護作用。研究結果對于EGCG在食品、醫藥保健等領域的實際應用具有參考價值。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

EGCG（98%）無錫太陽綠寶科技有限公司；PAA（分子量30～50 ku） 張家港星宇科技有限公司；CS（分子量3～10 ku）浙江澳興生物科技有限公司；其他化學試劑均為分析純，華東醫藥股份有限公司；實驗用水均為超純水。

5810R型離心機美國Eppendorf公司；Zetasizer Nano-ZS激光粒度儀英國Malvern；UV3600紫外-可見分光光度計、LC-20A高效液相色譜儀日本島津公司；JEM-1230透射電鏡日本JEOL；JB-3漩渦儀

上海雷磁新涇儀器有限公司；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋上海精宏實驗設備有限公司；Millipore Amicon Ultra-15超濾離心管上海俊晟生物科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1CS-PAA納米分散體系和EGCG-CS-PAA納米分散體系的制備參照Deh-Wei Tang等［15］制備殼聚糖納米粒的方法。稱取一定質量的CS溶解在1%乙酸溶液中，將10 mL CS溶液緩慢滴加到10 mL濃度為2 mg/mL PAA水溶液中，邊滴邊攪拌，以每秒一滴速度滴加，攪拌速度800 r/min，滴加完畢繼續攪拌60 min，得到CS-PAA納米分散體系。

本研究考察下述4個制備因素對CS-PAA納米粒的影響：（1）攪拌時間（5、10、20、30、40、60、90 min），其他條件為CS/PAA（w/w）為1.0；（2）溶液的pH（pH= 2.0、2.5、3.5、4.5、5.0、6.0、7.0），其他條件為CS/PAA（w/w）為1.0，攪拌時間60 min；（3）CS與PAA的質量比（0.75、1.0、1.5、2.0、2.5），其他條件為攪拌時間60 min，pH為3.5；（4）NaCl的濃度（0、10、20、30、40、50 mg/mL），其他條件為CS/PAA（w/w）為1.0，攪拌時間60 min，pH為3.5。

選用CS-PAA納米粒優化的制備參數，稱取一定質量的CS和EGCG（濃度為1、2、3、4、5 mg/mL）溶解在1%醋酸溶液中，移取10 mL含有EGCG的CS溶液緩慢滴加到10 mL濃度為2 mg/mL PAA水溶液中，邊滴邊攪拌，以每秒一滴速度滴加，攪拌速度800 r/min，滴加完畢繼續攪拌60 min，得到EGCG-CS-PAA納米分散體系。

1.2.2粒徑及Zeta電位的測定CS-PAA納米粒和EGCG-CS-PAA納米粒的平均粒徑（Dh）和粒徑的分散情況（PDI）采用英國Malvern公司的Nano-ZS型激光粒度儀，散射角為90°，測試溫度（25±0.1）℃，掃描波長633 nm。

1.2.3包埋率的測定取2 mL EGCG納米粒溶液于超濾濃縮離心管，4℃條件下4000×g離心30 min，收集離心后的液體，通過HPLC對超濾離心管中游離的EGCG進行定量測定。HPLC的檢測條件：流動相A相為0.2%的乙酸；流動相B相為100%乙腈；梯度洗脫條件：0～16 min，6.5%～25%；16～30 min，25%～6.5%；30～35 min，6.5%；色譜柱Symmetry?C18（5 μm，4.6 mm× 250 mm），柱溫40℃，檢測波長280 nm，進樣量10 μL。配制0.5～2.5 mg/mL共5個濃度梯度EGCG標準溶液，得標準曲線Y=8×10-7X-0.0024（R2=0.9999），其中X為峰面積，Y為EGCG濃度（mg/mL）。

1.2.4EGCG-CS-PAA納米粒的微觀結構采用透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM）觀察EGCG-CS-PAA納米粒（1 mg/mL）的表面形態及大小。將EGCG-CS-PAA納米溶液樣品滴在銅網表面，磷鎢酸染色后，用濾紙擦凈多余的樣品溶液，在空氣中風干后進行電鏡觀察。測試加速電壓為80 kV。

1.2.5FRAP測定EGCG-CS-PAA納米粒的抗氧化活性采用FRAP法測定抗氧化活性［16］，取0.1 mL待測溶液加入到2.9 mL TPTZ工作液（25 mL pH=3.6的300 mmol/L醋酸鹽緩沖液、2.5 m 10 mmol/L TPTZ溶液、2.5 mL 20 mmol/L FeCl3溶液，現用現配）混勻后于37℃水浴孵育30 min，于593 nm處測定其吸光值，以PBS緩沖液與TPTZ工作液混合作為空白對照。EGCG自由液與EGCG納米液在室溫下存放，每隔24 h取樣測定。

1.2.6高溫下EGCG-CS-PAA納米粒對EGCG的保護作用取50 mL EGCG納米液（1 mg/mL）置于80℃的恒溫條件下孵育，在不同時間段取樣（2、4、6、8、10、12、14、20、44、68、92 h），采用HPLC分析納米體系中EGCG的含量，計算EGCG的保留率。以相同濃度的EGCG溶液為對照。

1.2.7堿性條件下（pH7.2）EGCG-CS-PAA納米體系對EGCG的保護作用取一定量的EGCG-CS-PAA納米粒，加入到15 mL的pH 7.2的磷酸緩沖液中，于37℃的恒溫條件下孵育，在1、2、3、4 h時間點，用HPLC分析EGCG納米液中EGCG的含量，計算EGCG的保留率。用磷酸緩沖液配制相同濃度的EGCG溶液作為對照。

1.2.8統計分析采用統計軟件SAS V8進行統計分析。兩組樣品間的差異顯著性分析采用Student’s t檢驗，組間多重比較采用LSD檢驗，p＜0.05表示差異顯著性。每組實驗重復3次。

2　結果與分析

2.1CS/PAA質量比對CS-PAA納米粒的影響

表1　不同CS/PAA質量比制備的CS-PAA納米粒的平均粒徑、分散系數、Zeta電位（mean±SD，n=3）Table 1　The diameter，polydispersity index and Zeta potential of the nanoparticles（CS-PAA NP）prepared with various ratio of chitosan/polyaspartic acid（mean±SD，n=3）

CS/PAA質量比對CS-PAA納米粒粒徑Dh，PDI及Zeta電位的影響如表1所示。Zeta電位是反應納米體系穩定性的一個重要指標，Zeta電位絕對值越高，小顆粒間斥力越大，不易聚集，從而更有利于穩定性。通常認為，穩定體系納米粒Zeta電位的絕對值應大于30 mV［17］。隨著CS/PAA質量比的增加，納米粒的粒徑、Zeta電位以及分散指數逐漸增大。Zeta隨著殼聚糖用量的增加，纏繞在納米粒表面的CS越來越多，納米粒表面電荷增多，Zeta電位逐漸增加，從而形成親水性保護膜。在CS/PAA質量比為1.0時，Zeta電位已經顯示出較穩定（31.8 mV）。所以本研究選用CS/PAA質量比為1作為后續研究。

2.2pH對CS-PAA納米粒的影響

pH對CS-PAA納米粒粒徑Dh，PDI及Zeta電位的影響如表2所示，納米粒粒徑隨著pH的不斷增大，粒徑先減小后增大，在pH＞5溶液出現渾濁。在pH=3.5時，粒徑最小，Zeta電位的絕對值最大，納米體系比較穩定。

表2　不同pH所制備的CS-PAA納米粒粒徑，PDI及Zeta電位Table 2　Effect of solution pH values on mean particle size and zeta-potential of CS-PAA nanoparticles

2.3攪拌時間對CS-PAA納米粒的影響

攪拌時間對CS-PAA納米粒粒徑Dh，PDI及Zeta電位的影響如表3所示，不同的攪拌時間，平均粒徑具有顯著性差別，60 min效果最佳。體系反應60 min后，納米粒交聯達到充分飽和，繼續反應納米顆粒之間容易聚集，納米粒粒徑增大，后續研究選用攪拌時間為60 min。

表3　不同攪拌時間制備的納米粒粒徑，PDI和Zeta電位Table 3　Effect of reaction time on the mean size，PDI and Zeta-potential of nanoparticles

2.4NaCl的濃度對CS-PAA納米粒的影響

NaCl的濃度對CS-PAA納米粒粒徑Dh，PDI及Zeta電位的影響如表4所示，隨著體系NaCl濃度的增加，納米粒子的平均粒徑逐漸增大，且分散指數不斷增大，粒子的分散呈不均勻狀態，粒子表面電荷也逐漸減小。當NaCl濃度達到50 mg/mL時，體系出現明顯的沉淀。后續研究選用NaCl的濃度為0。

2.5EGCG-CS-PAA納米體系的表征

選用上述制備CS-PAA納米的最佳條件（CS/PAA質量比1.0，pH為3.5，NaCl的濃度為0，攪拌時間60 min）制備EGCG-CS-PAA納米粒。EGCG-CS-PAA納米粒的平均粒徑Dh、PDI、Zeta電位、包封率EE如表5所示，隨著EGCG濃度的增加，粒徑有所增加，電位下降，包封率下降。相比于CS-PGA（聚谷氨酸）包埋，CS、PAA所制備的納米粒具有更高的包封率［18］。

表5　EGCG-CS-PAA納米粒的粒徑Dh、PDI、Zeta電位、包封率EETable 5　The average diameter，polydispersity index and Zeta potential of the EGCG loaded nanoparticles（EGCG-CS-PAA NP）prepared with chitosanand polyaspartic acid

2.6EGCG-CS-PAA納米粒的微觀形態觀察

通過透射電子顯微電鏡（TEM）觀察納米粒微觀結構如圖1所示，圖1-A顯示納米粒經透射電鏡在0.2 μm觀察范圍內，納米粒子呈均勻的球形，分布均勻，無明顯的聚集。圖1-B顯示，所測的納米粒徑在90 nm左右，由于TEM測量過程中需要干燥，測量的粒徑比動態光散射測得水合粒徑小［19］。

圖1EGCG-CS-PAA納米粒透射電鏡觀察的微觀結構Fig.1　TEM micrographs of EGCG-CS-PAA nanoparticles：A×50K，B×150K

2.7FRAP法對EGCG-CS-PAA納米粒抗氧化活性分析

通過FRAR法對EGCG-CS-PAA納米粒抗氧化活性分析如圖2所示，隨著時間的延續，EGCG-CS-PAA納米粒抗氧化活性大于自由EGCG，說明納米粒對EGCG具有較好的保護作用。

圖2FRAP法測EGCG納米粒的抗氧化活性Fig.2　Antioxidant activities of EGCG nanoparticles by FRAP

2.8EGCG-CS-PAA納米粒在高溫條件對EGCG的保護作用

EGCG-CS-PAA納米粒在高溫條件下對ECGG的保護作用如圖3所示，納米粒組中EGCG含量下降的趨勢明顯緩于自由EGCG，在高溫92 h過后，EGCG納米體系中EGCG保留率依然45.7%，遠高于EGCG自由液的含量。這表明所制備的EGCG-CS-PAA納米體系能在高溫條件下對EGCG的穩定性具有較好的保護作用。

圖3　80℃下EGCGG納米粒中EGCG的保留率Fig.3　The EGCG remaining in EGCG nanoparticles at high temperature

2.9EGCG-CS-PAA納米粒在堿性條件（pH7.2）對EGCG穩定性的保護作用

EGCG-CS-PAA納米粒在高溫條件下對ECGG的保護作用如圖4所示，EGCG在堿性環境下迅速分解，經過2 h EGCG保留率迅速下降為11.6%，再經過2 h EGCG幾乎分解完全。EGCG-CS-PAA納米粒在前1 h EGCG保留率下降較快56%，可能因為EGCG納米粒表面吸附的游離EGCG迅速被分解，隨后下降趨勢平緩，經過4 h后其EGCG保留率還有33.1%。說明EGCG-CS-PAA納米粒對EGCG在堿性環境下的穩定性具有較好的保護作用。

圖4　EGCG納米粒在pH7.2堿性環境下對EGCG的保護作用Fig.4　The EGCG remaining of EGCG nanoparticles at alcaline environment，pH7.2

3　結論

利用CS和PAA之間離子交聯作用制備CS-PAA納米粒載體，以此裝載EGCG。CS/PAA質量比、pH、攪拌時間及離子濃度對納米粒的粒徑、Zeta電位、載藥率都有顯著的影響。在CS/PAA質量比為1.0、pH為3.5、反應時間為60 min時，制備出的EGCG-CS-PAA納米粒在粒徑和表面電荷等物理特征為最佳。FRAP法對EGCG-CS-PAA納米粒的抗氧化活性分析表明：納米體系對EGCG的抗氧化活性具有良好的保護作用。EGCG-CS-PAA納米體系能在高溫、堿性等環境下起到較好的保護EGCG的作用，對EGCG在食品、醫藥保健等領域的實際應用具有重要意義。

［1］Carloni P，Tiano L，Padella L，et al.Antioxidant activity of white，green and black tea obtained from the same tea cultivar［J］. Food Research International，2013，53（2）：900-908.

［2］Sang S，Cheng X，Stark R E，et al.Chemical studies on antioxidant mechanism of tea catechins：analysis of radical reaction products of catechin and epicatechin with 2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl［J］.Bioorg Med Chem，2002，10（7）：2233-2237.

［3］Shimizu M，Shirakami Y，Sakai H，et al.Epigallocatechin gallate inhibits growth and activation of the VEGF/VEGFR axis in human colorectal cancer cells［J］.Chemico-Biological Interactions，2010，185（3）：247-252.

［4］Raederstorff D G，Schlachter M F，Elste V，et al.Effect of EGCG on lipid absorption and plasma lipid levels in rats［J］.The Journal of Nutritional Biochemistry，2003，14（6）：326-332.

［5］Hwang H S，Feng W，Yang T，et al.Effect of（-）-epigallocatechinGallate（EGCG），agreenteaextract，on excitation-contraction coupling of murine cardiomyocytes［J］. Biophysical Journal，2009，96（S3）：121a.

［6］Zimeri J，Tong CH.DegradationKineticsof（-）-Epigallocatechin Gallate as a Function of pH and Dissolved Oxygen in a Liquid Model System［J］.Journal of Food Science，1999，64（5）：753-758.

［7］Sang S，Lee M，Hou Z，et al.Stability of tea polyphenol（-）-epigallocatechin-3-gallate and formation of dimers and epimers under common experimental conditions［J］.Journal of agricultural and food chemistry，2005，53（24）：9478-9484.

［8］Shpigelman A，Israeli G，Livney Y D.Thermally-induced protein-polyphenol co-assemblies：beta lactoglobulin-based nanocomplexes as protective nanovehicles for EGCG［J］.Food Hydrocolloids，2010，24（8）：735-743.

［9］吳克剛，李向華.食品微膠囊技術［M］.北京：中國輕工業出版，2006：71-72.

［10］Chen YC，Yu S H，Tsai GJ，et al.Novel technology for the preparation of self-assembled catechin/gelatin nanoparticles and theircharacterization［J］.JournalofAgriculturalandFood Chemistry，2010，58：6728-6734.

［11］梁進.納米茶多酚的制備及其抗腫瘤作用研究［M］.南京：南京農業大學，2011.

［12］Dube A.，Nicolazzo JA，Larson I.Chitosan nanoparticles enhance the intestinal absorption of the green tea catechins（+）-catechin and（-）-epigallocatechin gallate［J］.European Journal of Pharmaceutical Sciences，2010，41：219-225.

［13］Kang M L，Cho C S，Yoo H S.Application of chitosan microspheres for nasal delivery of vaccines［J］.Biotechnology Advances，2009，27（6）：857-865.

［14］Cheng Y，Qu H，Ma M，et al.Polyamidoamine（PAMAM）dendrimers as biocompatible carriers of quinolone antimicrobials：An in vitro study［J］.European Journal of Medicinal Chemistry，2007，42（7）：1032-1038.

［15］Shu S，Zhang X，Teng D，et al.Polyelectrolyte nanoparticles based on water-soluble chitosan-poly（l-aspartic acid）-polyethylene glycol for controlled protein release［J］.Carbohydrate Research，2009，344（10）：1197-1204.

［16］Gong J，Liu J.Antioxidant capacity of extract from edible flowers of Prunus mume in China and its active components［J］. LWT-Food Sci Technol，2009，42（2）：477-482.

［17］Müller R H，Jacobs C，Kayser O.Nanosuspensions as particulate drug formulations in therapy rationale for development and what we could expect for the future［J］.Ad Drug Delier Re，2001，47（1）：3-19.

［18］Shu S，Zhang X，Teng D，et al.Polyelectrolyte nanoparticles based on water-soluble chitosan-poly（l-aspartic acid）-polyethylene glycol for controlled protein release［J］.Carbohydrate Research，2009，344（10）：1197-1204.

［19］Zhu S，Li Y，Li Z，et al.Lipase-catalyzed synthesis of acetylated EGCG and antioxidant properties of the acetylated derivatives［J］.Food Research International，2014，56：279-286.

Preservation of EGCG antioxidant properties by loading CS-PAA nanoparticles

HOU Shao-yun，HONG Zhi-yong，YING Hao，HOU Shan-xin，HUANG Mei-rong，DU Qi-zhen*
（Institute of Food and Biological Engineering，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310000，China）

（-）-Epigallocatechin-3-gallate（EGCG）was loaded in chitosan nanoparticles for the preservation of antioxidant activity.The effects of the weight ratio of CS to PAA，pH，the reaction time and the concentration of NaCl on the properties of EGCG-CS-PAA complexes were studied.All four factors significantly influenced the particle size，the Zeta potential，and the entrapment efficiency of EGCG.A stable and clear solution system could be obtained at pH3.5.The best EGCG-CS-PAA nanoparticles was obtained with the reaction time at 1 hour and the weight ratio of 1∶1（CS∶PAA）．Sustained free radical（ABTS＋·）scavenging assays showed that the antioxidant activity of EGCG was retained by the nanoparticles.Meanwhile，EGCG nanoparticles were found to be a better protection of EGCG at high temperature and alkaline.

EGCG；chitosan；nanoparticles；antioxidant activity

TS201.1

A

1002-0306（2015）24-0115-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.24.016

2015－04－09

侯紹云（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品化學與功能因子，E-mail：15700070466@163.com。

杜琪珍（1963-），男，教授，研究方向，食品化學與功能因子，E-mail：qizhendu@163.com。

十二五國家科技計劃項目（2012BAD36B06）。