正交試驗優(yōu)選通竅活血膠囊水提工藝

雷曉翠　安紅偉　頓玲露　趙世亮　徐榛　王少洲

【摘要】目的：優(yōu)選通竅活血膠囊的最佳提取工藝。方法：以芍藥苷含量和干膏率為評價指標，利用正交試驗考察加水量、提取時間、提取次數(shù)對通竅活血膠囊提取工藝的影響，采用HPLC法測定芍藥苷的含量。結(jié)果：最佳提取工藝為加12倍量水提取3次，每次30min；芍藥苷含量為21.10mg/g，干膏率為23.42%。結(jié)論：優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行，為通竅活血膠囊的合理開發(fā)提供參考。

【關(guān)鍵詞】通竅活血膠囊；正交試驗；芍藥苷

【中圖分類號】R284.2【文獻標志碼】A【文章編號】1007-8517（2015）20-0006-03

OptimizationofExtractionTechnologyforTongqiaohuoxueCapsulebyOrthogonalTest

LeiXiaocui1AnHongwei1*DunLinglu1ZhaoShiliang2XuZhen2WangShaozhou2

1.LiuzhoutraditionalChineseMedicalHospital，GuangxiLiuzhou545001，China；

2.GuangxiUniversityofChineseMedicine，GuangxiNanning530001，China

Abstract：ObjectiveTooptimizetheextractiontechnologyforTongqiaohuoxueCapsule.MethodTheextractionconditionswereoptimizedbyorthogonaltest，withthesolventvolume，extractiontimeandextractiontimesastheinfluencingfactors，thecontentofthePaeoniflorinandtheyieldofdryextractwereusedastheevaluationindexes.ThecontentofpaeoniflorinwasdetectedbyHPLCmethod.ResultTheoptimalextractionconditionswere：refluxingextractionfor3timesand30mineachtimewith12foldamountofwater.Thecontentofthepaeoniflorinwas21.10mg/gandtheyieldofdryextractwas23.42%.ConclusionTheextractiontechnologyisreasonable，reliable，andprovidesafoundationforthefurtherproductionandqualitycontrolofTongqiaohuoxueCapsule.

Keywords：TongqiaohuoxueCapsule；Orthogonaltest；paeoniflorin

通竅活血膠囊是由赤芍、川芎、桃仁、紅花、紅棗、鮮姜、老蔥、麝香等多味中藥組成的制劑，具有活血化瘀，通竅活絡的作用。藥理研究發(fā)現(xiàn)，通竅活血膠囊可以改善腦組織的病理學損傷、保護腦組織抗氧化酶的活性、減輕氧自由基對腦組織的損傷[1]，并減輕微循環(huán)障礙[2]。為了合理制定通竅活血頰囊的提取工藝，研究根據(jù)處方中藥物有效成分的理化性質(zhì)和藥理作用，結(jié)合中醫(yī)臨床用藥的特點，采用正交試驗法對通竅活血膠囊的提取工藝進行研究，現(xiàn)報告如下。

1儀器與試藥

1.1儀器LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）；UV-1800紫外可見分光光度計（上海美析儀器有限公司）；MS204-S電子天平（梅特勒-托利多）；VP-1400H型真空泵（東莞市普立真空設備有限公司）；DHG-9140A型電熱鼓風干燥箱（上海越眾儀器設備有限公司）；YZ-180DB型超聲波清洗儀（上海越眾儀器設備有限公司）；S.HH.W21.600S型數(shù)顯式三用電熱恒溫水浴箱（上海躍進醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2試劑與試藥芍藥苷對照品（批號：110736-201438，中國藥品生物制品檢定所）；赤芍芍等飲片購于國藥控股廣西中藥飲片有限公司。乙腈（批號：141175，美國Fisher）、甲醇（批號：140400，美國Fisher）為色譜純；水為蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1正交試驗設計本方臨床以湯劑形式應用，且方中藥材主要有效成分多為皂苷和多糖類成分，均有較好的水溶性，所以本實驗采用水煎煮法提取。以處方中赤芍所含的有效成分芍藥苷的含量及干膏得率為評價指標，并按以上兩指標的權(quán)重系數(shù)分別為80%和20%進行綜合加權(quán)評分[3]。采用L9（34）正交試驗對加水量（A）、提取時間（B）、提取次數(shù)（C）進行優(yōu)選。因素水平見表1。

表1正交試驗因素水平表

2.2干膏得率測定精密吸取正交試驗濃縮液10ml，置于已恒重的干燥蒸發(fā)皿中水浴蒸干后，置于105℃烘箱中干燥至恒重，迅速置于干燥器放冷，稱重，計算得膏率。

2.3芍藥苷含量測定

2.3.1色譜條件DiamonsilC18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸（14：86）[4]；流速：1ml/min；檢測波長：230nm；柱溫：30℃；進樣量：l0μl。理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計算應不低于3000，分離度應不低于1.5[5]。

2.3.2對照品溶液的制備精密稱取在芍藥苷對照品3.10mg，置10ml容量瓶中，加適量甲醇溶解，再加甲醇至刻度制成濃度為0.31mg/ml的對照品溶液，搖勻，備用。

2.3.3供試品溶液的制備按處方量精密稱取處方中各味中藥（麝香、黃酒除外），按照正交試驗設計的因素參數(shù)進行試驗，提取，過濾，合并濾液，濃縮至1∶1，精密吸取濃縮液1ml置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，加適量甲醇溶解過濾至25ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，備用。

2.3.4陰性對照液的制備制備缺白芍藥材的提取液，按“2.3.3”項下供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2.3.5線性關(guān)系考察分別取“2.3.2”項下對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2ml置于10ml溶量瓶中，加甲醇至刻度。精密吸取上述各對照品溶液10μl，按上述色譜條件注入液相色譜儀進行測定。以峰面積為縱坐標（Y），進樣量（μg）為橫坐標（X），繪制標準曲線，得回歸方程：Y=36472X-91686（R2=0.9948，n=6）。表明芍藥苷在6.20～37.1μg范圍呈良好線性關(guān)系。

2.3.6陰性樣品干擾考察精密吸取陰性對照溶液10μl注入液相色譜儀，發(fā)現(xiàn)在與芍藥苷對照品出峰的相應位置上，陰性供試品無相應色譜峰出現(xiàn)，說明樣品中的其他成分不干擾芍藥苷的測定。圖譜見圖1。

2.3.7含量測定分別精密吸取“2.3.2”項下的對照品溶液與“2.3.3”項下的供試品溶液各10μl注入高效液相色譜儀，測定芍藥苷的含量。對照品、供試品及陰性對照圖譜見圖1。

2.4正交試驗結(jié)果按L9（34）正交試驗表進行試驗，結(jié)果見表2、表3。

表2水提工藝正交試驗結(jié)果

注：綜合評分=（得膏率/最大得膏率）×100×0.2+（芍藥苷含量/最大芍藥苷含量）×100×0.8

表3方差分析結(jié)果

由表2、表3可知：影響提取效果的因素大小順序為：C>A>B，即提取次數(shù)>加水量>提取時間，加水量（A）和提取次數(shù)（C）有顯著影響，且C3>C2>C1，A3>A2>A1，B2>B3>B1。由于提取時間對結(jié)果沒有顯著性影響，故選擇提取時間為30min，最佳工藝為A3B1C3，即加12倍量水提取3次每次30min。

2.5驗證試驗為進一步驗證優(yōu)選工藝的可靠性，分別取3份按處方比例混合的藥材，按照優(yōu)選的最佳條件進行試驗，結(jié)果表明，優(yōu)選的提取工藝切實可行。見表4。

表4水提工藝驗證試驗結(jié)果

3討論

3.1指標參數(shù)的確定通竅活血膠囊含有多味中藥，成分較為復雜，故選擇干膏率作為考察指標之一。芍藥苷為方中赤芍的主要活性物質(zhì)之一，是一種潛在的神經(jīng)保護藥。研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷能通過減少腦組織自由基的產(chǎn)生、抑制脂質(zhì)過氧化反應、抑制內(nèi)源性神經(jīng)肽內(nèi)皮素的產(chǎn)生，從而對沙土鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用[6]；通過提高機體消除自由基能力和增加Nrf2表達來減輕局灶性腦缺血再灌注損傷后自由基引起的氧化損傷作用，從而對缺血性腦組織起到腦保護作用[7]，故選擇芍藥苷作為另一考察指標。

3.2評分方法試驗設定了芍藥苷含量和干膏率兩個考察指標，故采用綜合加權(quán)評分法，可以兼顧各項指標，以各試驗綜合得分評價試驗結(jié)果，可化多指標為單指標進行分析，簡單方便。

3.3指標權(quán)重系數(shù)的確定多指標成分綜合評價優(yōu)選中藥提取工藝，應該結(jié)合各指標成分對試驗結(jié)果的影響來確定指標成分在綜合加權(quán)評分法中的權(quán)重系數(shù)。根據(jù)試驗的目的，處方中指標性成分芍藥苷的含量對提工藝的影響更重要，故評分時設定干膏率和芍藥苷含量的權(quán)重分別占綜合評分的20%和80%，以優(yōu)選出更具科學性和合理性的提取工藝[8]。

3.4HPLC流動相的確定實驗在選擇流動相時，參照《中國藥典》赤芍項下的芍藥苷含量測定方法，經(jīng)過數(shù)次的試驗，其中包括改變流動相組成：分別嘗試以甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液，甲醇-0.05%磷酸，甲醇-0.1%磷酸，乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進行洗脫；改變流動相比例：對乙腈-0.1%磷酸溶液的比例18：82、17：83、16：84、15：85、14：86、13：87進行比較，結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸溶液（14：86）為最佳洗脫條件，此時的峰形較好，分離度大于0.5，理論塔板數(shù)大于3000。所以實驗選取乙腈-0.1%磷酸溶液（14：86）為流動相。

3.5提取工藝的確定通過對干膏率和芍藥苷含量綜合加權(quán)評分的分析，確定其最佳提取工藝為以12倍量水提取3次，每次30min。并以此工藝進行3批驗證試驗，兩項指標重復性好（RSD%<2%），表明優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行、提取簡便、易于操作，符合生產(chǎn)的要求。參考文獻

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（收稿日期：2015.07.06）